发酵工业无菌技术 ppt课件
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第四章发酵工业的无菌技术
管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
法兰连接不当造成的“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
3. 预防
培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角
喷淋冷却连续灭菌流程
蒸汽
蒸汽
放汽
冷却水
无菌培养基 进发酵罐
配料罐
连消泵 连消塔
维持罐
冷却罐
生培养基
真空冷却器 无菌培养基进发酵罐
分批灭菌与连续灭菌的比较
连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有 利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同 温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。
养基加热至1000C以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值要短。
将配置好的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、 保温和冷却等灭菌过程。——高温短时
（三）连续灭菌（连消）
工艺流程 喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程
灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)] 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。
本章内容
一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
法兰连接不当造成的“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
3. 预防
培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角
喷淋冷却连续灭菌流程
蒸汽
蒸汽
放汽
冷却水
无菌培养基 进发酵罐
配料罐
连消泵 连消塔
维持罐
冷却罐
生培养基
真空冷却器 无菌培养基进发酵罐
分批灭菌与连续灭菌的比较
连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有 利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同 温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。
养基加热至1000C以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值要短。
将配置好的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、 保温和冷却等灭菌过程。——高温短时
（三）连续灭菌（连消）
工艺流程 喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程
灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)] 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。
本章内容
一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐
4微生物工程第四章发酵工业的无菌技术
解：C0=2×105(个/ml) Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml) t=2.303/k[lg(C0/Ct)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)] =2.37 min
喷淋冷却连续灭菌流程
喷射加热连续灭菌流程
薄板式换热器连续 灭菌流程
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝 大量自溶，发酵液粘度黏度增加，过滤困难 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂； ②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，使水相和溶媒之 间极易发生乳化。
（二）杂菌污染的防治
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 平板划线培养或斜面培养检查法 肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
四、发酵培养基及设备管道灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）发酵培养基及设备管道灭菌技术
（一）湿热灭菌原理 1.微生物的热阻
灭菌后弃去
发酵前期染菌
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分， 重新接种
发酵中期染菌
挽救困难，应早发现，应根据各种发酵的特 点和具体情况尽快处理 。
抗生素发酵
输入正常发酵的另一罐发酵液
柠檬酸发酵
a. 污染细菌：加大通风，加速产酸；加入盐 酸等条pH3.0以下，抑制细菌
b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制 酵母；通风加大，加速产酸。
3. 杂菌污染的途径及其预防
（1）种子带菌的防治
培养基及器具彻底灭菌 避免菌种在移接过程中受污染 避免菌种在培养及保藏过程中污染
喷淋冷却连续灭菌流程
喷射加热连续灭菌流程
薄板式换热器连续 灭菌流程
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝 大量自溶，发酵液粘度黏度增加，过滤困难 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂； ②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，使水相和溶媒之 间极易发生乳化。
（二）杂菌污染的防治
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 平板划线培养或斜面培养检查法 肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
四、发酵培养基及设备管道灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）发酵培养基及设备管道灭菌技术
（一）湿热灭菌原理 1.微生物的热阻
灭菌后弃去
发酵前期染菌
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分， 重新接种
发酵中期染菌
挽救困难，应早发现，应根据各种发酵的特 点和具体情况尽快处理 。
抗生素发酵
输入正常发酵的另一罐发酵液
柠檬酸发酵
