诱导表达 分离纯化实验步骤
维真生物-原核蛋白的表达、分离和纯化
原核蛋白的表达、分离和纯化
实验原理：
携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG 诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。实验材料：
大肠杆菌BL21
试剂、试剂盒：
LB液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠
仪器、耗材：
摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒
实验步骤：
一、试剂准备
1. LB液体培养基：Trytone 10 g，yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。
2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。
3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM
2-ME，pH8.0。
4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。
5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea，500 mM Imidazole，pH8.0。
6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
蛋白质纯化方法
含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化
一.用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因
所需特殊试剂：1M IPTG
1.将目的基因与IPTG诱导表达载体连接，构成重组质粒并转化相应的
表达用的大肠杆菌。将转化体铺于含相应抗生素的LB平板，37℃培
养过夜。通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。
2.分别挑取对照菌和重组菌1个菌落，接种于1ml含有相应抗生素的LB
培养液中，37℃通气培养过夜。
3.取100微升过夜培养物接种于5ml含有相应抗生素的LB培养液中（各
10份），适当的温度（20－37℃）震荡培养4小时，至对数中期（A550
＝0.1-1.0）。
4.对照菌和重组菌各取1ml未经诱导的培养物于离心管中，剩余培养物
中加入IPTG至终浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，
5.0mM相同的温度继续通气培养。
5.在诱导的1，2，3，4，5个小时取1ml样品于Ep管中。
细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量，诱
导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。生长过度或过速会加
重细菌合成系统的负担，导致包涵体的形成。生长温度可能是影响大
肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。低温培养能在一定程度上抑
制包涵体的形成。IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。所以通过
试验确定最佳的培养条件是很必要的。
6.将所有样本室温最高速度离心1分钟，弃上清，沉淀重悬于100微升
1×SDS蛋白上样缓冲液中，100℃加热5分钟，室温最高速度离心1
分钟，取15微升样品上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶，用SDS－PAGE
蛋白表达纯化流程
第一章蛋白表达纯化
一、诱导表达分析
1) 把测序正确的表达质粒转化到合适的表达宿主菌中并涂布在相应抗性的LB 平板上培养过夜;
2) 分别挑两个单克隆于3ml含抗生素的LB培养基中培养过夜;
3) 按1%接种过夜培养的菌液于4ml含抗生素LB培养基中37度培养2-3小时;
4) 加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达3个小时左右，取样做蛋白电泳分析目标蛋白的表达情况。
二、蛋白纯化
2.1重组蛋白的提取
2.1.1 提取缓冲液
20 mM Tris-HCl (pH8.0) 或者其他推荐使用的缓冲体系。如需溶解难溶蛋白或者包涵体还可加入8 M urea 或 6 M guanidine hydrochloride 。
Note: 处理(His)6融合蛋白时可以加入5–50 mM imidazole 以减少上柱时的非特异性吸附。
2.1.2 方法
1)发酵液离心收集菌体(at 7 000–8 000 g for 10 minutes or 1 000–1 500 g for 30
minutes at +4 °C)。
2)弃去上清液，加入适当的20 mM Tris-HCl (pH8.0)，重悬；
3)离心收集菌体同上，弃去上清液，将装有菌体的离心管置于冰中。
4)每ml菌体加入50ul冰冷的提取缓冲液重悬菌体。
5)冰浴中超声裂解菌体(超声2秒，停止6秒)，之后取样进行SDS-PAGE电泳分
析。
Note:超声破菌应尽量使用最短的时间，长时间的进行可能会破坏蛋白功能。还应避免产生泡沫，因为这样会使蛋白变性和导致宿主蛋白与融合蛋白协同纯化。
dsRNA的诱导表达和提取
1. dsRNA的诱导表达取构建好的重组质粒转化大肠杆菌HT115 (DE3)，筛选含有重组质粒的转化子。将筛选得到的转化子接种于LB 培养基(含相应抗生素)于37℃振荡培养16 h后，取适量培养物重新接种于新鲜LB 培养基中(含相应抗生素，接种量1∶100) ，37℃振荡培养生长至OD595 = 0. 5，加IPTG(终浓度为0. 8 mmo l /L )进行诱导表达，37℃振荡培养4 h后分为两份，一份用于dsRNA的提取，检测dsRNA的表达量；一份用于烟草CMV的保护或治疗试验。2. dsRNA的提取采用CTAB法提取: 取2 mL细菌5 000 r /min离心1 min，沉淀细菌,加500μL TE缓冲液重新悬浮; 加30 μL 10% SDS, 混匀，37℃, 1 h; 加100μL NaC l ( 5 mol /L ) ，混匀，再加入80 μL的CTAB /NaCl，混匀，65℃，10 min; 加等体积酚/氯仿/异戊醇( 25 ∶24 ∶1 )混合液，混匀，4℃，12 000r /min离心4～5 min;取上清用0. 8倍体积的异丙醇沉淀, 4℃, 12000 r /min离心10min; 弃上清,用75%乙醇洗涤(加500 μL 75%乙醇, 用旋涡器混合, 6000 r/min, 4℃, 离心5min ) ; 干燥后溶于ddH2O,电泳检测; 分别用DNase (DNase 1 U ) 、RNase A 消化(RNase 1 U,加NaCl至0. 5 mol /L )后电泳检测结果。
蛋白质纯化实验流程
蛋白质纯化实验流程
下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!
