表达GFP的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌体内感染抗原呈递细胞的动态变化

文章编号:1007-8738(2003)05-425-03表达G FP 的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌体内感染抗原呈递细胞的动态变化王　芳1,焦新安1,顾　健2,马　莉2,Richard Lo 2Man 3,Claude Leclerc 3,刘秀梵1(1扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室;2苏北人民医院血液科,江苏扬州225009;3法国巴斯德研究所,法国巴黎75724)收稿日期:2002-09-02;　修回日期:2002-10-30基金项目:教育部高校骨干教师资助计划项目(N o.20001734)中法先进研究计划合作项目(N o.PRAB 01204)作者简介:王　芳(19722),女,新疆伊犁人,博士.T el.(0514)7979343,Email :rwang fang @通讯作者:焦新安.In vivo dynamic changes of antigen pre 2senting cells infected with recombinant attenuated Salmonella typhimurium ex 2pressing green fluorescent proteinWANG Fang 1,JIAO Xin 2an 1,G U Jian 2,MA Li 2,Richard Lo 2Man 3,Claude Leclerc 3,LIU Xiu 2f an11K ey Laboratory of Animal In fectious Disease of Ministry of Agricul 2ture ,Y angzhou University ,2Department of Hematology of Subei People’s H ospital ,Y angzhou 225009,China ;3Institut Pasteur Paris 75724,FranceAbstractAIM :T o clarify in vivo dynamic change s of antigen 2pre senting cells (APCs )early infected with recombinant attenuatedSalmonella typhimurium.METH ODS :BA LB/c mice were orally infected with recombinant attenuated Salmonella typhimurium expre ssing green fluore scent protein (GFP )X 4550(p Y AGFP ).Peritoneal macrophage s were taken out 3days after infection and cultured for 24hours ,then observed under the fluore scent micro scope.Moreover ,BA LB/c mice were also infected intra 2venously with X 4550(p Y AGFP )and low density cells (LDCs )were isolated and prepared from mouse spleen and liver 3,6and 12hours after infection.Infection rate s of macrophage s and dendritic cells (DCs )were analyzed by flow cytometry.RE 2SU LTS :About 50%peritoneal macrophage s were X 4550(p Y AGFP )po sitive.Infection rate s of macrophage s in spleen and liver were 20%～40%or so.As for the DCs ,the infection rate s in spleen and liver were about 4%～10%and 10%～20%,re spectively.CONC L USION :Recombinant attenuated Salmonella can be captured by APCs in vivo in early infection ,which provide s a precondition for inducing effective immune re 2sponse s.K eyw ords :recombinant attenuated Salmonella typhimurium ;green fluore scent protein ;antigen 2pre senting cell ;dynamic change s摘要目的:阐明重组减毒鼠伤寒沙门氏菌在体内早期感染抗原呈递细胞(APC )的动态变化规律。

方法:用一定剂量的表达绿色荧光蛋白(G FP )的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X 4550(p Y AG FP )口服接种BA LB/c 小鼠。

3d 后,取腹腔巨噬细胞培养24h ,用荧光显微镜观察。

另以该细菌静脉注射小鼠,于感染后3、6和12h ,制备脾脏、肝脏低浮密度细胞。

用流式细胞术检测巨噬细胞和树突状细胞的感染率。

结果:巨噬细胞感染X 4550(p Y AG FP )的百分率,腹腔中约为50%,肝脏和脾脏中约为20%～40%。

树突状细胞感染X 4550(p Y AG FP )的百分率,脾脏中约为4%～10%,肝脏中约为10%～20%。

巨噬细胞的吞噬能力明显高于树突状细胞。

结论:感染早期,重组减毒鼠伤寒沙门氏菌在体内已被APC 所摄取,为诱导有效的免疫应答提供了先决条件。

关键词:重组减毒鼠伤寒沙门氏菌;绿色荧光蛋白;抗原呈递细胞;动态变化中图分类号:R730.51 文献标识码:A 鼠伤寒沙门氏菌是一种具有侵袭力的肠道杆菌,可通过消化道小肠黏膜派伊尔结(Peyer ’s patch ,PP )上的M 细胞及树突状细胞(dendritic cell ,DC )进入机体,然后被巨噬细胞等吞噬细胞吞噬并在其内繁殖。

巨噬细胞和DC 是专职抗原呈递细胞(APC ),通过它们在体内的迁移,细菌可进入许多脏器组织,如小肠PP 结、肠系膜淋巴结、脾脏及肝脏等,同时能激发机体免疫系统产生针对细菌的各种免疫应答。