a. 污染细菌：加大通风，加速产酸；加入盐 酸等条pH3.0以下，抑制细菌
b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制 酵母；通风加大，加速产酸。
3. 杂菌污染的途径及其预防
（1）种子带菌的防治
培养基及器具彻底灭菌 避免菌种在移接过程中受污染 避免菌种在培养及保藏过程中污染
4.发酵工业无菌技术 ppt课件
二 如：
发 酵 工
青霉素发酵：污染细短产气杆菌比粗大杆菌 的危害大；
业 污
高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的
染 危害较大；
的
防
治
策
略
发酵工业无菌技术
不同污染时期对发酵的影响
二
发 种子培养期 菌浓低，营养丰富；灭菌；
酵 工
发酵前期 杂菌争夺营养成分，干扰生产菌的
业 繁殖和产物的形成；灭菌，重接种；
通；
略
发酵工业无菌技术
2.无菌空气带菌及防止；
二 3.培养基和设备灭菌不彻底导致的染菌及防
发 酵
止：原料 蒸汽压力 设备死角
工 业
4.设备渗漏引起的染菌及防止；
污 染
5.操作不规范引起的染菌
的
防
治
策
略
第 发酵染菌的拯救与处理
十 一
1.种子培养期染菌的处理：灭菌，倒种；
章 2.发酵前期染菌的处理：灭菌，接种；
养 基Байду номын сангаас
杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致
发酵工业无菌技术
无菌室 室内布置应尽量简单，通常用30瓦
二 发
紫外线灭菌灯照射20~30分钟，配合使用化 学灭菌药剂；无菌室内无菌度的要求是：
酵 把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放
工 业
置30分钟，根据一般工厂的经验，长出的
污 染
菌落在3个以下为好。
的 防
灭菌锅 灭菌操作时需要注意排气管是否畅
治 策
4.发酵工业无菌技术 ppt课件
发酵工业无菌技术
一 发酵工业的无菌处理
在工业微生物培养过程中，只允许生产菌存
在和生长繁殖，不允许其他微生物共存，因
发酵工程 4 发酵工业无菌技术
不 同 产 品
放线菌由于生长的最适pH为7左右，因 此染细菌为多，而霉菌生长pH为5左右， 因此染酵母菌为多。 青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直 接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被 青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发 酵前期、中期或后期，染有能产生青霉 素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。
不 同 产 品
4
思考题
发酵工业的无菌技术
1、发酵工业中污染杂菌的危害及其预防措施
2、灭菌、消毒、除菌与防腐 3、灭菌的常用方法及其机理 4、湿热灭菌的理论计算 5、空气灭菌的常用方法
6、简述好氧发酵无菌空气制备的工艺流程与
要求。
什么是染菌？
发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长
繁殖。
一、发酵工业的无菌处理
由于化学试剂也会与培养基中的一些成分作用，而 且加入培养基后不易去除，它不能用于培养基的灭
菌，但染菌后的培养基可用化学药剂处理。
2．辐射灭菌：
（4）发酵后期染菌
发酵后期发酵液内已积累大量的产物，
特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀
灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响
不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可 以提前放罐。
4、杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
1）发酵染菌对过滤的影响
染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，
所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导
链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不 象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成 不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干扰生 产菌的正常代谢；改变pH，降低产量。 灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑 制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。
对疫苗生产危害很大。现在疫苗多采用深层 培养，这是一类不加提纯而直接使用的产品， 在其深层培养过程中，一旦污染杂菌，不论死 菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。因此， 发酵罐容积越大，污染杂菌后的损失也越大。
项目四-发酵工业的无菌操作PPT课件
23
.
噬菌体是病毒的一种，是一种极微 小的生物，体积是细菌的1/1000左 右，它可以通过细菌过滤器，只有 在电子显微镜下才能看到。
24
. 25
.
26
消除潜在的污染隐患-1
▪ 涉及菌体相关的操作要尽可能在生物安全柜中进行；
▪ 在菌体培养过程中，尽量不要打开瓶口。如果实在需要打开瓶口的话，必需
从杂菌种类看：
➢耐热芽孢杆菌：与④有关
➢球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关
➢浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏
➢霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题
➢酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长
2021/3/20 .
57
从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染 菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气 系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设备 问题。
20
.
溶解氧水平异常变化显示染菌
溶氧浓度 污染噬菌体
正常发酵
溶氧浓度 正常发酵
污染嫌气性杂菌
发酵时间
污染好气性杂菌
发酵时间
21
.
CO2异常显示染菌
工艺一定，尾气中CO2量变化有一定规律 污染杂菌，糖耗加快，尾气中CO2量增加 污染噬菌体，糖耗减慢，尾气中CO2量减少
22
.
2.污染噬菌体的检测
噬菌体是什么？
46
.
常见的设备、管道“死角” 发酵罐的“死角”：不锈钢衬里破裂造成死角，
发酵罐罐底脓疱状积垢。
47
法兰连接不当造成的“死角”
2021/3/20 .
48
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法
2021/3/20 .
49
（4）设备渗漏染菌及防止 原因
.
