诱导表达 分离纯化实验步骤
蛋白表达纯化流程
蛋白表达纯化流程第一章蛋白表达纯化一、诱导表达分析1) 把测序正确的表达质粒转化到合适的表达宿主菌中并涂布在相应抗性的LB 平板上培养过夜;2) 分别挑两个单克隆于3ml含抗生素的LB培养基中培养过夜;3) 按1%接种过夜培养的菌液于4ml含抗生素LB培养基中37度培养2-3小时;4) 加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达3个小时左右，取样做蛋白电泳分析目标蛋白的表达情况。
二、蛋白纯化2.1重组蛋白的提取2.1.1 提取缓冲液20 mM Tris-HCl (pH8.0) 或者其他推荐使用的缓冲体系。
如需溶解难溶蛋白或者包涵体还可加入8 M urea 或 6 M guanidine hydrochloride 。
Note: 处理(His)6融合蛋白时可以加入5–50 mM imidazole 以减少上柱时的非特异性吸附。
2.1.2 方法1)发酵液离心收集菌体(at 7 000–8 000 g for 10 minutes or 1 000–1 500 g for 30minutes at +4 °C)。
2)弃去上清液，加入适当的20 mM Tris-HCl (pH8.0)，重悬；3)离心收集菌体同上，弃去上清液，将装有菌体的离心管置于冰中。
4)每ml菌体加入50ul冰冷的提取缓冲液重悬菌体。
5)冰浴中超声裂解菌体(超声2秒，停止6秒)，之后取样进行SDS-PAGE电泳分析。
Note:超声破菌应尽量使用最短的时间，长时间的进行可能会破坏蛋白功能。
还应避免产生泡沫，因为这样会使蛋白变性和导致宿主蛋白与融合蛋白协同纯化。
6)离心使细胞碎片沉降(at 12 000 g for 10 minutes at +4 °C)。
7)小心将上清液移到干净的容器中，并取样进行SDS-PAGE电泳分析。
Note:含有8 M urea的样品可以直接电泳上样，但含有6 M guanidine hydrochloride的样品必须换成8 M urea才可上样。
his蛋白诱导纯化
his蛋白诱导纯化NKAP His标签蛋白诱导表达1.构建克隆：在含有his标签的Pet-28a的原核表达载体上，构建NKAP克隆。
2.转化：将构建的his-NKAP转化到BL21感受态中,涂卡那抗性的LB板。
3.摇菌：挑克隆，加到卡那抗性的螺旋管中，37℃摇菌过夜。
4.转接：接种1/100的菌种到三角烧瓶中，37℃摇菌。
约2-4h后，使其浓度达到OD值为0.4-0.6之间（对数生长期）。
(一般取1ml菌作为“诱导前”)测OD值：①setup—wavelength—600nm②LB空培养基—CAL③加入菌液，读值。
5.低温诱导：加入IPTG至终浓度为0.6mM（1M，1000X-10000x），20℃，180rpm，制冷系数0.5，（密码均为3）低温诱导过夜（一般16-18h）。
(一般取1ml菌作为“诱导后”)6.超声破碎：4℃离心收集诱导菌，按10:1的比例加lysis buffer （使用前加终浓度为1mMPMSF，0.2M，200X）重悬菌块，置于冰浴中低温超声，超声3秒停5秒，100%功率，至菌悬液澄清。
（注意不要碰到容器壁，避免产生气泡）Lysis buffer：50mM Na2HPO4300mM NaCI20mM 咪唑7.高速离心：12000rpm，20min，4℃高速离心。
将上清过0.45um滤膜。
（用枪尖挑少许沉淀于1Xloading中，待跑胶用）8.预平衡：Ni-NTA琼脂糖珠（1ml/1L菌）用lysis buffer洗3次。
（4℃旋转5min/次，后4℃3000rpm/600g离心5min，吸弃上清重复3次。
）9.结合：将过滤后的裂解上清与预平衡好的Ni-NTA琼脂糖珠在4℃轻柔结合2h。
10.漂洗：将结合有蛋白的镍珠用wash buffer 洗3次，10min/次。
11.洗脱：将漂洗后的镍珠用elute buffer 洗3，10min/次。
12.浓缩：将洗脱后的上清液用10k浓缩杯浓缩并交换buffer值PH=7.0 PBS中，分装，SDS-PAGE检测，放入-80℃冰箱中保存。
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验一般分为以下几个步骤：
1. 构建表达载体：将待表达的基因克隆到适当的表达载体上,如常用的pET、pGEX等载体中。
2. 转化大肠杆菌：将表达载体转化到大肠杆菌细胞中。
可以通过化学方法、电转化、冷冻复苏、热激转化等方法进行。
3. 诱导表达：在大肠杆菌细胞进行生长至适当时期后,添加适宜浓度的诱导剂,如IPTG等,诱导待表达基因蛋白的合成。
4. 细胞收获和破碎：诱导一定时间后,收获大肠杆菌细胞并进行破碎,以获得待表达蛋白。
5. 蛋白提取：对细胞破碎物进行离心、超滤等步骤,去除残余细胞构成和杂质,得到含有待表达蛋白的上清液。
6. 纯化和分析：将上清液进行分离、纯化、鉴定,以确定表达蛋白相应的分子量、酶活性等。
在以上步骤中,实验者需要进行质控和评估,确认实验步骤是否正确和表达蛋白是否达到预期,以确保实验结果的可靠性和准确性。
IPTG诱导表达蛋白步骤
IPTG诱导表达蛋白步骤15-11-3配固体培养基和液体培养基，灭菌。
配BindingBuffer和脱盐液各500ml。
在400ml体积时调节溶液pH值至7.4，定容后转到试剂瓶中。
溶液使用前要抽滤（滤除溶液内的气泡和不溶性杂质）。
倒板：（5个灭菌的培养皿）①微波加热溶解固体培养基（每次加热30s待有沸腾的迹象时，减少加热的时间）。
②超净台操作，以1˸1000的比例（1ml培养基~1μl抗生素）向培养基中加入Kan+(50mg/ml)，摇匀。
③倒板。
④培养皿放置在超净台上凝固，凝固后将培养皿倒着放入培养箱中15-11-4热转化：（将质粒导入大肠杆菌中）①提前将大肠杆菌（冰上融化）和质粒拿出来融化，混合（冰上操作）后冰上放置30min。
②42℃热水浴1min（超过90s会损伤细菌），取出后立即放在冰上冷却2~3min，加入1mlSOC培养基。
③摇床上摇45min，150rp，37℃。
（使菌体复苏）④离心，3000rpm3min。
⑤涂板：取200μl上述液体，喷到板上，用玻璃涂布棒涂匀，放入培养箱中30min晾干后倒着放置。
（12~16h）15-11-5配IPTG（0.2g/ml），用灭菌水，超净台操作。
挑单克隆：将细菌放入培养液中，以便进行扩大培养和后续实验）①提前准备好几支装有3ml培养基的试管，每管加入3μl Kan+抗生素(50mg/ml)，塞好塞子，试管倾斜，是抗生素溶入培养液中。
