大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计
DNA提取及PCR扩增实验报告
PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳刘琳1131428 环境科学一、实验目的1．学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。
2．对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。
二、实验原理1. PCR扩增多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。
在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐热Taq聚合酶及两个合成DNA的引物，而后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。
降低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。
溶液反应温度升至中温（72℃），在Tap酶作用下，用四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。
如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA的量按指数方式扩增。
经过30～40个循环，DNA扩增即可完成。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。
DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
不同构型的DNA分子的迁移速度不同。
该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
三、实验材料仪器：PCR扩增仪、0.2ul薄壁管、1.5ml离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。
试剂：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S全长DNA样本、无菌ddH2O、模板DNA 、TBE、琼脂糖、EB、显色剂。
四、实验步骤1. PCR扩增本次试验选择细菌16S rDNA V3区片段进行扩增。
实验一 大肠杆菌基因组提取
实验一大肠杆菌基因组提取简介大肠杆菌(Escherichia coli)是一种常见的肠道菌，其基因组结构简单，可以用于实验室中的基因工程。
本实验将介绍如何从大肠杆菌中提取基因组DNA，并进行后续的测序和分析。
材料- 大肠杆菌菌株- SDS（1%）- NaCl(5M)- EDTA(0.5M)- 三氯乙酸(CTAB)细胞裂解缓冲液（含Tris-HCl,pH8.0、NaCl、CTAB和EDTA）- 氯仿- 异丙醇- TE缓冲液（pH8.0）- 75%酒精- 100%酒精步骤1. 建立大肠杆菌沙门氏菌联合培养通过将大肠杆菌菌株与沙门氏菌菌株联合培养，可以使大肠杆菌更具韧性，可以在更苛刻的条件下生存。
因此，在进行基因组提取前，可以将大肠杆菌与沙门氏菌一同培养。
具体步骤如下：1.1 从大肠杆菌与沙门氏菌培养基中选择处于对数生长期的菌株；1.2 筛选出同步菌种进行接吻结合；1.3 将大肠杆菌沙门氏菌接种于 LB 培养基中，进行生长，收集状态良好的菌落。
2. 细胞裂解收集培养的大肠菌细胞，经过洗涤后，加入细胞裂解缓冲液中。
在催化剂SDS的作用下，细胞质膜溶解，使DNA释放到缓冲液中。
2.1 用洗液洗细菌达到OD600为0.6时离心6000g， 10分钟；2.2 将上清液倒掉，沉淀用NaCl水洗涤后，离心6000g， 10分钟；2.3 将沉淀重悬于 Tris-HCl 缓冲液中，加入 SDS 、 NaCl和 EDTA，并在65℃下进行快速震荡混匀，直到完全均匀混合。
3. 蛋白酶和RNA酶的处理使用丙酮和氯仿的混合物沉淀DNA，过滤掉蛋白酶和RNA酶。
3.1 向上清液中加入等体积异丙醇，避免产生气泡，盖紧座析管盖，冰上静置10min 。
3.2 离心12000g 10min，弃取上清层。
将沉淀重悬于 TE 缓冲液中，加入20ug/ml RNase 处理，65℃将体系涡旋5min；3.3 加入等体积氯仿，振荡10min，然后离心12000g 10min ，弃取上清液。
实验分子生物学实验大肠杆菌基因组DNA的提取
大肠杆菌基因组DNA的提取生技基地实验目的与要求以大肠杆菌培养物为材料，学习基因组DNA提取的一般方法。
实验原理基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。
利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。
加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。
在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。
一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。
而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可保证包含PCR 所扩增的片段（一般2kb以下）。
不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。
在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。
尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR 反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。
常规实验中从细菌基因组上PCR扩增目的基因时，一般所用的DNA量较少，可以采用较简单的沸水浴裂解法制备少量的DNA。
在短时间的热脉冲下，细胞膜表面会出现一些孔洞，此时就会有少量的染色体DNA从中渗透出来，然后离心去除菌体碎片，上清中所含的基因组DNA即可用于PCR模板。
而对于大量的基因组DNA制备（如Southern Blotting，需大量基因组），可采用试剂盒抽提。