并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!
Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!
In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!
实验 蛋白质的诱导表达
融合标签:
1. 保护目的蛋白使之不被降解 2. 用于检测和纯化目的蛋白 3. 增加目的蛋白在细胞质中的可溶性 4. 帮助将目的蛋白运转到细胞周质中以提 高其生物活性
常用表达载体
• pJLA50X系列; pcDNAII; etc • pET系列 (T7 promoter, Novagen公司) • pQE系列 (T5 promoter, Qiagen公司) • pMAL系列 (周质表达, BioLabs公司) • pGEX系列 (GST融合表达, Pharmacia公司) • pBAD系列 (Arabinose诱导型) •pTYB系列 (CBD融合, 可以自我切割, BioLabs)
1. 2. 3.
影响转录水平的因素：强启动子，强终 止子 等。 影响翻译水平的因素：SD序列， mRNA稳定性等。 影响蛋白质水平的因素：异源蛋白，易 降解
优化表达
增加蛋白质溶解性及折叠:
温度: 37 C 蛋白质以聚集的形式表达--包涵体 30 C 可溶的有活性的蛋白 细胞周质定位: 有利于蛋白折叠及二硫键的形成
诱导原核表达的原理
ห้องสมุดไป่ตู้ 结构基因：编码-半 乳糖苷酶（Z）、透性 酶（Y）和硫半乳糖苷 乙酰转移酶（A）的基 因。 操纵 子 ： 包 括 启 动 子 、 操纵基因和结构基因 调节基因、阻遏蛋白 乳糖+阻遏蛋白，改变 阻遏蛋白的形状
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤（待改进）
1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA.
4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、
Bl21 codon（DE3）等。
7、蛋白的诱导表达。
1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3）将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0.22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%，使用时自己计算用量。
4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速（140-180rpm），诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2.
保种可以取一部分分成50μl一管，每次用一管，避免反复冻融。
8、包涵体检测。方案见附件2
9、如有上清表达，则扩大摇菌。
实验七 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
• 原核表达：
将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋 白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位 及功能分析等方面都有应用。
• 大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：
易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系 统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具 各种特性的质粒可供选择。
大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化
1 细菌的裂解： 常用方法有：① 高温珠磨法；② 高压匀浆；③ 超声破碎法； ④ 酶溶法；⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方 法① 、② 已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究 中应用较为广泛。 下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。
1、酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳 多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。 主要步骤为： ① 4 ℃ ，5000rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（100 mL ）。弃 上清，约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀。 ② 每克菌加8μL PMSF 及80μL 溶菌酶，搅拌20 min ；边搅拌边每克菌加4 mg 脱 氧胆酸（在冷室中进行）。 ③ 37 ℃ ，玻棒搅拌，溶液变得粘稠时加每克菌20μL DNase I。室温放置至溶液不 再粘稠。 2、超声破碎法。声频为15-20 kHz 的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎， 在处理少量样品时操作简便，液体量损失较少，同时还可对染色体DNA 进行剪切 ，大大降低液体的粘稠度。 ① 收集1 L 诱导表达的工程菌，40 ℃ ，5000r pm 离心，15 min ；弃上清，约每 克湿菌加3 mLTE 缓冲液。 ② 按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌；10 000g 离心，15min ，分别收集 上清液和沉淀。 ③ 分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2× 凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS PAGE 。 注意事项：超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关， 应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经3 -4 次冻溶后更容易破碎。
细胞自噬诱导实验报告
细胞自噬诱导实验报告
细胞自噬的实验观察，主要有四种方法。1、提取总RNA，通过Real-time PCR 分析相关基因A TG4、A TG5和AT7G的表达；2、提取总蛋白，通过Western blotting 分析LC3的脂化；3、构建GFP-LC3表达载体，通过细胞转染利用荧光显微镜观察LC3颗粒的聚集；4、制备电镜样品，直接观察自噬体的形成。