（塞子打开前和塞好后都要在酒精灯上过火灭菌）。
②小镊子过火灭菌后，夹取一个枪头，在培养皿上挑一个单个的菌落，轻轻划过。
将带有菌落的枪头放入试管中，塞好塞子（试管中培养基液澄清）③将试管放在摇床中培养一晚，37℃,250rpm。
（尽量不超过12h）【试管中培养基液变混浊】注意：操作尽量在靠近酒精灯的地方进行。
15-11-6扩大培养、诱导表达①以（抗生素˸培养基）1˸1000的比例向培养基中加入Kan+抗生素，摇匀后再加入（100ml培养基）1ml单克隆溶液，摇匀。
蛋白质纯化方法
含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化一.用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因所需特殊试剂：1M IPTG1.将目的基因与IPTG诱导表达载体连接，构成重组质粒并转化相应的表达用的大肠杆菌。
将转化体铺于含相应抗生素的LB平板，37℃培养过夜。
通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。
2.分别挑取对照菌和重组菌1个菌落，接种于1ml含有相应抗生素的LB培养液中，37℃通气培养过夜。
3.取100微升过夜培养物接种于5ml含有相应抗生素的LB培养液中（各10份），适当的温度（20－37℃）震荡培养4小时，至对数中期（A550＝0.1-1.0）。
4.对照菌和重组菌各取1ml未经诱导的培养物于离心管中，剩余培养物中加入IPTG至终浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0mM相同的温度继续通气培养。
5.在诱导的1，2，3，4，5个小时取1ml样品于Ep管中。
细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量，诱导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。
生长过度或过速会加重细菌合成系统的负担，导致包涵体的形成。
生长温度可能是影响大肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。
低温培养能在一定程度上抑制包涵体的形成。
IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。
所以通过试验确定最佳的培养条件是很必要的。
6.将所有样本室温最高速度离心1分钟，弃上清，沉淀重悬于100微升1×SDS蛋白上样缓冲液中，100℃加热5分钟，室温最高速度离心1分钟，取15微升样品上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶，用SDS－PAGE观察表达产物条带，从而确定优化的培养条件。
二.大量表达靶蛋白1.取保存的重组大肠杆菌菌液150微升接种于30毫升含相应抗生素的LB培养液中，在100毫升锥形瓶中，300rpm，37℃通气过夜培养。
2.取16毫升过夜培养物接种于800ml含相应抗生素的LB培养液，在2L的锥形瓶中用预实验所确定的最佳诱导温度，300rpm，通气培养4小时，至对数生长中期。
蛋白质的表达、分离、纯化实验
蛋白质的表达、分离、纯化实验蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。
实验方法原理携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。
蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
实验材料：大肠杆菌BL21试剂、试剂盒：LB液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer Elution Buffer IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠仪器、耗材：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒实验步骤一、试剂准备1. LB液体培养基：Trytone 10 g，yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。
2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。
3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM 2-ME，pH8.0。
4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。
5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea，500 mM Imidazole，pH8.0。
6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、获得目的基因1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
毕赤酵母诱导表达实验流程
毕赤酵母诱导表达实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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蛋白表达纯化试验步骤
1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA 。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽, 要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、R T-PCR,KO［酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5z感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株, 挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21(DE3) 、Rosetta gami(DE3) 、Bl21 codon(DE3) 等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至0。