应用于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法
７３４第２８卷第７期第三军医大学学报Ｖ０１．２８，Ｎｏ．７２００６年４月ＡＣＴＡＡＣＡＤＥＭＩＡＥＭＥＤＩＣＩＮＡＥＭＩＬＩＴＡＲＩＳＴＥＲＴＩＡＥＡｐｒ．２００６整㈤莹藏泰｝穷法銎攀型｜｜应用于ＰＣＲ及实时荧光定量ＰＣＲ的细菌ＤＮＡ提取方法文章编号：１０００－５４０４（２００６）０７－０７３４—０２胡晓红１，刘昕２，黄正根２，彭惠民１，袁科２，程英２，高云２（１重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室，重庆４０００１６；２第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室，重庆４０００３８）提要：目的建立特异灵敏的适应于ＰＣＲ及实时荧光定量ＰＣＲ的细菌ＤＮＡ提取方法。
方法于细菌样本离心所得沉淀中加入提取液（２５％Ｃｈｅｌｅｘ一１００，０．５％ＮＰ４０，ＴＥ配制，ｐＨ＝９．０）；５６ｏＣ孵育３０ｍｉｎ；１００℃水浴１０ｍｉｎ；离心后所得上清即为ＤＮＡ。
电泳、ＰＣＲ及Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅＰＣＲ扩增评价该方法的特异性及灵敏度。
结果本方法所提细菌ＤＮＡ电泳条带清晰，未见假阳性，Ｄ（２６０）／Ｄ（２８０）＝（１．７９±０．０３）；ＰＣＲ及Ｒｅａｌ。
ｔｉｍｅＰＣＲ扩增未见假阳性及假阴性，灵敏度达１０１／ｍｌ细菌浓度。
结论本研究细菌ＤＮＡ提取方法特异灵敏，适应于ＰＣＲ及Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅＰＣＲ。
实时荧光定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ．ｔｉｍｅＰＣＲ）技术及一些防污染措施克服了ＰＣＲ中假阳性的问题，但是作为高灵敏度的扩增技术¨１，ＰＣＲ及Ｒｅａｌ．ｔｉｍｅＰＣＲ在应用中却仍存在假阴性的问题，究其原因主要是靶序列的获得不够灵敏，ＤＮＡ未完全暴露。
２Ｊ。
为此我们以细菌为样本，建立了特异灵敏的ＤＮＡ提取方法，以使ＰＣＲ及Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅＰＣＲ得到更好的应用。
１材料与方法１．１材料１．１．１菌种实验所有细菌菌种为西南医院检验科惠赠，哥伦比亚血平板（庞通公司）培养，挑出单菌落，用双蒸水１：１０倍比稀释，取低浓度菌液涂布于血平板，以计数。
实验一大肠杆菌DNA的提取
大肠杆菌总DNA的提取
实验原理：本实验利用溶菌酶和碱裂解液SDS使细胞壁破坏，利用氯仿抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA溶液利用乙醇将DNA沉淀下来。
实验目的：1. 掌握DNA提取的原理和方法；
2. 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法
实验材料：
1.实验菌株：大肠杆菌
2.试剂：TE溶液：Tris•HCl 10 mM，EDTA 1 mM，pH 8.0，
20% SDS：
溶菌酶（50mg/ml）
5M NaCl
氯仿：异戊醇（24：1 v/v）
无水乙醇
0.8%琼脂糖
TAE电泳缓冲液
仪器：离心机，电泳仪
实验步骤：
1)取1.5ml培养好的大肠杆菌培养液与离心管中，7,000 rpm离心5 min，弃上清；
2)加入500ul TE溶液洗涤菌体7,000 rpm离心5 min，弃上清；
3)用360ul TE溶液悬浮菌体，加入20ul 溶菌酶（50mg/ml），37°C保温30min；
4)加入40ul 20 %SDS使其终浓度为2 %，60°C水浴30min。
5)加入110ul 5 M 高氯酸钠使其终浓度为1 M，充分混匀；
6)加入等体积氯仿：异戊醇（24：1 v/v），充分混匀，4°C 12,000 rpm 离心15min，
吸取上清于一新离心管中；
7)加入2倍体积的无水乙醇，混匀后12000rpm 离心10min；
8)弃上清，离心管在空气中自然晾干；
9)加入30-40ul TE溶解DNA；
10)取3-5ul DNA溶液，琼脂糖电泳检测。
大肠杆菌基因组DNA的提取方式
大肠杆菌基因组DNA的提取方式一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。
1、实验原理提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。
在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白和DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。
用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，最后用无水乙醇沉淀DNA。
为获得高纯度DNA，操作过程中常加入RNaseA除去RNA。
CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定的程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖物质分开。
最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
2、实验试剂与仪器1）实验材料：大肠杆菌2）实验试剂：LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/LNaCl，CTAB/NaCl 溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇3）实验仪器：恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅3、溶液配制1）LB液体培养基：细菌培养用胶化蛋白胨10g/L，细菌培养用酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，去离子水。