噬菌体是病毒的一种，是一种极微 小的生物，体积是细菌的1/1000左 右，它可以通过细菌过滤器，只有 在电子显微镜下才能看到。
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. 25
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26
消除潜在的污染隐患-1
▪ 涉及菌体相关的操作要尽可能在生物安全柜中进行；
▪ 在菌体培养过程中，尽量不要打开瓶口。如果实在需要打开瓶口的话，必需
从杂菌种类看：
➢耐热芽孢杆菌：与④有关
➢球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关
➢浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏
➢霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题
➢酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长
2021/3/20 .
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从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染 菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气 系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设备 问题。
20
.
溶解氧水平异常变化显示染菌
溶氧浓度 污染噬菌体
正常发酵
溶氧浓度 正常发酵
污染嫌气性杂菌
发酵时间
污染好气性杂菌
发酵时间
21
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CO2异常显示染菌
工艺一定，尾气中CO2量变化有一定规律 污染杂菌，糖耗加快，尾气中CO2量增加 污染噬菌体，糖耗减慢，尾气中CO2量减少
22
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2.污染噬菌体的检测
噬菌体是什么？
46
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常见的设备、管道“死角” 发酵罐的“死角”：不锈钢衬里破裂造成死角，
发酵罐罐底脓疱状积垢。
47
法兰连接不当造成的“死角”
2021/3/20 .
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灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法
2021/3/20 .
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（4）设备渗漏染菌及防止 原因
4微生物工程第四章发酵工业的讲义无菌技术
3. 杂菌污染的途径及其预防
（1）种子带菌的防治
培养基及器具彻底灭菌 避免菌种在移接过程中受污染 避免菌种在培养及保藏过程中污染
（2）过滤空气带菌及其防治
正确选择采气口
高处采气、前置粗过滤器
设计合理的空气预处理流程
减少含油量和湿度
设计和安装合理的空气过滤 器
介质选择
（3）设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
溶解氧水平异常变化 pH异常变化 尾气中CO2异常变化 其他异常现象（黏度、泡沫、颜色等）
1 2
2. 污染原因分析
主要原因： ① 种子带菌 ② 空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤ 操作失误 ⑥ 技术管理不善
污染原因分析方法：
从污染杂菌的种类分析； 从污染时间进行分析； 从染菌的程度进行分析。
除菌(degermation): 用过滤方法除去空气或液体中 的微生物及其孢子。
防腐(antisepsis): 用物理或化学方法杀死或抑制微 生物的生长和繁殖 。
消毒ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ灭菌的区别
➢ 消毒：表面微生物，只能杀死营养细胞 ➢ 杀菌：所有生命体
消毒与灭菌在发酵工业中的应用
➢消毒：发酵车间环境、设备、器具的无菌处理 ➢灭菌：培养基等物料的无菌处理
染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，
营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成 代谢产物。
B. 霉菌 PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发酵
一无所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。 C. 酵母菌 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗 无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部
相对热阻：指某一微生物在某一条件下的致死时 间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比。
发酵工业无菌技术演示教学
• 在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比 生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为 主；
• 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难 • 杂菌会降解目的产物； • 杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品；
• 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现 象。
4，培养基灭菌的要求 （1）达到要求的无菌程度（10-3） （2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中， 培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引 起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。
4.5.3空气过滤除菌
（一）、空气过滤除菌流程
1、高空采风、两次冷却、两次分油水、 适当加热流程
• 特点 ：两次冷却、两次分油水、适当加热。 空气第一次冷却到30～35℃，第二级冷却 至20～25℃，经分水后加热到30～35℃， 因为温度升高，相对湿度下降。
2、冷热空气直接混合式空气除菌流程
第四章 发酵工业的无菌技术
• 4.1 灭菌与消毒的区别
灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中 所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和 孢子
消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、 器皿内外的病源微生物。
• 培养基灭菌的目的
• 1，在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果： • 生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；
七、补料液的灭菌
在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这 些料液都必需经过灭菌。灭菌的方法则视料液的性质、体积和补 料速率而定。如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭 菌较为合适。也有利用过滤法对另补料液进行除菌。补料液的分 批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附属 设备和管道都要经过灭菌。
缺点 –设备比较复杂，投资较大。