=左右，加入IPTG,浓度梯度从25卩M到1m 37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。
甘油是用卩m过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%使用时自己计算用量。
4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽, 不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50卩l 一管，每次用一管，避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件 21)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=约5h左右,视菌种1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA 。
9、如有上清表达, 则扩大摇菌。
1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=约5h左右,视菌种的活性而异, 也可过夜摇菌。
2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm 摇至OD=左右（约~3h）,然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,K0酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切，将cDNA克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5a感受态细菌中扩增，提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。
表达菌株如BI21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 cod on (DE3)等。
7、蛋白的诱导表达1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至0D二0・6左右,加入IPTG,浓度梯度从25 11M到lm Mo 37度诱导过夜（一般3h以上即有大量表达）。
2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3）将有表达的菌株10%甘油保种，保存lml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0. 22 um过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。
4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达,18 度,低转速(140-180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对困体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%勺葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50卩I 一管,每次用一管, 避免反复冻融。
8包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达，则扩大摇菌。
1）取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右，视菌种的活性而异，也可过夜摇菌。
2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37 度,250rpm摇至OD= 1.0左右（约 2.5h〜3h）,然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。
分子生物学实验II
分子生物学实验II（蛋白质的表达、纯化及检测）实验一：外源基因在大肠杆菌中的诱导表达【实验目的】通过本实验了解外源基因在原核细胞中诱导表达情况。
【实验原理】将外源基因克隆在使用含有lac操作子的启动子的表达载体中，让其在E. coli中表达。
首先在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的产生的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，从而不能进行外源基因的表达；然后向培养基中加入诱导物IPTG，此时LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因表达。
【实验仪器、材料与试剂】实验仪器：超净工作台、试管、摇床、离心机等。
菌株和质粒：菌株：大肠杆菌BL21；重组质粒pET-30a-X：基因X与pET-30a重组。
主要试剂●50mg/ml 卡那霉素配10ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，分成10份，贮存于-20℃。
●1M IPTG：将2.4g IPTG溶于10mL ddH2O 中，用0.22μm滤膜过滤除菌，每份1ml，贮存于-20℃。
●LB液体培养基胰蛋白胨（tryptone）10g酵母酵母膏（yeast extract）5gNacl 10g摇动容器直至溶质完全溶解,用NaOH(1M)调节PH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20分钟。
【实验步骤】1．种子液的制备挑取LB固体平板上的大肠杆菌BL21（pET-30a-X）单菌落，接种于含5μl卡那霉素的5ml LB液体培养基的试管中，37℃，200rpm振荡培养过夜。
(注意取菌株要在超净工作台上操作，一定注意无菌).2．转接培养取50μl菌液分别转接到两支含有5μl卡那霉素的5ml LB液体培养基试管中（1%接种量），37℃、200rpm转接培养。
3. IPTG诱导表达当培养2.5小时，使其OD600值达0.6左右，开始向一支试管中加入5ul 1M 的IPTG（终浓度为1mM）进行诱导表达6小时，另一支试管作为对照不加IPTG。
诱导纯化蛋白实验报告
一、实验名称：诱导纯化蛋白实验二、实验目的：1. 掌握蛋白质的诱导表达方法；2. 学习蛋白质的纯化技术；3. 了解蛋白质纯度的鉴定方法。