一、pEGFP-C2-LC3质粒的提取与鉴定实验原理
一、实验原理
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。
质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA 序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。
BAP的诱导、分离纯化及其功能的检测
生物化学大实验结题报告BAP的诱导、分离纯化及其功能的检测
学生姓名：
学号：
年级：
专业：
指导教师：
完成时间：
BAP的诱导、分离纯化及其功能的检测
摘要：BAP能催化核酸分子脱掉5′磷酸基团，是分子生物学中常用的底物专一性低的磷酸单酯酶。将BAP克隆在含有lac启动子的表达载体中，在培养基中加入诱导物IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖）可使得阻遏蛋白不能与操纵基因结合，让其在E-coli中大量转录并表达。对细菌进行超声波破碎以后用亲和层析柱对其进行分离纯化，对其表达的蛋白进行SDS-PAGE检测和Western-blotting，用作特性分析。最后通过与BAP标准样品的比较计算出其活力。
关键词：BAP；分离纯化；SDS-PAGE；Western-blotting
细菌性碱性磷酸酶属于同源二聚体蛋白，分子量为56KDa。每个单体由449个氨基酸组成，完整的AKP分子呈现典型的α/β的拓扑结构，同时每个单体均具有一个活性中心。细菌性碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。其最适pH是8.0。
本实验技术路线：重组蛋白的诱导表达→重组蛋白的亲和层析纯化重组蛋白的分子筛排阻层析纯化→SDS-PAGE电泳及Western-blot鉴定重组蛋白→重组蛋白活性的检测。
1 材料与方法
1.1 菌种及实验用相关试剂
大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)，由生化实验室提供。
蛋白质的表达、分离、纯化实验流程
蛋白质的表达、分离、纯化实验流程
蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。
实验步骤
一：材料准备
1. 实验材料：大肠杆菌BL21、LB 液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠
2. 实验仪器：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒
二：实验操作
1.试剂准备：
2.
2. 获得目的基因
①PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。
②通过RT-PCR 方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。
3. 构建重组表达载体
①载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。
②PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。
4. 获得含重组表达质粒的表达菌种
①将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp 或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
②测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
③以此重组质粒DNA 转化表达宿主菌的感受态细胞。
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤(待改良)
1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.
4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,参加IPTG,浓度梯度从25μM
到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会到达菌体
蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。
4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm),
诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中参加1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。2.
保种可以取一局部分成50μl一管,每次用一管,防止反复冻融。
8、包涵体检测。方案见附件2
9、如有上清表达,则扩大摇菌。
IPTG诱导表达步骤
大肠杆菌中蛋白质诱导表达
(一)材料
1. IPTG(用去离子水配成1 00mM，用0.22μm滤器过滤除菌，-20℃保存)
2. 10xPBS缓冲液: NaCl 1.37 M
KCl 27 mM
Na2HPO4 100 mM
KH2PO420 mM
3. PMSF(用异丙醇配成10mM，-20℃保存)
4. 10% TritonX-100
(二)方法
1. 挑取单克隆接种于少量含有抗生素的LB液体培养基中，37℃, 250rpm震荡培养过夜;
2. 将过夜培养物按1:100的比例接种到新鲜的含有抗生素的LB液体培养基中，37℃,
250rpm震荡培养2-4h至OD600为0.5;
3. 加入IPTG至终浓度为0.3mM，继续37℃, 250rpm震荡培养2-3h;
4. 4℃, 4000rpm离心10min后，去上清，加入适量IxPBS重悬，在加入PMSF至终浓度为
0.1 mM，冰上预冷10min;
5. 进行冰浴超声破碎5-10min (10-20sec/次)，至菌液较为澄清;
6. 加入10% TritonX-100至终浓度为0.5%, 4 ℃震荡15min;
7. 4℃, 12000rpm离心10min后，取上清:
8. 用相同体积的1 xPBS重悬沉淀，将诱导前及诱导后所取的样品，以及超声破碎后的上清
和沉淀分别进行蛋白电泳检测，考马斯亮蓝染色，脱色:
9. 根据脱色结果，可确定是否表达出目的蛋白，并且判断所表达的蛋白是可溶性还是以包
涵体形式存在。
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤(待改进)
1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT—PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA.