(搅拌溶解后，用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容100ml，用20/50ml摇瓶分装5瓶，包扎好，在121℃，1.034×105pa高压下蒸汽灭菌20min.)2）TE缓冲液：1MTris溶液（取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加热溶解）1Mtris-HClpH8.0溶液（取1MTris溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8.0（需浓盐酸约8.5ml），加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用）TE缓冲液（10mMTris-HCl1MmEDTApH=8.0，1MTris-HClBufferPH=8.05ml0.5MEDTAPH=8.01ml向烧杯中加入约400mlddH2O均匀混合;将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌，室温保存）3）蛋白酶K：（20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水，-20℃备用）4）CTAB/NaCl溶液：（5%w/v，5gCTAB溶于100ml0.5MNaCl溶液中，需加热到65℃使之溶解，然后室温保存）4、实验方法步骤1、将大肠杆菌接种到灭菌好的LB培养基中，一级培养过夜，以10%的接种量进行二级培养，培养至对数期（4-6h）。
大肠杆菌dna提取实验报告
大肠杆菌DNA提取实验报告一、引言DNA（脱氧核糖核酸）是构成生物体遗传信息的重要分子，通过提取DNA，可以进行一系列的遗传学研究和实验。
大肠杆菌（Escherichia coli）是常见的一种细菌，它在基因工程和生物技术中具有重要的应用价值。
本实验旨在通过提取大肠杆菌的DNA，了解提取过程及其在实验中的应用。
二、理论基础2.1 DNA提取的原理DNA提取是通过物理、化学等方法将生物样品中的DNA分离出来的过程。
DNA提取的基本步骤包括细胞破碎、蛋白质和RNA去除以及DNA沉淀等。
2.2 大肠杆菌DNA结构大肠杆菌的DNA为环状双链结构，由四种碱基组成：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。
DNA分子具有一定的长度和序列，不同的DNA分子序列决定了不同的遗传特征。
三、实验材料与方法3.1 实验材料•大肠杆菌菌液•细胞裂解液•蛋白酶K•异丙醇•氯仿•氯化钠溶液•等温离心管•离心机•丙酮3.2 实验方法1.取适量的大肠杆菌菌液。
2.向细胞裂解液中加入适量的蛋白酶K。
3.在60摄氏度水浴中孵育30分钟。
4.加入等体积的氯仿，并充分混合。
5.离心分离水相和有机相。
6.将上清转移至新的离心管中。
7.加入等体积的异丙醇，并充分混合。
8.离心分离水相和有机相。
9.除去上清，加入氯化钠溶液，混匀。
10.加入等体积的冷异丙醇，混合后离心。
11.除去上清，加入丙酮洗涤。
12.最后离心去除丙酮。
四、实验结果与分析4.1 DNA提取过程观察在实验过程中，观察到细胞裂解液与大肠杆菌菌液接触后，出现了白色混浊的现象。
随着实验进程的推进，通过离心可以看到分离出的水相和有机相，其中水相呈现透明状，而有机相则呈现为混浊的白色液体。
4.2 DNA纯度检测通过使用紫外-可见分光光度计对提取得到的DNA进行检测，测得的吸光度比值（A260/A280）为1.8，表明DNA的纯度较高。
4.3 DNA浓度测定利用光度法对提取得到的DNA溶液进行浓度测定，测得DNA浓度为50 ng/μL。
实验大肠杆菌基因组DNA的提取
实验大肠杆菌基因组DNA的提取
大肠杆菌基因组DNA的提取
1．吸1ml大肠杆菌DH5α至1.5 ml离心管中，10000rpm离心30秒；
2．吸干上清液，菌体充分悬浮于0.5 ml裂解液（10 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% SDS, pH8.0）;
3．加12.5 μl 10 mg/ml proteinase K, 混匀，37℃水浴1小时；4．加250 μl 6 M NaCl, 剧烈振荡30秒；
5．冰浴10 min后9500rpm离心10min;
6．转移500 μl上清至1.5 ml离心管中，加1 ml无水乙醇，颠倒混匀直至看清沉淀；
7．10000rpm离心5min, 吸干上清，沉淀溶于300μl水中；8．加15μl 2 mg/ml RNaseA, 混匀，37℃水浴1小时；9．加150μl 饱和酚及150μl氯仿，振荡10秒后10000rpm 离心1 min；
10．上清转移到1.5 ml离心管中，加2.5倍体积无水乙醇,混匀；11．10000rpm离心2min, 吸干上清，沉淀用0.5 ml 70%乙醇洗涤一次，吸干乙醇，室温晾干(~10 min)；
12．沉淀溶于300μl水中，取10μl电泳观察，其余置-20℃冻存备用。
一种大肠杆菌质粒dna的提取方法
一种大肠杆菌质粒dna的提取方法
1. 大肠杆菌菌株
2. TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA），pH 8.0
3. 酒精
4. CTAB（阳离子表面活性剂）
5. 水浴
6. 异丙醇
7. 丙酮
8. 离心管和离心机
步骤:
1. 用TE缓冲液预培养大肠杆菌菌株，使其处于对数生长期，收集细胞，洗涤一次以去除培养基。
2. 向菌体中加入2 mL CTAB缓冲液（10% CTAB, 0.7 M NaCl, 10 mM EDTA，50 mM Tris-HCl,pH 8.0），在水浴中加热65℃，混匀加热15分钟。
3. 加入等体积的酒精，混匀，放置室温某段时间，待上层液相变混浊时轻轻倒掉液相，接着加入70%酒精，小心混匀定格，离心收集菌体沉淀。
4. 加入1 mL TE缓冲液重悬细胞沉淀，加5 μL RNaseA（10 mg/mL）,放置30分钟于37℃反应，加入平等体积的异丙醇和丙酮混匀，使DNA沉淀表面干燥。
5. 用1 ml TE 缓冲液重悬DNA 沉淀，15-20 mins室温扰动，加入100 μL 10% Triton X-100混匀，放置30秒，离心集沉淀，上清即为DNA提取液。
注意事项：
1. 实验过程中需严格操作，以免使其他物质杂质污染DNA。
2. 在离心过程中需控制离心时间和离心速度，以保证DNA 沉淀的是在于上清。
3. 试剂配制后需保存冷藏，使用时应加热至室温后恢复使用。
DNA提取及PCR扩增实验报告
PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳刘琳1131428 环境科学一、实验目的1．学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。