三、实验原理：蛋白质的诱导表达是指在合适的诱导剂作用下，使蛋白质在细胞内大量合成。
本实验采用IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）作为诱导剂，诱导表达目的蛋白。
蛋白质的纯化主要包括亲和纯化、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法。
本实验采用亲和纯化法，利用目的蛋白与特定配体的特异性结合，实现蛋白质的纯化。
蛋白质纯度的鉴定主要通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）和Western Blot（蛋白质印迹）等方法。
四、实验材料与仪器：1. 材料：（1）大肠杆菌菌株：表达载体pET-28a+；（2）IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）；（3）诱导剂；（4）蛋白质纯化柱；（5）SDS-PAGE试剂；（6）Western Blot试剂；（7）其他试剂。
2. 仪器：（1）电泳仪；（2）凝胶成像系统；（3）Western Blot成像系统；（4）离心机；（5）恒温水浴锅；（6）其他实验仪器。
五、实验步骤：1. 转化：将pET-28a+表达载体转化到大肠杆菌菌株中，筛选阳性克隆。
2. 培养与诱导：将阳性克隆接种到LB液体培养基中，37℃、200 rpm培养过夜。
按1:100的比例将过夜培养物接种到新鲜的LB液体培养基中，37℃、200 rpm培养至OD600=0.6时，加入IPTG诱导表达目的蛋白。
3. 收集细胞：诱导表达6小时后，离心收集细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。
4. 蛋白质裂解：将细胞重悬于裂解缓冲液中，冰浴30分钟，超声破碎细胞。
5. 亲和纯化：将裂解液上样到蛋白质纯化柱，收集流出液和结合液。
用洗脱缓冲液洗脱结合蛋白，收集洗脱液。
6. SDS-PAGE：取适量洗脱液进行SDS-PAGE电泳，观察目的蛋白的纯度。
7. Western Blot：将SDS-PAGE电泳后的凝胶进行转膜，用一抗和二抗进行Western Blot检测，观察目的蛋白的表达。
实验 蛋白质的诱导表达
一般融合载体图解
阅读框架的保证
原核表达使用的宿主菌
一般可使用的菌株有： JM109, BL21(DE3), Y1090等。
本实验使用的菌株为：BL21(DE3溶原菌) 噬菌体DE3 : 21抗性区,
LacI基因, LacUV5启动子 T7 RNA聚合酶基因
T7 RNA聚合酶:提高T7启动子启动 的蛋白质的表达水平
典型的表达载体
具备与克隆载体相同的条件：自主复制 序列，可供筛选的遗传性状，MCS 还必须具有用于外源基因表达的启动子、 SD序列、及转录终止子等元件。 pET系列,pGEX系列
原核表达载体的构建
融合蛋白
融合蛋白:
将两个或多个开放阅读框按一定顺序连接, 融合 阅读框表达出一杂合蛋白
这一区段插入了int基因,阻止DE3在有辅助噬菌体的情况下整合到染色体上或从染色体切出,
影响表达效率的主要因素
DNA转录和RNA翻译，即遗传信息从基因流向RNA又流向蛋白质的过程总 称为基因表达,基因表达可以在不同的水平上进行调控，如控制基因的 开启、关闭和活性的大小，影响和控制转录和翻译等都属于基因表达 的调控
1. 转化带有T7RNA 聚合酶基因 的菌株
诱导优化表达目的蛋白
1. 检测质粒稳定性 2. 确定表达时间和温度的最佳条件 3. 分析蛋白溶解性和活性 4. SDS-PAGE, Western 印迹等 确定目的蛋白 1. 放大培养 2. 制备粗提物 3. 亲和纯化 4. 切除融合标签并去除蛋白酶
纯化目的蛋白
稀有密码子:
多数氨基酸都有一个以上的密码子, 但有一些 E.Coli很少 使用, 当异源目的基因的mRNA过表达时, tRNA 的数量直接 反应密码子的偏倚性, 一个或多个tRNA的稀有或缺少会导 致翻译的停止
原核表达实验
原核表达实验原核表达操作流程实验概要本实验介绍了原核表达的具体操作流程，包括：外源基因的诱导表达，大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化。
实验原理1. E. coli 表达系统E. coli 是重要的原核表达体系。
在重组基因转化入E. coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。
2. 外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
常用的有温度诱导和药物诱导。
本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
主要试剂1. 诱导表达材料1) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌2) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。
3) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2. 大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1) 酶溶法a. 裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaClb. 50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
c. 10 mg / mL 溶菌酶。
d. 脱氧胆酸。
e. 1 mg / mL DNase I。
2) 超声破碎法a. TE 缓冲液。
（完整版）1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验
（完整版）1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验第一天1、配置LB培养基：酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。
调节PH至7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。
分装成15瓶（每瓶200ml）。
2、接种（超净台要提前杀菌通风）取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。
