大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计

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基因工程实验报告

一、实验目的：

本实验旨在掌握基因工程的基本操作技能，了解DNA的提取、PCR扩

增和基因克隆等基本实验过程，并通过实际操作检测转基因植物的存在。

二、实验原理：

1.DNA提取：采用传统的CTAB法提取植物基因组DNA，目的是获得待

测植物样品中的基因组DNA。

2.PCR扩增：选用合适的引物，利用PCR技术将待测基因扩增出来。PCR反应中需要设置阳性对照、阴性对照和试验样品，以确定PCR扩增结

果的可靠性。

3.基因克隆：将PCR扩增得到的目标基因与质粒载体进行连接，再将

重组质粒导入大肠杆菌进行转化培养，最后通过酶切和测序等方法验证目

标基因的克隆成功与否。

三、实验步骤：

1.DNA提取：将待测植物样品加入CTAB提取缓冲液中，酶解并脱脂

植物细胞，通过乙酰酚/氯仿法提取总DNA。

2. PCR扩增：设计合适的引物，进行PCR反应。反应条件通常为94℃预变性5min，然后循环20-35次，每次循环包括94℃变性30s、56-68℃

退火30s、72℃延伸1-2min，最后72℃延伸10min。

3.基因克隆：将PCR扩增得到的目标基因进行酶切，并与质粒载体进

行连接，然后转化大肠杆菌进行培养。通过PCR重放大和酶切验证目标基

因是否成功克隆。

4.验证目标基因：通过测序等方法对目标基因进行验证，判断基因克

隆是否成功。

四、实验结果与分析：

1.DNA提取：从待测植物样品中成功提取到总DNA，并进行酶切分析，可见DNA带状条带。

2.PCR扩增：通过PCR扩增，得到了目标基因的特异性条带，并且也

验证了阳性对照和阴性对照的准确性。

DNA提取及PCR

一、DNA提取的基本步骤
1.材料准备 2.破碎细胞或包膜－内容物释放 3.核酸分离、纯化 4.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 5.核酸溶解在适量缓冲液或水中
二、DNA提取注意事项
1. 材料准备
最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集
液吸出，勿倾倒。
第二部分 PCR技术
PCR
原理
变性
95˚C左右
延伸
适温
退火
Tm-5˚C
19
The mechanism of PCR
Template DNA
5 5
5
Primer 1
5 Primer 2
Cycle 1
5 5
5 5
Cycle 2
5 5
5
5
5
5
5 5
5 5
5 5
Cycle 3
5源自文库
5
5
5
3. 增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）
DNA提取常见问题与对策
问题二：DNA降解。
原因
1. 材料不新鲜或反复冻
融
2. 未很好抑制内源核酸
酶的活性
对
3. 提取过程操作过于剧策

大肠杆菌基因组DNA提取试剂盒(CTAB沉淀法)

大肠杆菌基因组DNA 提取试剂盒(CTAB 沉淀法)

简介：

大肠杆菌（Escherichia coli ，E.coli ）属于革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。周生鞭毛，能运动，无芽孢，能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，几乎占粪便干重的1/3。获得DNA 的量很高，但是纯度一般，但足够用于大多数分子生物学实验。

Leagene 大肠杆菌基因组DNA 提取试剂盒(CTAB 沉淀法)是简便的利用CTAB 取大肠杆菌基因组DNA 的试剂盒，其提取原理是利用蛋白酶K 消化蛋白，CTAB 沉淀多糖，再经加热使蛋白变性与DNA 分离，乙醇沉淀核酸获得基因组DNA ，可进行酶切、PCR 等下游实验。该试剂盒仅用于科研领域，不用于临床诊断或治疗。