2．对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。
二、实验原理1. PCR扩增多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。
在微量离心管中加入适量缓物DNADNAO、模1.1 0.5 ul 1.2 9个薄1.3 将薄壁管放入PCR扩增仪中，按照预定程序进行PCR扩增。
其中循环过程需要达到30~40次。
程序如下：预变性：94℃3min循环：94℃变性30s55℃退火30s72℃延伸30s末次延伸：72℃5min1.4 PCR扩增完成后，将样品取出并保存于15℃环境中。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验2.1称取0.2g琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入适量的0.5×TBE电泳缓冲液。
然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。
摇匀，待冷却至60℃左右，在胶液内加入适量的EB。
2.2 取有机玻璃制胶板槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。
2.3 待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。
2.4 在槽内加入0.5×TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。
取1μl缓冲液和5μl待测DNA样品混合后，用移液枪滴加至凝胶的加样孔中。
2.5 接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过5V/cm，开始电泳。
点样端放阴极端。
根据经验调节电压使分带清晰。
2.6 观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。
当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止电泳。
2.7 在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。
关上样品室外门，打开紫外灯，通过观察孔进行观察。
9上面一在第2.最好在加完所有其它反应成分后才加模板DNA。
3.配琼脂糖时应使其完全溶化后方可制胶。
4.EB具有致癌作用，配制及使用时应带一次性手套。
实验大肠杆菌质粒DNA的提取与电泳检测
质粒DNA 电泳检测过程示意图
称琼脂糖
加TAE
加热溶解
加EB
灌胶
凝固
பைடு நூலகம்放入电泳槽
加溴酚蓝
点样
电泳
观察拍照
质粒DNA
注意事项
• 溴化乙锭（EB）是一种强诱变剂，致癌物质， 并有中度毒性。接触含有该染料的溶液应带 手套。 • 电泳时凝胶的上样孔端在电泳槽阴极，DNA 从阴极向阳极泳动。
思考题
（1）质粒DNA有哪几种构型？其电泳时的泳 动速率如何？ （2）碱裂解法提取质粒DNA的原理是什么？
实验材料、主要仪器及试剂
• 实验材料 prok2系列质粒 • 主要仪器和用具 超净工作台、振荡培养箱 、 微量移液器、 离心机、涡旋 振荡器、制冰机、 离心管架、 1.5mL离心管、吸头、PE手 套、储冰盒、电泳槽、电源、 微波炉、凝胶成像系统。
• 试剂
（1）溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris· HCl（pH8.0）
实验步骤
2.质粒DNA的提取（碱裂解法） ①将收集的细菌沉淀悬浮于100μ l冰预冷的溶液Ⅰ中，强 烈振荡混匀； ②加入200ul新配的溶液Ⅱ于细菌悬液中，迅速颠倒离心管 5次（不应振荡），以混合内容物，室温放置5min或冰上 放置3min. ③加入150μ l预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒离心管5～10 次，使溶液Ⅲ在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，随后将 管置于冰上5～10min。
10 mmol/L EDTA（pH8.0）
灭菌后4℃保存 （2）溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH 1% SDS（pH值12.6） （3）溶液Ⅲ：5mol/L KAc 60ml 冰乙酸 11.5ml 水28.5ml（pH4.8） （4）LB培养基 （5）琼脂糖 （7）1×TAE电泳缓冲液（pH 8.0）：10 mmol/LTris· Cl 1 mmol/L EDTA
大肠杆菌染色体的DNA的提取
(11)RNase消化完全后加入等体积的苯酚饱和溶 液:氯仿混合溶液(1:1)(各300ml),充分混匀,4℃,15 000rpm离心15分钟,将上清液转移至另一离心管. (12)在上清液中加入0.1倍溶液体积的3M, pH5.5 KAc(约40ml),400ml的–20℃冷冻的异丙醇,充分混 匀,4℃,15 000 rpm离心20分钟. (13)用400ml 75%的冰乙醇洗涤一次,再15000rpm 离心1min,倾去上清,倒扣离心管于滤纸上,稍许凉 干,待用. (14)如需定量或检测制备的质粒DNA的质量,可取 适量质粒DNA进行适当稀释,测定OD260nm和 OD280nm值,计算OD260nm/OD280nm的比值.质 粒双链DNA量可以1 OD260nm=50mg/ml计 算.OD260nm/OD280nm应为1.8左右.
沸水浴法快抽大肠杆菌质粒DNA
(1)在Eppendorf管中加入110ml的STET(使用前加入溶菌酶 至终浓度为5mg/ml)溶液,挑入米粒大小的菌团,充分悬浮并混 匀. (2)上述菌体悬浮液沸水煮20秒. (3)迅速放置于常温下15 000rpm离心15分钟. (4)用牙签挑去菌体碎片(白色沉淀),在上清液中加入100ml的 异丙醇(注意不同样品管中的溶液平衡),充分混匀后15 000rpm离心15分钟. (5)弃上清液,沿管壁四周加入70%冰乙醇400ml洗涤上述所得 DNA样品,完毕后弃上清,管子倒扣10S左右,然后将DNA沉淀 凉干. (6)沉淀凉干后用50ml无菌重蒸水溶解,样品可取5ml酶切电泳 分析或待用.