37℃过夜。
第二天1、扩大培养（超净台）4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。
2、诱导（超净台）加40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。
25℃摇床培养4小时。
3、离心获取菌体4℃，8000rpm离心25分钟。
注意配平。
4、超声波破碎菌体离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。
将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。
离心收集上清液。
600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。
超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。
探头浸没于菌液中，不可伸入过长。
注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。
5、抽滤（双层滤纸)洗胶（GST）。
将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。
第三天1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。
2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。
3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。
用洗脱液调零，测OD280。
（OD值达到1.5为佳）4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT—PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21（DE3)、Rosetta gami(DE3）、Bl21 codon（DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2）SDS—PAGE电泳检测目的蛋白的表达.注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50％以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10％甘油保种，保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0。
22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60％,使用时自己计算用量。
4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度，低转速（140—180rpm)，诱导过夜作为包涵体检测样品.注意:1。
如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达.葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达，则扩大摇菌。
1）取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD〉=1.5，约5h左右,视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。
2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右（约2.5h~3h）,然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。
）注:菌液浓度要适当的浓一些，否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢.拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。
真核蛋白表达及纯化步骤
真核蛋白表达及纯化步骤
真核蛋白表达及纯化步骤如下：
1. 重组质粒构建：
a. 目的基因的获取：基因合成、PCR。
b. 线性载体的获取：载体酶切，获取线性载体。
c. 重组反应：根据连接酶说明，进行线性载体和目的基因片段的酶连；转化涂板（相应抗性）。
d. 质粒验证：质粒验证图，质粒测序验证。
2. 蛋白诱导表达：普适条件查看蛋白是否表达（如本实验室在BL21（DE3）中，37℃，1mM IPTG诱导表达5h）。
若不表达，更换载体、表达菌株等方法查看是否表达；若表达，继续进行下面实验。
3. 蛋白表达部位分析：分析蛋白是可溶性的还是不溶性的表达，即在超声后上清表达还是沉淀表达；是否与你的目标蛋白表达部位相同，相同进行后续蛋白表达条件优化。
4. 蛋白小量表达条件优化：优化诱导IPTG浓度、诱导温度。
5. 蛋白大量表达：根据小量表达优化的条件等比例放大培养。
6. 蛋白纯化：根据目标蛋白的性质（可溶性蛋白or膜蛋白）进行样本处理。
然后进行亲和纯化，获取目的蛋白。
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤(总9页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。
甘油是用μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。
4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。
1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=,约5h左右,视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。
2)将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 左右(约~3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。
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四、实验步骤Biblioteka Marker 未诱导 IPTG诱导 流穿液