• 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难 • 杂菌会降解目的产物； • 杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品；
• 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现 象。
4，培养基灭菌的要求 （1）达到要求的无菌程度（10-3） （2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中， 培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引 起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。
4.5.3空气过滤除菌
（一）、空气过滤除菌流程
1、高空采风、两次冷却、两次分油水、 适当加热流程
• 特点 ：两次冷却、两次分油水、适当加热。 空气第一次冷却到30～35℃，第二级冷却 至20～25℃，经分水后加热到30～35℃， 因为温度升高，相对湿度下降。
2、冷热空气直接混合式空气除菌流程
第四章 发酵工业的无菌技术
• 4.1 灭菌与消毒的区别
灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中 所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和 孢子
消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、 器皿内外的病源微生物。
• 培养基灭菌的目的
• 1，在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果： • 生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；
七、补料液的灭菌
在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这 些料液都必需经过灭菌。灭菌的方法则视料液的性质、体积和补 料速率而定。如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭 菌较为合适。也有利用过滤法对另补料液进行除菌。补料液的分 批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附属 设备和管道都要经过灭菌。
缺点 –设备比较复杂，投资较大。
发酵工程4发酵工业无菌技术.pptx
➢灭菌（sterilization）是指用物理或化学 方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物 质的过程。 ➢灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指菌 体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀死后， 其细胞发生溶化、消失的现象 。
➢消毒（disinfection）是指用化学或物理 的方法杀灭或去除病原微生物的过程，它一 般只能杀死营养细胞而不能杀灭细菌芽孢。
2）发酵染菌对提取的影响
➢染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白 和其它杂质。 ➢采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化， 很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。 ➢采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、 庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面， 或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交 换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与 产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。
➢消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死 物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌， 而对被消毒的物体基本无害的措施。
➢除菌（degerming）是用过滤方法除去空气 或液体中的微生物及其孢子 。
➢防腐（antisepsis）就是利用某种理化因 素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达 到防止食品等发生霉腐的措施。如低温、缺 氧、干燥、高渗、添加防腐剂等。
4、杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
1）发酵染菌对过滤的影响 ➢染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶， 所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导 致过滤困难。
➢污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异，如 污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难过 滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵 液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平 衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低 过滤收率，直接影响提取总收率。
➢消毒（disinfection）是指用化学或物理 的方法杀灭或去除病原微生物的过程，它一 般只能杀死营养细胞而不能杀灭细菌芽孢。
2）发酵染菌对提取的影响
➢染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白 和其它杂质。 ➢采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化， 很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。 ➢采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、 庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面， 或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交 换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与 产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。
➢消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死 物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌， 而对被消毒的物体基本无害的措施。
➢除菌（degerming）是用过滤方法除去空气 或液体中的微生物及其孢子 。
➢防腐（antisepsis）就是利用某种理化因 素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达 到防止食品等发生霉腐的措施。如低温、缺 氧、干燥、高渗、添加防腐剂等。
4、杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
1）发酵染菌对过滤的影响 ➢染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶， 所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导 致过滤困难。