实验目的了解大肠杆菌染色体的dna的提取方法学会操作其中的一两种学习通过实验现象分析实验结果进一步联系提取方法了解实验器材的使实验用品1台式离心机2电泳设备3凝胶成像系统实验注意方面各种方法的操作不一样不能混淆实验为了更好的操作应该选择操作可行的实验方法
大肠杆菌dna提取实验报告
大肠杆菌dna提取实验报告大肠杆菌DNA提取实验报告一、引言DNA提取是分子生物学实验中的重要步骤，它是从细胞中分离出DNA分子的过程。
大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，其DNA提取方法已被广泛应用于科研和生物工程领域。
本实验旨在通过几个关键步骤，如细胞破碎、蛋白酶处理和酒精沉淀等，提取大肠杆菌的DNA。
二、材料与方法1. 实验材料：- 大肠杆菌培养物（含有目标DNA）- 纯化水- 细胞裂解缓冲液：含有Tris-HCl（pH 8.0）、EDTA和蛋白酶K - 10%SDS溶液- 氯仿/异戊醇混合液- 75%乙酸乙酯- 冷冻乙醇（70%）2. 实验步骤：步骤1：制备大肠杆菌细胞裂解液1）从大肠杆菌培养物中取出适量的菌液，转移到离心管中。
2）对菌液进行离心，以沉淀细胞。
3）弃去上清液，加入适量的细胞裂解缓冲液，并充分悬浮细胞。
4）将细胞裂解液在冰上孵育一段时间，使细胞完全破裂释放DNA。
步骤2：处理蛋白质1）加入10%SDS溶液，使其最终浓度达到0.5%。
2）加入蛋白酶K，使其最终浓度达到0.1mg/ml。
3）在室温下孵育约1小时，以消化蛋白质。
步骤3：DNA沉淀1）加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，并轻轻摇晃离心管混匀。
2）离心分离上清液和有机相。
DNA会富集在有机相中。
3）将上清液转移到新的离心管中，并加入等体积的冷冻乙醇进行沉淀。
4）使用万能托盘或玻璃棒将DNA从溶液中收集起来。
5）用75%乙酸乙酯洗涤DNA沉淀，以去除残留的盐和有机溶剂。
步骤4：最终处理1）将DNA沉淀用纯化水重悬。
2）使用比色计或凝胶电泳等方法检测DNA的质量和浓度。
三、结果与讨论通过上述步骤，我们成功地提取到了大肠杆菌的DNA。
在细胞破碎步骤中，通过离心使细胞沉淀，然后加入细胞裂解缓冲液使细胞完全破裂，并释放出DNA。
在蛋白质处理步骤中，加入SDS溶液和蛋白酶K 可以消化蛋白质，使DNA不受干扰。
大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计
大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计大肠杆菌是一种常见的细菌，其基因组DNA的提取非常重要，可以用于进一步的分子生物学研究。
本文将介绍如何提取大肠杆菌基因组DNA以及如何设计荧光定量PCR试验。
一、大肠杆菌基因组DNA的提取基因组DNA的提取是分子生物学实验的基础步骤之一、下面是一种常规的大肠杆菌基因组DNA的提取方法：1. 培养大肠杆菌：从冻存的大肠杆菌液体培养物中取出1 mL，加入含有适量抗生素（如氨苄青霉素或巴龙霉素）的LB培养基中。
以250 rpm的速度在37℃下培养12-16小时，直到菌体适量生长。
2.收集菌体：离心培养物，将上清液去除，保留细胞沉淀。
3.溶菌：使用适当的溶解液（如0.2MNaOH/1%SDS溶液），彻底悬浮菌体，并在65℃下孵育5分钟。
4.中和反应：向菌液中加入3M的钾酸溶液，通过中和作用将菌体中的DNA中和沉淀出来。
6.洗涤：用70%乙醇洗涤DNA沉淀。
去除乙醇，使菌体中的盐等杂质完全去除。
7. 溶解：用 TE溶液（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）或纯水溶解DNA沉淀。
如果需要更高浓度的DNA，可使用低TE溶液（10 mM Tris-HCl, pH 8.0）。
荧光定量PCR（qPCR）是一种通过实时监测PCR反应的荧光强度来定量分析PCR产物的技术。
下面是一种针对大肠杆菌基因组DNA的定量PCR试验设计：试验目的：测定大肠杆菌基因组DNA中一些特定基因的拷贝数。
试验步骤：1.制备PCR反应体系：根据需要测定的基因和引物的特异性设计引物。
将PCR反应体系组分按照以下配方进行调配：- 模板DNA：5 ng-引物（正向和反向）：0.2μM-qPCR反应缓冲液：根据厂家推荐的浓度加入适量-dNTP混合液：0.2mM-热启动酶：根据厂家推荐的浓度加入适量- ddH2O：适量2.设计合适的PCR程序：-预热：95℃，5分钟-循环：95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，30秒（重复30-40个循环）-最终延伸步骤：72℃，10分钟-保存在4℃下待用3.实施定量PCR试验：-根据样本中DNA浓度的不同，选择适当的试管和引物。
大肠杆菌O157︰H7实时荧光PCR快速检测方法的建立
大肠杆菌Ｏ157︰Ｈ7实时荧光ＰＣＲ快速检测方法的建立（浙江省湖州市疾病预防控制中心，浙江湖州313000）摘要[目的] 利用特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量PCR技术，建立大肠杆菌O157:H7污染的快速敏感特异的检测方法。
[方法] 以大肠杆菌O157H7的rfbE基因作为靶序列，设计一对引物和探针，以大肠杆菌O157H7菌株提取核酸DNA作为模板，优化引物和探针的浓度比和Mg2+浓度，以大肠杆菌O157:H7和10种相7关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性。
[结果] 本研究建立的反应体系在引物和探针的浓度为0.6μmoL/L、0.8μmoL/L；Mg2+浓度为4 mmoL/L时，具有良好的特异性和敏感性。
在10株相关菌株的检测中，除大肠杆菌O157:H7出现很好的阳性外，其余菌株均为阴性。
在纯菌条件下，定量检测低限17cfu/mL。
稳定性分析表明：同一样品重复检测3次Ct值的变异系数均小于5％。
检测样品结果显示Real-time PCR方法较传统方法敏感、快捷、简便。
[结论] 该方法特异性强，稳定性高，操作简便快捷，适应食品微生物检验发展需要，具有较大的推广及应用价值。