4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3)、Rosetta gami(DE3）、Bl21 codon（DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM
到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2）SDS—PAGE电泳检测目的蛋白的表达.注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体
蛋白的50％以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10％甘油保种，保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0。22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60％,使用时自己计算用量。
4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度，低转速（140—180rpm)，
诱导过夜作为包涵体检测样品.
注意:1。如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达.葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2.
保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。
8、包涵体检测。方案见附件2
9、如有上清表达，则扩大摇菌。
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤(待改良)
1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.
4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,参加IPTG,浓度梯度从25μM
到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会到达菌体
蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。
4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm),
诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中参加1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。2.
保种可以取一局部分成50μl一管,每次用一管,防止反复冻融。
8、包涵体检测。方案见附件2
9、如有上清表达,那么扩大摇菌。
IPTG诱导表达蛋白步骤
IPTG诱导表达蛋白步骤
15-11-3
配固体培养基和液体培养基，灭菌。
配BindingBuffer和脱盐液各500ml。在400ml体积时调节溶液pH值至7.4，定容后转到试剂瓶中。溶液使用前要抽滤（滤除溶液内的气泡和不溶性杂质）。倒板：（5个灭菌的培养皿）
①微波加热溶解固体培养基
（每次加热30s待有沸腾的迹象时，减少加热的时间）。
②超净台操作，以1˸1000的比例（1ml培养基~1μl抗生素）向培养基中加入Kan+(50mg/ml)，摇匀。
③倒板。
④培养皿放置在超净台上凝固，
凝固后将培养皿倒着放入培养箱
中
15-11-4
热转化：
（将质粒导入大肠杆菌中）
①提前将大肠杆菌（冰上融化）和质粒拿出来融化，混合（冰上操作）后冰上放置
30min。
②42℃热水浴1min（超过90s会损伤细菌），取出后立即放在冰上冷却2~3min，加入1mlSOC培养基。③摇床上摇45min，150rp，37℃。（使菌体复苏）
④离心，
3000rpm3min。
⑤涂板：取200μl上述液体，喷到板上，用玻璃涂布棒涂匀，放入培养箱中30min晾干后倒着放置。（12~16h）
15-11-5配IPTG（0.2g/ml），用灭菌水，超净台操作。
挑单克隆：将细菌放入培养液中，以便进行扩大培养和后续实验）
①提前准备好几支装有
3ml
培养基的试管，每管加入3μl Kan+抗生素(50mg/ml)，塞好塞子，试管倾斜，是抗生素溶入培养液中。（塞子打开前和塞好后都要在酒精灯上过火灭菌）。
②小镊子过火灭菌后，夹取一个枪头，在培养皿上挑一个单个的菌落，轻轻划过。将带有菌落的枪头放入试管中，塞好塞子（试管中培养基液澄清）
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
二、实验步骤
3、梯度洗脱，分别用不同浓度的咪唑溶液洗脱 杂蛋白，收集每个组分的洗脱液，备电泳上样。 流穿 Binding buffer， 20mM咪唑（3个柱体积）； 50mM咪唑（3个柱体积）； 100mM咪唑（5个柱体积）； 200mM咪唑（5个柱体积） ； 1M咪唑（3个柱体积）冲洗； 4、平衡柱子，用平衡液（5个柱体积）平衡柱子。
二、实验原理
http://www.bbioo.com/video/65-63-1.html
三、实验器材
恒温摇床、培养用锥形瓶、超净工作台、 离心机、灭菌锅、IPTG等
四、操作步骤
1、从平板中挑取单菌落，接入5ml含有卡那霉素(终浓度 30µg/ml)的液体培养基中，并接种空质粒菌液作为空白 对照。为获得良好的通气，培养基体积最多为三角瓶体 积的1/4，在37℃ 250rpm振荡培养OD600值至0.6-0.8。
实验十二 重组子诱导表达及检测
一、实验目的