➢污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异，如 污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难过 滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵 液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平 衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低 过滤收率，直接影响提取总收率。
发酵工业的无菌技术
间 1.设备要求低，不需另外 1.培养基的营养物质损 加热、冷却装置。 失大，灭菌后培养基 歇 质量下降 灭 2.操作要求低，适合小批 量生产规模 2.发酵罐的利用率较低 菌
3.适合含大量固体物料的 3.不适合大规模生产的 灭菌 灭菌
作业
1、连续灭菌的流程与设备 2、对数残留定律 3、分批灭菌、连续灭菌 4、P273第8题
二、影响培养基灭菌的因素p68
杂菌的种类与数量 灭菌温度与时间 培养基成分 pH值 培养基中的颗粒 泡沫
培养基成分
油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物的耐热性 在固形物含量高的情况下，灭菌温度可高些。 环境 耐热性 60～65℃便死亡
水
大肠杆菌
10％糖液
30％糖液
70℃，4～6min
喷射加热连续灭菌流程
薄板换热器连续灭菌流程
3、灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、 后的含菌数。
例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌， 灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有 2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为 15min-1，求灭菌所需的维持时间。
解：C0=2×105(个/ml)
Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml)
t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k=2.303×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]
/15 =2.37 min
间歇灭菌与连续灭菌的比较
优 点 缺 点
连 1.高温短时灭菌，培养基 1.设备复杂，操作麻烦, 营养成分损失少。 染菌机会多。 续 灭 2.发酵罐占用时间缩短， 2.不适合含大量固体物 利用率高。 料的灭菌。 菌
3.适合含大量固体物料的 3.不适合大规模生产的 灭菌 灭菌
作业
1、连续灭菌的流程与设备 2、对数残留定律 3、分批灭菌、连续灭菌 4、P273第8题
二、影响培养基灭菌的因素p68
杂菌的种类与数量 灭菌温度与时间 培养基成分 pH值 培养基中的颗粒 泡沫
培养基成分
油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物的耐热性 在固形物含量高的情况下，灭菌温度可高些。 环境 耐热性 60～65℃便死亡
水
大肠杆菌
10％糖液
30％糖液
70℃，4～6min
喷射加热连续灭菌流程
薄板换热器连续灭菌流程
3、灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、 后的含菌数。
例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌， 灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有 2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为 15min-1，求灭菌所需的维持时间。
解：C0=2×105(个/ml)
Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml)
t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k=2.303×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]
/15 =2.37 min
间歇灭菌与连续灭菌的比较
优 点 缺 点
连 1.高温短时灭菌，培养基 1.设备复杂，操作麻烦, 营养成分损失少。 染菌机会多。 续 灭 2.发酵罐占用时间缩短， 2.不适合含大量固体物 利用率高。 料的灭菌。 菌
发酵工业无菌技术
噬菌斑
• 发酵过程的异常现象观察法：
溶解氧水平 传感器取样分析 pH 尾气中CO2
其他：发酵液粘度、泡沫、颜色
污染原因分析
• 耐热芽孢杆菌，可能是培养基或设备灭菌不彻底 • 球菌、无芽孢等不耐热杂菌，可能是种子带菌、空气
除菌不彻底
• 浅绿色菌落杂菌，可能是冷却盘管渗漏 • 霉菌，一般是无菌室灭菌不彻底或无菌操作问题 • 酵母菌，主要是糖液灭菌不彻底，放置时间久
• 细菌发酵，发酵周期短，主要是防止噬菌体污染 • 霉菌发酵，发酵周期长，产物易降解。 • 酵母菌发酵，需特别防止：（1）生长较快的细 菌（2）野生酵母菌 • 疫苗发酵，通常采用基因工程菌。
杂菌污染的防治
• 显微镜检查法：
简单染色或革兰氏染色，是最常用的检查
杂菌的方法，但需要时间。
• 平板划线培养检查法：
灭菌。连续灭菌可在短时间内加热到保温的
温度，并且能很快地冷却，因此可在比间歇
灭菌更高的温度下进行灭菌，有利于减少营
养物质的损失。
• • • •
配料罐将培养基预热60-70℃。 连消塔（加热塔）使培养基迅速（20 s)升温（126-132℃）。 维持罐：使培养基温度保持在灭菌温度下一段时间。2-7min. 冷却管：将培养基迅速冷却到40-50 ℃，输送到灭菌后的发 酵罐内
常用浓度
0.1-0.25% 2-5% 70-75% 1-5% 3-5% 1-2% （10-15mL/m3） 0.1-0.25%
常用方法
环境消毒可直接 用于粉体 器物浸泡30 min
2 醇类： 乙醇 3 酚类： 石碳酸 来苏尔 4 甲醛
5 铵盐 新洁而灭
空气消毒
皮肤、器械、环境消毒
加热熏蒸4h
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四者的区别 在发酵工业中的应用
5
二、发酵工业污染的防治策略
（一）污染的危害 （二）污染的防治
染菌的不良后果 染菌危害的具体分析
染菌的检查与判断 污染原因分析 预防
6
染菌的不良后果
• 消耗营养 • 合成其他产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难 • 改变pH • 分解产物 • 噬菌体破坏极大
7
染菌危害的具体分析
• 培养基与设备灭菌不彻底的防治
– 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 – 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 – 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加
消泡剂防止泡沫升顶 – 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 – 灭菌后期罐压骤变 – 死角
18
发酵罐的“死角”
➢法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、 联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件 ➢口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口 ➢发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
➢ 发酵前期染菌
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种
➢ 发酵中期染菌
挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方法应根据各种发酵的特点 和具体情况来决定
➢ 发酵后期污染
➢ 染菌量不太多，可继续发酵
➢ 污染严重，则提前放罐
11
具体情况
柠檬酸发酵
污染细菌
加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制细菌
污染酵母
23
四、培养基及设备灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）分批灭菌与连续灭菌的比较 （五）灭菌技术参数
24
（一）湿热灭菌原理
灭菌温度和时间的选择 影响培养基灭菌的其它因素
25
灭菌温度和时间的选择
随着T上升，菌死亡速率增加倍数大于培养基成分分解速率 增加倍数，故一般选择高温快速灭菌 。
• 杂菌分泌较多蛋白质杂质 对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不 利，使水相和溶媒之间极易发生乳化
13
染菌的检查与判断
• 显微镜检查法
镜检出杂菌需要一定时间
• 平板法
平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑
• 肉汤培养检查法 • 发酵过程的异常现象判断
– DO2水平异常变化 – pH异常变化 – 尾气CO2异常变化
染
Hale Waihona Puke 菌 ✓各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所污染的是同一种杂
幅 度
菌，一般是空气系统问题，若个别罐连续染菌，一般是 设备问题。
16
预防12
• 种子带菌的防治
– 灭菌彻底 – 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌
操作可靠 – 保藏可靠
• 过滤空气带菌的防治 • 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
17
预防12
1
本章内容
五四三二一 、、、、、 空培发发概 气养酵酵念 除基工工 菌及业业
设的污 备无染 灭菌的 菌技防
术治 策 略
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
① 染菌对不同菌种发酵的影响 ② 杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响 ③ 不同发酵时期染菌对发酵的影响
8
染菌对不同菌种发酵的影响12
细菌
✓ 谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但 噬菌体威胁大。
✓ 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅 速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。
14
DO2水平异常变化
1 2
15
污染原因分析
①种子带菌②无菌空气带菌③设备渗漏④灭菌不彻底 ⑤操作失误
时 ✓早期污染可能与①②④⑤→接种操作不当有关 间 ✓后期污染可能与③⑤及中间补料有关。
杂 ✓ 耐热芽孢杆菌：与④有关 菌 ✓ 球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关
种 ✓ 霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题 类 ✓ 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
一、概念
灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中 所有有生命物质的过程。 消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以 及容器和器具表面的微生物。 除菌(degermation): 用过滤方法除去空气或液体中的微生 物及其孢子。 防腐(antisepsis): 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的 生长和繁殖 。
• 培养基的物理状态 • 泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌极为
加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母；通风加大，加 速产酸。
污染黄曲霉
加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下降，黄曲霉 自溶。
污染青霉菌
在pH很低下能够生长。提前放罐。
12
杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
• 丝状菌发酵被产酸菌污染 pH不断下降，菌丝大量自溶，发酵液粘度增加，过滤 困难 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮 凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
26
影响培养基灭菌的其它因素
• 培养基成分
– 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增加微生物的 耐热性
– 低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，随着浓度增加，保 护作用减弱，当浓度达8%-10%以上，则减弱微生物的耐热性。
27
• pH：pH6.0-8.0，微生物最耐热，pH<6.0，H+ 易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促 使其死亡。∴培养基pH愈低，灭菌所需时间愈 短。
霉菌
✓ PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发酵一无所 获。
✓ 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。
9
染菌对不同菌种发酵的影响12
酵母菌
✓ 易污染细菌以及野生酵母菌
疫苗
✓ 无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部废弃。
10
不同发酵时期染菌对发酵的影响
➢ 种子扩大时期染菌
灭菌后弃去
——加强清洗并定期铲除污垢 ➢管路死角 ➢管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
19
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
20
法兰连接不当造成的“死角”
21
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法
22
三、发酵工业的无菌技术方法
• 干热灭菌法 • 湿热灭菌法 • 射线灭菌法 • 化学药剂灭菌法 • 过滤除菌法 • 火焰灭菌法
5
二、发酵工业污染的防治策略
（一）污染的危害 （二）污染的防治
染菌的不良后果 染菌危害的具体分析
染菌的检查与判断 污染原因分析 预防
6
染菌的不良后果
• 消耗营养 • 合成其他产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难 • 改变pH • 分解产物 • 噬菌体破坏极大
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染菌危害的具体分析
• 培养基与设备灭菌不彻底的防治
– 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 – 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 – 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加
消泡剂防止泡沫升顶 – 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 – 灭菌后期罐压骤变 – 死角
18
发酵罐的“死角”