标签：荧光定量PCR；TaqMan探针；大肠杆菌O157:H7Construction and primary application of a TAQMAN PCR detection method for detection of escherichia coli O157H7DE Shun-XuYUE Hua-Shen CHENG Ping-Qing (Huzhou Municipal Center for Disease Control and Prevention，Huzhou 313000, China)Abstract[Objective] To establish a rapid sensitive and specific detection method of Escherichia coli O157:H7 with TaqMan PCR. [Methods] To design a pair of primers and probe depending on rfbE gene by way of target sequence of Escherichia coli O157:H7, and apply Escherichia coli O157:H7 of standard bacterium strain for template to appraise Escherichia coli O157:H7. The best Mg2+ concentration. primer and probe ratio were optimized. Specificity，sensitivity and stability analysis test were performed by Escherichia coli O157:H7 and 10 other associated bacteria strains. [Results] The best Mg2+ concentration was 4mmoL/L. Concentretion of primer s and probe was 0.6μmoL/L, 0.8μmoL/L.Test showed that t he probe were highly conservative and specific. The results of all 10 bacteria strains were negative except of strains of Escherichia coli O157:H7.The quantitative detection Limit of the method was 17cfu/mL in pure cultured broth . Stability test show that Co-efficient Variables were all less than 5% in 4 different concentrations. The results show that real-time PCR method is more sensitive, more easier and more faster than conventional culture method for detection of Escherichia coli O157:H7.[Conclusion] Real-time PCR method has high sensitivity and specialty . The real-time PCR is a handy and rapid method. That can be used in food microorganism examination and has great value in practical work.Key words: Real-time PCR; TaqMan-based probe; Escherichia coli O157:H7；肠出血性大肠杆菌(Entero Hemorrhagic E，coli) O157:H7是近10年来认识的一种引起人类出血性结肠炎(Hemorrhagic colitis HC)和溶血性尿毒综合征(Hemolytic uremie syndrom HUS)的肠道致病菌[1]。
从大肠杆菌中制备基因组DNA
从细菌中制备基因组DNA
一材料:
TE缓冲液,
10%SDS十二烷基硫酸钠(SDS)
20mg/mL蛋白酶K(分成单次使用的小份贮存于-20℃)
5mol/LNaCl
CTAB/NaCl溶液：（10%CTAB/0.7mol/LNacl：80mL水中溶解4.1gNacl,缓慢加入CTAB,同时加热搅拌,定溶于100mL）
24:1氯仿/异戊醇
25:24:1酚/氯仿/异戊醇
异丙醇
70%乙醇
步骤:
1.培养5mL的菌液至饱和状态,取1.5mL菌液离心2min.
2.沉淀物中加入567µLTE,用吸管反复吹打使之重悬,
3.30µL10%SDS和3µL20mg/mL的蛋白酶K,混匀,37℃温育1h.
4.加入100µL5mol/LNacl,充分混匀,再加入80µLCTAB/Nac溶液,混匀,65℃温育10min,
5加入.等体积氯仿/异戌醇,混匀, 离心4-5分钟,将上清转入一个新管中。
6.加入等体积酚/氯仿/异戌醇,混匀,离心5min,将上清转入新管中。
7.加入0.6倍体积异丙醇,轻轻沉淀直到DNA沉淀下来,转移到1 mL70%乙醇中洗涤
8.离心5分钟，弃去上清,冻干机稍加干燥，重溶于100µLTE溶解。
大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计
⼤肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计⼤肠杆菌基因组DNA得提取⼀、传统法提取⼤肠杆菌基因组DNA。
1、实验原理提取DNA得⼀般过程就是将分散好得组织细胞在含⼗⼆烷基硫酸钠(SDS)与蛋⽩酶K得溶液中消化分解蛋⽩质,再⽤酚与氯仿/异戊醇抽提分离蛋⽩质,得到得DNA溶液经⼄醇沉淀使DNA从溶液中析出。
SDS得作⽤机理就是由于其能结合蛋⽩,中与蛋⽩得电性,使蛋⽩质得⾮共价键受到破坏,失去⼆级结构,从⽽变形失活,蛋⽩酶K 或链霉蛋⽩酶E均为光谱蛋⽩酶,其重要特性就是能在SDS与EDTA(⼄⼆胺四⼄酸⼆钠)存在得情况下保持很⾼得活性。
在匀浆后提取DNA得反应体系中,SDS可通过失活蛋⽩破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋⽩与DNA分离;⽽蛋⽩酶K可将蛋⽩质降解成⼩肽或氨基酸,使DNA分⼦完整地分离出来。
⽤酚、酚/氯仿抽提除去蛋⽩质,最后⽤⽆⽔⼄醇沉淀DNA。
为获得⾼纯度DNA,操作过程中常加⼊RNaseA除去RNA。
CTAB(⼗六烷基三⼄基溴化铵)就是⼀种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在⾼盐溶液中(0、7 mol/L NaCl)就是可溶得,当降低溶液盐浓度到⼀定得程度(0、3 mol/L NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离⼼就可将CTAB核酸得复合物与蛋⽩,多糖物质分开。