20mM 50mM 100mM 200mM 1M
四、实验步骤
1、制备凝胶。取干燥洁净的玻璃板及其固定设 备组装好。先灌入2/3体积的分离胶，立即用水 封胶，封胶后保持不动。待分离胶凝固后将封胶 液倒掉，灌入压缩胶，插梳子时胶孔不能有气泡， 待压缩胶凝固后拨出梳子，若上样孔有变形，可 用适当粗细的针头拨正。
四、实验步骤
12%分离胶的配制(20ml)： 30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺 8ml 1.5M Tris-HCl(pH8.8) 5ml 10%过硫酸铵 0.2ml 10%SDS 0.2ml TEMED 8μl ddH2O 6.6ml 5%压缩胶的配制(6ml)： 30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺 1ml 1M Tris-HCl(pH6.8) 0.75ml 10%过硫酸铵 0.06ml 10%SDS 0.06ml TEMED 6μl ddH2O 4.1ml 把其他设备组装好即可进行上样和电泳检测
二、实验步骤
1、样品处理 超声破碎（20min/次） 高速离心（30min/次） 过滤膜 2、纯化
1、NTA层析柱的准备：在层析柱中加入2ml NTA 介质，并分别用10ml去离子水冲洗，10ml上样缓冲 液平衡。 2、上样：2.5ml蛋白上清液加入纯化柱内，打开阀 门，使之流出，速度控制在0.25滴/秒
四、操作步骤
2、从中取出1ml样品作为目的基因重组片段的未诱导 对照,在剩下的样品中加入IPTG(终浓度1mM),分别在 20℃培养16-20小时。 3、将收集的菌液（诱导4ml和非诱导1ml）5000rpm离 心5min收集菌体沉淀。 4、 向离心收集的菌体沉淀中加入50 μl/200μl的PBS， 涡旋重悬菌体。 6、取10ul菌液，各加入5ul的3×上样缓冲液,充分混 匀，沸煮5min（剩余菌体沉淀保存于-20℃或-80℃冰 箱）。 7、12000rpm离心5min，取上清液作为电泳样品。 8、SDS-PAGE电泳检测诱导表达的结果。
二、实验原理
/video/65-63-1.html
三、实验器材
恒温摇床、培养用锥形瓶、超净工作台、 离心机、灭菌锅、IPTG等
四、操作步骤
1、从平板中挑取单菌落，接入5ml含有卡那霉素(终浓度 30µg/ml)的液体培养基中，并接种空质粒菌液作为空白 对照。为获得良好的通气，培养基体积最多为三角瓶体 积的1/4，在37℃ 250rpm振荡培养OD600值至0.6-0.8。
实验十二 重组子诱导表达及检测
一、实验目的
• 通过本实验了解外源基因在原核细胞中表 达的特点和方法。
二、实验原理
大肠杆菌的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳 糖苷酶、半乳糖透过酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、 一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与 O序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还 有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、 O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码 基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖 存在时，lac操纵子处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下 表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合， 抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导。在这个操 纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b-半 乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏 蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异 丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代 谢而十分稳定，因此广泛应用。
四、实验步骤
2、上槽加入1×SDS-PAGE电泳缓冲液，下槽加入 0.5×SDS-PAGE电泳缓冲液； 3、用微量进样器每孔加入处理好的蛋白样品15µl( 上样前将胶孔的气泡清除)，低分子量蛋白质marker上 样10µl，所有蛋白样品上样前调整到等浓度； 4、开始稳流电泳，压缩胶电流为15mA，当溴酚蓝 指示带移动到压缩胶与分离胶的分界线时，将电流调 整为25mA； 5、当溴酚蓝指示带移动到距分离胶胶下缘1.5cm时 结束电泳，取出凝胶，加入染色液室温下在水平摇床 上进行考马斯染色30min，回收染色液，加入脱色液 室温振荡脱色(更换脱色液2～3次)至背景清晰。
实验十五 蛋白质电泳检测
一、实验目的
1、了解SDS-PAGE电泳原理。 2、掌握凝胶电泳实验操作方法。
二、实验原理
三、实验器材
电泳设备、30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺、1.5M TrisHCl(pH8.8)、1M Tris-HCl(pH6.8)、10%过硫酸铵、 10%SDS、TEMED等。
二、实验步骤
3、梯度洗脱，分别用不同浓度的咪唑溶液洗脱 杂蛋白，收集每个组分的洗脱液，备电泳上样。 流穿 Binding buffer， 20mM咪唑（3个柱体积）； 50mM咪唑（3个柱体积）； 100mM咪唑（5个柱体积）； 200mM咪唑（5个柱体积） ； 1M咪唑（3个柱体积）冲洗； 4、平衡柱子，用平衡液（5个柱体积）平衡柱子。
SDS—PAGE电泳检测
实验十四 外源表达蛋白的分离纯化
一、实验目的
1、了解重组蛋白亲和层析分离纯化原理和方法。
二、实验原理
• 携带有目标蛋白基因的 质粒在大肠杆菌BL21中， 在特定温度，特定终浓 度IPTG诱导下，超量表达 携带有6个连续组氨酸残 基的重组蛋白，该蛋白 可用一种通过共价偶连 的次氨基三乙酸（NTA） 使镍离子（Ni2+）固相化 的层析介质加以提纯。