• 通过本实验了解外源基因在原核细胞中表 达的特点和方法。
二、实验原理
大肠杆菌的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳 糖苷酶、半乳糖透过酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、 一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与 O序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还 有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、 O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码 基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖 存在时，lac操纵子处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下 表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合， 抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导。在这个操 纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b-半 乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏 蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异 丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代 谢而十分稳定，因此广泛应用。
四、实Baidu Nhomakorabea步骤
1、制备凝胶。取干燥洁净的玻璃板及其固定设 备组装好。先灌入2/3体积的分离胶，立即用水 封胶，封胶后保持不动。待分离胶凝固后将封胶 液倒掉，灌入压缩胶，插梳子时胶孔不能有气泡， 待压缩胶凝固后拨出梳子，若上样孔有变形，可 用适当粗细的针头拨正。
四、实验步骤
12%分离胶的配制(20ml)： 30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺 8ml 1.5M Tris-HCl(pH8.8) 5ml 10%过硫酸铵 0.2ml 10%SDS 0.2ml TEMED 8μl ddH2O 6.6ml 5%压缩胶的配制(6ml)： 30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺 1ml 1M Tris-HCl(pH6.8) 0.75ml 10%过硫酸铵 0.06ml 10%SDS 0.06ml TEMED 6μl ddH2O 4.1ml 把其他设备组装好即可进行上样和电泳检测
实验十五 蛋白质电泳检测
一、实验目的
1、了解SDS-PAGE电泳原理。 2、掌握凝胶电泳实验操作方法。
二、实验原理
三、实验器材
电泳设备、30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺、1.5M TrisHCl(pH8.8)、1M Tris-HCl(pH6.8)、10%过硫酸铵、 10%SDS、TEMED等。
二、实验步骤
1、样品处理 超声破碎（20min/次） 高速离心（30min/次） 过滤膜 2、纯化
1、NTA层析柱的准备：在层析柱中加入2ml NTA 介质，并分别用10ml去离子水冲洗，10ml上样缓冲 液平衡。 2、上样：2.5ml蛋白上清液加入纯化柱内，打开阀 门，使之流出，速度控制在0.25滴/秒
四、操作步骤
2、从中取出1ml样品作为目的基因重组片段的未诱导 对照,在剩下的样品中加入IPTG(终浓度1mM),分别在 20℃培养16-20小时。 3、将收集的菌液（诱导4ml和非诱导1ml）5000rpm离 心5min收集菌体沉淀。 4、 向离心收集的菌体沉淀中加入50 μl/200μl的PBS， 涡旋重悬菌体。 6、取10ul菌液，各加入5ul的3×上样缓冲液,充分混 匀，沸煮5min（剩余菌体沉淀保存于-20℃或-80℃冰 箱）。 7、12000rpm离心5min，取上清液作为电泳样品。 8、SDS-PAGE电泳检测诱导表达的结果。
SDS—PAGE电泳检测
实验十四 外源表达蛋白的分离纯化
一、实验目的
1、了解重组蛋白亲和层析分离纯化原理和方法。
二、实验原理
• 携带有目标蛋白基因的 质粒在大肠杆菌BL21中， 在特定温度，特定终浓 度IPTG诱导下，超量表达 携带有6个连续组氨酸残 基的重组蛋白，该蛋白 可用一种通过共价偶连 的次氨基三乙酸（NTA） 使镍离子（Ni2+）固相化 的层析介质加以提纯。
四、实验步骤
2、上槽加入1×SDS-PAGE电泳缓冲液，下槽加入 0.5×SDS-PAGE电泳缓冲液； 3、用微量进样器每孔加入处理好的蛋白样品15µl( 上样前将胶孔的气泡清除)，低分子量蛋白质marker上 样10µl，所有蛋白样品上样前调整到等浓度； 4、开始稳流电泳，压缩胶电流为15mA，当溴酚蓝 指示带移动到压缩胶与分离胶的分界线时，将电流调 整为25mA； 5、当溴酚蓝指示带移动到距分离胶胶下缘1.5cm时 结束电泳，取出凝胶，加入染色液室温下在水平摇床 上进行考马斯染色30min，回收染色液，加入脱色液 室温振荡脱色(更换脱色液2～3次)至背景清晰。
四、实验步骤
Marker 未诱导 IPTG诱导 流穿液
20mM 50mM 100mM 200mM 1M