最后通过⼄醇或异丙醇沉淀DNA,⽽CTAB溶于⼄醇或异丙醇⽽除去。
2、实验试剂与仪器1)实验材料:⼤肠杆菌2)实验试剂:LB液体培养基,TE溶液,10%SDS,蛋⽩酶K,5mol/L NaCl, CTAB/NaCl溶液,酚/氯仿/异戊醇,异丙醇,70%⼄醇3)实验仪器:恒温摇床、低温离⼼机、微量移液器、⽔浴锅3、溶液配制1)LB液体培养基:细菌培养⽤胶化蛋⽩胨10 g/L,细菌培养⽤酵母提取物5g/L,NaCl 10g/L,去离⼦⽔。
(搅拌溶解后,⽤5mol/LNaOH调pH⾄7、0、⽤去离⼦⽔定容100ml,⽤20/50ml 摇瓶分装5瓶,包扎好,在121℃,1、034×105 pa⾼压下蒸汽灭菌20min、)2)TE缓冲液:1M Tris 溶液(取Tris242、2g,加ddH2O⾄1600ml,加热溶解)1M trisHCl pH8、0 溶液(取 1M Tris 溶液160ml⽤分析纯盐酸调⾄Ph=8、0(需浓盐酸约8、5ml),加ddH2O定容⾄200ml,⾼压灭菌备⽤)TE缓冲液(10 mM TrisHCl 1Mm EDTA pH=8、0,1M TrisHCl Buffer PH=8、0 5ml0、5M EDTA PH =8、0 1ml向烧杯中加⼊约400mldd H2O均匀混合;将溶液定容到500ml后,⾼温⾼压灭菌,室温保存)3)蛋⽩酶K:(20mg蛋⽩酶K溶于1ml⽆菌双蒸⽔,20℃备⽤)4)CTAB/NaCl溶液:(5% w/v,5gCTAB溶于100ml 0、5M NaCl溶液中,需加热到65℃使之溶解,然后室温保存)4、实验⽅法步骤1、将⼤肠杆菌接种到灭菌好得LB培养基中,⼀级培养过夜,以10%得接种量进⾏⼆级培养,培养⾄对数期(46h)。
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大肠杆菌基因组DNA得提取一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。
1、实验原理提取DNA得一般过程就是将分散好得组织细胞在含十二烷基硫酸钠(SDS)与蛋白酶K得溶液中消化分解蛋白质,再用酚与氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到得DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
SDS得作用机理就是由于其能结合蛋白,中与蛋白得电性,使蛋白质得非共价键受到破坏,失去二级结构,从而变形失活,蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶,其重要特性就是能在SDS与EDTA(乙二胺四乙酸二钠)存在得情况下保持很高得活性。
在匀浆后提取DNA得反应体系中,SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离;而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分离出来。
用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质,最后用无水乙醇沉淀DNA。
为获得高纯度DNA,操作过程中常加入RNaseA除去RNA。
CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)就是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0、7 mol/L NaCl)就是可溶得,当降低溶液盐浓度到一定得程度(0、3 mol/L NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB核酸得复合物与蛋白,多糖物质分开。
最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA,而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
2、实验试剂与仪器1)实验材料:大肠杆菌2)实验试剂:LB液体培养基,TE溶液,10%SDS,蛋白酶K,5mol/L NaCl, CTAB/NaCl溶液,酚/氯仿/异戊醇,异丙醇,70%乙醇3)实验仪器:恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅3、溶液配制1)LB液体培养基:细菌培养用胶化蛋白胨10 g/L,细菌培养用酵母提取物5g/L,NaCl 10g/L,去离子水。
(搅拌溶解后,用5mol/LNaOH调pH至7、0、用去离子水定容100ml,用20/50ml 摇瓶分装5瓶,包扎好,在121℃,1、034×105 pa高压下蒸汽灭菌20min、)2)TE缓冲液:1M Tris 溶液(取Tris242、2g,加ddH2O至1600ml,加热溶解)1M trisHCl pH8、0 溶液(取 1M Tris 溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8、0(需浓盐酸约8、5ml),加ddH2O定容至200ml,高压灭菌备用)TE缓冲液(10 mM TrisHCl 1Mm EDTA pH=8、0,1M TrisHCl Buffer PH=8、0 5ml0、5M EDTA PH =8、0 1ml向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合;将溶液定容到500ml后,高温高压灭菌,室温保存)3)蛋白酶K:(20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水,20℃备用)4)CTAB/NaCl溶液:(5% w/v,5gCTAB溶于100ml 0、5M NaCl溶液中,需加热到65℃使之溶解,然后室温保存)4、实验方法步骤1、将大肠杆菌接种到灭菌好得LB培养基中,一级培养过夜,以10%得接种量进行二级培养,培养至对数期(46h)。
2、取菌液1、5ml置于离心管中,以5000rpm冷冻离心1min,弃上清液3、加190 ul TE悬浮沉淀,并加10 ul 10%SDS,摇匀直至溶液变粘稠4、加入1ul蛋白酶K(20mg/ml),混匀,37℃保温1小时。
5、加30ul 5 mol/L NaCl,混匀。
6、加30ul CTAB/NaCl溶液,混匀,65℃保温20min7、加入300ul酚/氯仿/异戊醇抽提(25:24:1),5000rmp离心10min8、取上清液,加入300ul氯仿/异戊醇(24:1)抽提,5000rmp离心10min9、取上清液,加入300ul得异丙醇,颠倒混匀,室温下静止10min,沉淀DNA,5000rmp离心10min10、加500ul 70%乙醇洗沉淀,5000rmp离心10min11、弃上清液,待酒精挥发尽后加30ulTE溶解12、溶解于20ul TE中,20℃保存。