组成：

操作步骤(仅供参考)：

1、准备工作：取TE buffer ，加至蛋白酶K 中，充分混匀，配制成20mg/ml 的白酶K 溶

液，可分装成小份，-20保存1年有效。

2、取菌液置于EP 管中，离心，弃上清液。再次加入1.5ml 菌液，重复该步骤一次。

3、加入Eco 裂解液和3μl 白酶K 溶液(20mg/ml)，充分混匀，37℃孵育1h 。

4、加入CTAB 沉淀液，充分混匀，65℃孵育10min 。

5、加入780μl 蛋白清除液，充分混匀，12000g 离心5~10min 。

6、转移上清至新EP 管中，加入2倍体积的Eco 漂洗液，混匀，-20℃放置30min 或过夜。

7、 13000g 离心10min ，弃上清液，加入70%乙醇洗涤沉淀。

大肠杆菌转基因体系建立和植物基因组提取

分子生物学实验报告

学院：生命科学学院

专业年级：生技093

姓名：殷晓杰

学好：2009013452

大肠杆菌转基因体系的建立和植物基因组的提取

摘要：分子生物学是在分子水平研究生命现象的一门学科，主要研究生物大分子的结构、功能和生物合成从而阐明生命现象本质。分子生物学在短短的几十年间经历了一个飞速的发展过程，从探究遗传物质的本质到阐明DNA的双螺旋结构，从蛋白质的序列分析到DNA高通量测序，从生物大分子的基本结构到现在的基因组学、蛋白质组学等等，可以看到分子生物学的伟大前进。于此相伴的是分子生物实验技术的飞速革新和发展。分子生物学成了生命科学研究的基础手段和先进前沿，转基因就是热点之一。本文先是对转基因技术作了一个简单的综述，然后主要是描述了实验室大肠杆菌转基因体系的建立和检测方法。实验材料是含p38质粒的大肠杆菌（实验室命名）和TOP10大肠杆菌（用于制备感受态细胞），最后的检测方法是用的经典的southern bloting。另外，本文最后还简述了植物基因组的提取方法。关键词大肠杆菌转基因体系植物基因组提取

前言分子生物学是在分子水平研究生命现象的一门学科，主要研究生物大分子的结构、功能和生物合成从而阐明生命现象本质。分子生物学在短短的几十年间经历了一个飞速的发展过程，从探究遗传物质的本质到阐明DNA的双螺旋结构，从蛋白质的序列分析到DNA高通量测序，从生物大分子的基本结构到现在的基因组学、蛋白质组学等等，可以看到分子生物学的伟大前进。于此相伴的是分子生物实验技术的飞速革新和发展。分子生物学已然成了生命科学研究的基础手

大肠杆菌质粒DNA提取方法的优选

文章编号:1001-4829(2007)04-0825-04

收稿日期:2007-01-09 基金项目:山东省自然科学基金

作者简介:温建新(1972-),男,山东招远人,博士研究生,研究方向:分子病毒学与基因免疫,3通讯作者。

大肠杆菌质粒DNA 提取方法的优选

温建新

1,3

,李　俊2,周　顺3,任慧英3,刘文华3,邹　玲3,王金宝

(1.山东农业大学动物科技学院,山东泰安　271018;2.山东省农业科学院,山东济南　250000;3.莱阳农学院,山东青岛　265200)

摘　要:采用酚/氯仿少量提取法、异丙醇沉淀法、简便快速的煮沸法以及微波炉法提取细菌质粒,然后分别对各种方法所提取的质粒进行琼脂凝胶电泳分析,并用紫外分光光度计测定其OD 值,对各种方法的优劣性进行全面分析,结果表明异丙醇提取法所提取的质粒DNA 纯度和产量高(其DNA 片段荧光较强,具有清晰的亮带,OD 260/OD 280约为1.77,DNA 样品浓度约为195μg/mL ),且重复性好,具有结果稳定的特点,达到了分子生物学试验要求,适合大多数试验室使用。关键词:质粒;提取方法;优选

中图分类号:S852165+913 文献标识码:A

The O pti m i za ti on of d i fferen t extracti on m ethods of pl a s m i d D NA

W EN J ian 2xin 1,3,L I Jun 2,ZHOU Shun 3,RE N Hui 2ying 3,L I U W en 2hua 3,Z OU L ing 3,WANG J in 2bao 23