减毒鼠伤寒沙门氏菌虽然对动物和人体的毒力降低了许多,但仍具有侵袭力。

该菌不仅能在体外感染巨噬细胞和DC ,而且在体内也能感染巨噬细胞和DC 等细胞,并由这些APC 呈递抗原于T 细胞而产生细胞免疫应答。

鉴于目前关于减毒沙门氏菌在体内感染APC 的动态变化报道较少,我们报道了用表达绿色荧光蛋白(G FP )的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X 4550(p Y AG FP )口服和静脉注射BA LB/c 小鼠后,感染APC 的实验结果。

1　材料和方法1.1　材料　表达G FP 的减毒鼠伤寒沙门氏菌X 4550(p Y AG FP )由本室构建[1]。

6～8wk 龄雌性BA LB/c (H 22d )小鼠,购自中科院上海实验动物中心。

RP MI1640培养基购自S igma 公司。

犊牛血清购自郑州佰安生物工程有限公司。

Ⅳ型胶原酶、豚鼠补体、牛血清白蛋白(BS A )、抗Thy1.2(T 细胞)单抗(mAb )及超亲和素标记的藻红蛋白(Phycoerythrin ,PE ),购自S igma 公司。

生物素标记的抗Mac Ⅰ(M Ф)和抗C D11c (DC )mAb ,由法国巴斯德研究所惠赠。

1.2　方法1.2.1　体内腹腔巨噬细胞感染试验　①细菌培养:将X 4550(p Y AG FP )先于液体LB 中以200r/min 振摇培养过夜,加入灭菌5m ol/L NaCl 溶液,使培养基中NaCl 的终浓度为300mm ol/L [2]。

然后于37℃静置培养4～5h 后,用平板计数法计数[3]。

②动物接种及结果观察:口服X 4550(p Y AG FP )菌前,对BA LB/c 小鼠禁食、禁水过夜,然后先口服100g/L NaH 2C O 3100μL ,30min 后口服细菌(2.6×1010CFU/只)[4]。

于口服3d 后,采集腹腔巨噬细胞,用RP MI1640完全培养基培养24h后,于荧光显微镜下观察,选取多个视野,对视野中所有细胞和含细菌的细胞计数,计算感染率(含细菌的细胞数/细胞总数),取平均值并拍照。

1.2.2　肝、脾低浮密度细胞(LDC )的制备　按焦新安等[5]报道的方法进行。

1.2.3　巨噬细胞和DC 感染率的检测　采用流式细胞术。

以一定体积的含100m L/L 小牛血清的RP MI1640培养基悬浮细胞沉积,使细胞密度约为1010/L ;冰浴保存备用。

用FACS 染色缓冲液稀释下列各种抗体或标记试剂,包括生物素化的mAb ,抗Mac ⅠmAb (1∶125)、抗C D11c mAb (1∶50)及PE 标记的亲和素(后者用于生物素化单抗的第二步染色)。

将肝、脾LDC 分别加于96孔板中,每孔1×106～2×106个细胞,以1300r/min 离心10min 。

弃上清,以FACS 洗涤缓冲液洗涤1次,分别加入50μL 稀释的抗Mac Ⅰ和抗C D11c mAb ,冰浴作用45min ,用FACS 洗涤缓冲液洗涤3次(1300r/min ,10min )。

加入PE 标记的亲和素50μL ,混匀,冰浴作用45min ,同法洗涤3次。

以P BS 悬浮细胞,移至FACS 分析专用小试管内,600μL/管,用FACS Calibur 分析、测试上述细胞样品,用CellQuest 软件处理数据,各细胞的感染率为含重组菌的染色阳性细胞对所有染色阳性细胞的百分比。

2　结果2.1　体内腹腔巨噬细胞感染试验　口服X 4550(p Y AG FP )3d后,经荧光显微镜观察,约50%以上腹腔巨噬细胞感染了该菌(图1)。

图1　口服重组菌后3d 腹腔巨噬细胞感染的荧光显微镜观察Fig 1　The observation of peritoneal macrophages on day 3post 2in fec 2tion under fluorescence microscopy (×400)2.2　肝、脾巨噬细胞和DC 中感染重组菌的感染率　静注后3、6和12h ,肝脏中MΦ和DC 的感染率均呈升高趋势,其中M Φ的感染率分别为13.3%、24.6%和27.1%;DC 的感染率分别为6.9%、11.9%和16.1%。