二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组DNA。
细菌基因组DNA提取试剂盒:1、TGuide细菌基因组DNA提取试剂盒DP30202 50次 420元2、TaKaRa细菌基因组DNA小量纯化试剂盒TaKaRa DV810A 50 650元3、Biomiga 细菌基因组DNA提取试剂盒GD241101 Bacterial gDNA kit 50次 423元GD241102 Bacterial gDNA kit 250次 1798元4、Biospin 细菌基因组 DNA 提取试剂盒BSC12S1 50次 400元BSC12M1 100次 750元5、OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒D335000 E、Z、N、A、TM Bacterial DNA kit 5 210元D335001 E、Z、N、A、TM Bacterial DNA kit 50 980 元D335002 E、Z、N、A、TM Bacterial DNA kit 200 3350元荧光定量PCR试验(标准曲线法) 定量实验就是一种实时实验,用于在聚合酶链反应(PCR) 得每个扩增循环期间测定靶核苷酸序列 (靶)数量。
其中靶可以就是 DNA、 cDNA 或 RNA。
【实验原理】在实时定量实验中,反应就是在PCR 产物得扩增达到固定荧光水平时得循环期间时间点来描述得,而不就是在固定循环次数后累积得PCR 产物最终数量来描述。
扩增曲线以图形形式显示在执行得循环次数中检测到得荧光。
在PCR 得最初几次循环中,荧光信号没有明显变化。
该预定义得PCR 循环范围称为基线。
首先,软件通过计算归一化报告荧光信号强度(与基线循环相对应得 Rn 值)得数学趋势,生成一个基线简化扩增曲线。
然后,算法将搜索扩增曲线上基线校准后归一化报告荧光信号强度 ( delta Rn [∆Rn] 值)与阈值交叉得点。
∆Rn 值与阈值交叉得分数循环定义为 CT。
一、试验设计使用StepOne软件中得Design Wizard(设计导向)创建新实验1、定义实验属性在Experiment Properties (实验属性)屏幕上,输入实验得标识信息,然后选择要设计得实验类型。
1)Experiment Name (实验名称)。
2)Barcode (条码),然后输入您得 PCR 反应板上得条码。
(可不填)3)User Name (用户名)。
4)ments (注释)。
(可不填)5)选择Quantitation (定量)实验类型6)Next> (下一步)2、定义方法与材料在Methods & Materials (方法与材料)屏幕上,选择用于实验得定量方法、试剂、升降温速度与 PCR 模板。
1)将Standard Curve (标准曲线)选为定量方法。
将Standard Curve (标准曲线)选为定量方法。
标准曲线实验确定样本中靶序列得绝对量。
从已知量得稀释序列中构建得标准曲线用于归档结果。
当设置反应板时,标准曲线方法需要靶、标准品与样本。
用于标准曲线实验得 PCR 反应包括以下组分:• 样本－其中靶数量未知得样本。
• 标准品－数量已知得样本。
• 标准品稀释序列－一组用于构建标准曲线得标准品稀释液 (例如,1:2、1:4、 1:8、 1:16、 1:32) 。
• 重复数－含有相同组分与量得相同反应数。
• 阴性对照－含有水或缓冲液得样本,不含模板;也称为“无模板对照(NTC)”。
阴性对照应不会扩增。
2)为试剂选择TaqMan® Reagents ( TaqMan 试剂)(包括两个引物一个探针) 。
–如果使用TaqMan 试剂以检测扩增并定量样本中靶得数量,则选择TaqMan® Reagents ( TaqMan 试剂) 。
TaqMan 试剂包括两个引物与一个TaqMan® 探针。
引物设计用于扩增靶。
TaqMan 探针设计用于杂交靶,并在扩增靶时产生荧光信号。
切记！Applied Biosystems 不建议将TAMRATM 染料随StepOneTM 系统用作荧光报告基团或淬火基团。
–如果使用SYBR Green 试剂以检测扩增并定量样本中靶得数量,则选择SYBR® Green Reagents ( SYBR Green 试剂)。
SYBR Green 试剂包括两个引物与SYBR Green 染料。
引物设计用于扩增靶。
SYBR Green 染料可在结合到双链DNA 时产生荧光信号。
SYBR Green 染料通常就是添加到反应得SYBR Green 母液得一部分。
如果使用SYBR Green 染料:选择Include Melt Curve (包括解链曲线)以执行扩增靶得解链曲线分析。
将Standard (标准)选为升降温速度。
Applied Biosystems 不提供SYBR Green 试剂得 Fast 母液。
3)为升降温速度选择Standard (~2 hours to plete a run) (标准 (约两小时完成运行)) 。
–如果为PCR 反应使用Fast 试剂,则选择Fast (~40 Minutes to plete a Run) (快速 (约 40 分钟完成运行) )。
–如果为 PCR 反应使用标准试剂 (包括 SYBR Green 试剂与 TaqMan 试剂) ,则选择Standard (~2 Hours to plete a Run) (标准 (约 2 小时完成运行)) 。
4)为模板类型选择gDNA (genomic DNA) ( gDNA (基因组 DNA) ) 。
5)Next> (下一步) 。
3、设置靶在 Targets (靶)屏幕上,输入您想在 PCR 反应板中定量得靶数量,然后为每个靶设置检测。
1)单击How many targets do you want to quantify in the reaction plate? (您想在反应板中定量多少靶？)字段,然后输入1(根据需要填)。
注意: 靶检测表中得行数将以您输入得数字更新。
2)选择Set Up Standards (设置标准品)复选框,以为靶检测设置标准品。
建议反应板中得每个靶检测设置一条标准曲线。
注意: Set Up Standards (设置标准品)复选框默认情况下已选取。
3)设置靶 1 检测:a、单击Enter Target Name (输入靶名称)单元格,然后输入RNase P(示例)。
b、从 Reporter (报告基团)下拉菜单中,选择FAM (默认) 。
–如果要将 FAMTM 染料加在您用于检测靶得 TaqMan 探针得5′ 端,则选择FAM。