细菌基因组DNA提取及分光光度法定量

一、目的

1. 熟悉并掌握SDS裂解法提取细菌基因组DNA的基本方法。

2. 了解基因组DNA的分光光度法定量及荧光检测。

二、原理

基因工程实验所需要的基因组DNA通常要求分子量尽可能大，以此增加外源基因获得率，但要获得大片段的DNA非易事。细菌基因组是环状DNA，在抽提过程中，不可避免的机械剪切力必将切断DNA。因此要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA分子的可能性；分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量，所以提取过程也要尽可能在低温下进行。另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。在提取过程中EDTA的作用就是螯合二价金属离子，起到抑制核酸酶活性的作用。

制备的细菌染色体DNA 必须是高纯度的，以满足基因工程中各种酶反应的需要，制备的样品必须没有蛋白污染，没有RNA，各种离子浓度应符合要求，这些在染色体制备时都应考虑到。大肠杆菌染色体DNA抽提首先收集对数生长期的细胞，然后用离子型表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）及CTAB破裂细胞，SDS具有的主要功能是：(1)溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；(2)解聚细胞膜上的脂类和蛋白质，有助于消除染色体DNA上的蛋白质；(3)SDS 能与蛋白质结合成为R1-O-SO3R2-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它除干净。

“CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，可以从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA”

大肠杆菌基因组DNA的提取方式

一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。

1、实验原理

提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋

白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白和DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降

解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，最后用无水乙醇沉淀DNA。为获得高纯度DNA，操作过程中常加入RNaseA除去RNA。CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解

细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定的程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。

2、实验试剂与仪器

1）实验材料：大肠杆菌

2）实验试剂：

LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/LNaCl，CTAB/NaCl 溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇

3）实验仪器：恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅

大肠杆菌基因组DNA

3-DNA连接酶（Ligase）DNA连接酶能利用ATP或NAD+提供的能量催化多段DNA片段的3’-OH和5’-P

基团之间形成3’，5’-磷酸二酯键，把两个DNA片段连接在一起。OHPOHPHOPHOPPPOHHO连

接酶3-（1）大肠杆菌连接酶1.两种DNA连接酶只能连接粘性末端。（2）T4噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端，还

能连接齐平末端。DNA连接酶的分类3-（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3’端有游离的-OH，

5’端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：NAD+2.连接条件3-

连接酶反应的最佳温度是37?C。3.连接反应的温度1.最佳温度但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。2.实用温度

所以一般采用4~16?C。3-（一）粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。3-（

2）DNA片断与载体的连接依靠粘性末端3-3-ligasenick3-3、定向克隆法定义：DNA用两种不同

的限制性内切酶消化时，产生带有非互补粘性末端的片段，此种片段只能以一个方向插入用相同的两种内切酶消化的载体中。（1）两个非互补

粘性末端的定向克隆（2）一个粘端一个平末端的定向克隆（3）部分粘端填补的定向克隆3-两个非互补粘性末端的定向克隆5 ’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’EcoRIBamH

IAATTCGGCCTAG5’-G3’-CTTAAGATCC-3’

G-5’EcoRIBamHIAATTCGGCCTAG载体DNA

DNA提取及PCR解读

部分mRNA序列
核苷酸一级结构序列数据库： 1 GenBank数据库美国国立生物技术信息中心 (NCBI) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 2 EMBL数据库 3 DDBJ数据库
LOCUS
HUMLAMIN03 6110 bp
DNA
KEYWORDS
source mRNA exon exon
alternative splicing; lamin; lamin A; lamin C; 3 of 3
1..6110 join(L12399:417..772,L12400:45..201,71..196,472..642, 71..196 472..642 /number=3 /number=4
含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集
2. 细胞裂解
适量。细胞过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低匀浆时应保持低温(冰浴中)，匀浆时间应短(30s／次，2次）针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料－－液氮研磨动物组织－－匀浆或液氮研磨组培细胞－－蛋白酶K 细菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠
然后通过沉淀DNA，去除盐类、有机溶剂等杂质，达到纯化DNA的目的。
制备DNA的原则是既要将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净，又要保持DNA分子的完整。
各种试剂的作用