➢法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、 联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件 ➢口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口 ➢发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
➢ 发酵前期染菌
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种
➢ 发酵中期染菌
挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方法应根据各种发酵的特点 和具体情况来决定
➢ 发酵后期污染
➢ 染菌量不太多，可继续发酵
➢ 污染严重，则提前放罐
11
具体情况
柠檬酸发酵
污染细菌
加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制细菌
污染酵母
23
四、培养基及设备灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）分批灭菌与连续灭菌的比较 （五）灭菌技术参数
24
（一）湿热灭菌原理
灭菌温度和时间的选择 影响培养基灭菌的其它因素
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灭菌温度和时间的选择
随着T上升，菌死亡速率增加倍数大于培养基成分分解速率 增加倍数，故一般选择高温快速灭菌 。
• 杂菌分泌较多蛋白质杂质 对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不 利，使水相和溶媒之间极易发生乳化
13
染菌的检查与判断
• 显微镜检查法
镜检出杂菌需要一定时间
• 平板法
平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑
• 肉汤培养检查法 • 发酵过程的异常现象判断
– DO2水平异常变化 – pH异常变化 – 尾气CO2异常变化
染
Hale Waihona Puke 菌 ✓各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所污染的是同一种杂
幅 度
菌，一般是空气系统问题，若个别罐连续染菌，一般是 设备问题。
16
预防12
• 种子带菌的防治
– 灭菌彻底 – 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌
操作可靠 – 保藏可靠
• 过滤空气带菌的防治 • 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
17
预防12
1
本章内容
五四三二一 、、、、、 空培发发概 气养酵酵念 除基工工 菌及业业
设的污 备无染 灭菌的 菌技防
术治 策 略
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
① 染菌对不同菌种发酵的影响 ② 杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响 ③ 不同发酵时期染菌对发酵的影响
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染菌对不同菌种发酵的影响12
细菌
✓ 谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但 噬菌体威胁大。
✓ 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅 速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。
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DO2水平异常变化
1 2
15
污染原因分析
①种子带菌②无菌空气带菌③设备渗漏④灭菌不彻底 ⑤操作失误
时 ✓早期污染可能与①②④⑤→接种操作不当有关 间 ✓后期污染可能与③⑤及中间补料有关。
杂 ✓ 耐热芽孢杆菌：与④有关 菌 ✓ 球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关
种 ✓ 霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题 类 ✓ 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
一、概念
灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中 所有有生命物质的过程。 消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以 及容器和器具表面的微生物。 除菌(degermation): 用过滤方法除去空气或液体中的微生 物及其孢子。 防腐(antisepsis): 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的 生长和繁殖 。
• 培养基的物理状态 • 泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌极为
加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母；通风加大，加 速产酸。
污染黄曲霉
加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下降，黄曲霉 自溶。
污染青霉菌
在pH很低下能够生长。提前放罐。
12
杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
• 丝状菌发酵被产酸菌污染 pH不断下降，菌丝大量自溶，发酵液粘度增加，过滤 困难 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮 凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
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影响培养基灭菌的其它因素
• 培养基成分
– 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增加微生物的 耐热性
– 低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，随着浓度增加，保 护作用减弱，当浓度达8%-10%以上，则减弱微生物的耐热性。
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• pH：pH6.0-8.0，微生物最耐热，pH<6.0，H+ 易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促 使其死亡。∴培养基pH愈低，灭菌所需时间愈 短。
霉菌
✓ PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发酵一无所 获。
✓ 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。
9
染菌对不同菌种发酵的影响12
酵母菌
✓ 易污染细菌以及野生酵母菌
疫苗
✓ 无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部废弃。
10
不同发酵时期染菌对发酵的影响
➢ 种子扩大时期染菌
灭菌后弃去
——加强清洗并定期铲除污垢 ➢管路死角 ➢管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
19
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
20
法兰连接不当造成的“死角”
21
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法
22
三、发酵工业的无菌技术方法
• 干热灭菌法 • 湿热灭菌法 • 射线灭菌法 • 化学药剂灭菌法 • 过滤除菌法 • 火焰灭菌法