实验一基因组DNA的提取

实验十菌落PCR筛选阳性重组子

【实验目的】

学习利用菌落PCR技术筛选阳性重组子的方法

【实验原理】

细菌细胞内的重组DNA以裸露状态存在。在高温条件下，细菌细胞破裂，细胞内DNA暴露并因高温的作用而变性成为单链状态的DNA，此时该DNA可作为模板用于PCR，进而检测该DNA中是否含有重组的外源DNA序列。

【仪器、材料与试剂】

1 仪器

生化培养箱，超净工作台，离心机，PCR仪，电泳仪，电泳槽，连续可调移液器，凝胶成像系统

2 材料

含待检测菌的阳性筛选平板，PCR试剂盒，引物1（primer 1）和引物2（primer 2），PCR管，移液器枪头，ddH2O，电泳级琼脂糖，Tris碱，硼酸。

3 试剂

PCR试剂盒：10X PCR buffer，MgCL2或MgSO4，dNTPs，DNA聚合酶；

primer 1和primer 2：均配成10μmol的使用液；

DNA Marker：根据PCR产物大小确定。

【实验步骤】

1 配制25μL的PCR反应体系

10×buffer 2.5 μL

MgCL2或MgSO4 1.5～2.5μL（若buffer里有，则可不加或少加）

dNTPs（2µmol） 2.5μL

primer 1 (10µmol ) 1μL

primer 2 (10µmol ) 1μL

Taq 酶（或其他用于PCR扩增的DNA聚合酶）1U

ddH2O 补至25μL

最后用移液器挑取筛选平板中的待检测菌落，放入上述反应体系中。

2 PCR程序

配制好反应体系后，将其放入PCR仪中。然后根据最初设计引物时的相关数据，设定PCR程序中的每一步的反应条件。通常设计的反应条件如下：

质粒DNA的提取、定量、酶切及PCR鉴定实验报告

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定

一、实验目的

1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；

2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；

3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；

4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；

5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。

二、实验原理

1.PCR(多聚酶链式反应)

在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。

PCR一次循环的具体反应步骤为：

A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。

B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。

C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。

2.质粒DNA的提取与制备

(1).碱裂解法：

染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：

A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；

B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。

(2).离心层析柱：

A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；

B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；

植物基因组DNA提取及电泳分析 - 西北农林科技大学

实验八植物基因组DNA 提取及电泳分析
实验目的
z 掌握植物基因组DNA提取的一般方法及注意事项。大分子量DNA分子的酶切分析。
实验原理
z 十六烷基三乙基溴化胺（CTAB）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度时,从溶液中沉淀。在本实验方案中，首先通过含有CTAB高盐抽提液使DNA充分溶出，然后加入氯仿使蛋白和细胞碎片沉淀，离心后，溶液分为三层，上层为CTAB与核酸的复合物的高盐溶液，中层为蛋白质和细胞碎片，下层为氯仿。取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。
实验二质粒DNA的提取
z 实验目的 z 学习碱裂解法提取质粒的原理
z 实验原理
z 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，经人工改造的质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。
分子生物学实验技术
西北农林科技大学生命学院生物技术系
实验一细菌的培养
z 实验目的 z 学习细菌的培养方法及培养基的配置。
z 实验原理 z 在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺
少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。 z 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。 z 培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养基。

大肠杆菌基因组DNA提取及荧光定量PCR试验设计

大肠杆菌基因组DNA的提取

一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。

1、实验原理

SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白和DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，最后用无水乙醇沉淀DNA。为获得高纯度DNA，操作过程中常加入RNaseA除去RNA。CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定的程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。

2、实验试剂与仪器

1）实验材料：大肠杆菌

2）实验试剂：

LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/L NaCl， CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇

3）实验仪器：恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达分子实验设计

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达

张历涵2013141241098

彭千2013141241068

一、质粒转化入感受态细胞并培养

1、原理

实验室提供的质粒首先要转入大肠杆菌进行培养与增殖，制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。

所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。

2、实验步骤

2.1 DH-5α和BL-21感受态细胞的制备

（1）将0~4 ℃保存的DH-5α和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37 ℃下250 r/min过夜培养16 h 。

（2）将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37 ℃活化培养2～3 h至OD=0.3～0.5 。

（3）取1.5 mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min, 然后于4 ℃下5000 r/min 离心5 min。弃上清液，沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2缓和悬菌。冰上放置15-30 min后，4 ℃下5000 r/min 离心10 min。

（4）弃上清液，沉淀用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20 ℃冰箱内保存。

实时荧光定量PCR实验设计

提纲•实时荧光定量PCR实验要素

•实时荧光定量PCR实验设计及优化

•复合PCR及基因表达

•SYBR Green 实验tips

实验要素•目标基因：未知样品

•生成标准曲线：标准品梯度

•监控系统故障：阳性对照

•监控污染：阴性对照/基因组对照

•校准生物学误差：看家基因

•降低其余误差：重复实验

样品•模板可以是gDNA、cDNA、质粒、PCR产物；RNA需要反转录成cDNA

•RNA可以直接定量，前提是RT的效率一致

•DNA纯度：OD260/OD280=1.8，可以在1.6 ~ 2.0之间

•DNA用量：0.1 ng -1 ug，最好10-100 ng/rxn

•DNA处理：基因组DNA及质粒DNA

•RNA纯度：OD260/OD280=2.0

•RNA用量：60 ng–2 ug/ RT-rxn；

•RNA处理：DNA酶处理

•cDNA用量：1-100 ng RNA反转录所得cDNA加1 uL/rxn

•注意：100 uL的反转录体系最多可以反转录2 ug 总RNA；如果>2 ug ，分成几管

标准品

不要求：

• 数学关系是抽象的，不要求标准品与目标基因使用相同的DNA • 可以使用相同的DNA （目标基因质粒，目标基因CDNA ）• 也可以使用不同的：PCR 产物、质粒、病毒、人工合成片段……

要求：

• 5点以上

• 浓度已知

• PCR 效率一致，且接近100%

–•仪器一致

–•反应条件一致：循环参数、同一次实验

–•试剂质量一致：模板、引物和探针Tm 值、酶及缓冲液

目的：生成标准曲线，建立CT 值与浓度之间的数学关系

大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计

大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计大肠杆菌是一种常见的细菌，其基因组DNA的提取非常重要，可以用于进一步的分子生物学研究。本文将介绍如何提取大肠杆菌基因组DNA以及如何设计荧光定量PCR试验。

一、大肠杆菌基因组DNA的提取

基因组DNA的提取是分子生物学实验的基础步骤之一、下面是一种常规的大肠杆菌基因组DNA的提取方法：

1. 培养大肠杆菌：从冻存的大肠杆菌液体培养物中取出1 mL，加入含有适量抗生素（如氨苄青霉素或巴龙霉素）的LB培养基中。以250 rpm的速度在37℃下培养12-16小时，直到菌体适量生长。

2.收集菌体：离心培养物，将上清液去除，保留细胞沉淀。

3.溶菌：使用适当的溶解液（如0.2MNaOH/1%SDS溶液），彻底悬浮菌体，并在65℃下孵育5分钟。

4.中和反应：向菌液中加入3M的钾酸溶液，通过中和作用将菌体中的DNA中和沉淀出来。

6.洗涤：用70%乙醇洗涤DNA沉淀。去除乙醇，使菌体中的盐等杂质完全去除。

7. 溶解：用 TE溶液（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）或纯水溶解DNA沉淀。如果需要更高浓度的DNA，可使用低TE溶液（10 mM Tris-HCl, pH 8.0）。

荧光定量PCR（qPCR）是一种通过实时监测PCR反应的荧光强度来定

量分析PCR产物的技术。下面是一种针对大肠杆菌基因组DNA的定量PCR

试验设计：

试验目的：测定大肠杆菌基因组DNA中一些特定基因的拷贝数。

试验步骤：

1.制备PCR反应体系：根据需要测定的基因和引物的特异性设计引物。将PCR反应体系组分按照以下配方进行调配：