流式细胞仪检测胞浆内抗原MPO的实验及临床研究

复旦大学硕士生论文流式细胞仪检测胞浆内抗原ＭＰＯ的实验和临床研究摘要目的：评价流式细胞仪（ＦＣＭ）检测胞浆内抗原ＭＰＯ的方法，探讨实验中各因素对检测结果的影响；初步评价ＣＤ３４＋／ＭＰＯ＋／ＣＤ４５一水“表现型在监测急性粒单系白血病微小残留病（ＭＲＤ）Ｏ的意义和价值。

方法：三染色一流式细胞仪（ＦＣＭ）分析结果：１．以髓系细胞株ＨＬ一６０为检测标本，用ＦＣＭ检测胞浆内抗原ＭＰＯ。

在ＦＣＭ上以ＦＳＣ／ＳＳＣ设门，以ＦＳＣ．ＳＳＣ．平均荧光指数（ＭＦＩ）相对荧光指数（ＲＦＩ）为评测指标；经比较，ＦＡＣＳ、．Ｆｉｘ＆Ｐｅｒｍ、Ｆｉｘａｔｉｏｎ＆Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ三种破膜剂中，ＦＡＣＳ破膜剂对细胞的ＦＳＣ／ＳＳＣ．影响最小，ＲＦＩ明显高于其他两种。

同时通过比较其他实验条件（破膜时间，标本放置时间，不同荧光标记）对结果的影响，提出ＦＣＭ检测胞浆内抗原ＭＰＯ的建议方案。

２．检测４１例急性白血病患者，评价ＭＰＯ，其他髓系标志ＣＤｌ３ＣＤｌ４ＣＤｌ５ＣＤ３３ＣＤｌｌ７ｌｙｓｏｚｙｍｅ以及ＣＤ３４＋／ＭＰＯ＋／ＣＤ４５。

ｍ”表现型在急性白血病中的表达情况。

结果表明胞浆内抗原ＭＰＯ对急性粒单系白血病具有高敏感性和特异性，ＣＤ３４在急性白血病中有高表达，且ＣＤ３４＋／ＭＰＯ＋／ＣＤ４５叫“”表现型在急性粒单系白血病中高表达，而淋系白血病中未见表达。

检测２０例正常入骨髓标本，ＣＤ３４＋／ＭＰＯ＋／ＣＤ４５叫““表现型在正常人骨髓中低表达，仅为１０。

左右。

提出ＣＤ３４＋／ＭＰＯ＋／ＣＤ４５刊沛大于１０－４为急性粒单系白血病ＭＲＤ的检出标准。

３．建立急性白血病微小残留病（ＭＲＤ）的细胞模型，采用多参数流式细胞仪（ＭＤ—ＦＣＭ）方法和ＡＰＡＡＰ方法分别检测，表明ＭＤ．ＦＣＭ法比ＡＰＡＡＰ法敏感，前者检测精度可达１０一。

并以ＣＤ３４＋／ＭＰＯ＋／ＣＤ４５＿坩沛为监测指标，监测７例急性粒单系白血病患者，显示与传统细胞形态学监测相比，该方法具有更高的敏感性，更可提早提示复发。

讨论：本实验通过对髓系细胞株ＨＬ一６０来检测胞浆内抗原ＭＰＯ，比较不同破膜复旦大学硕士生论文剂和其他不同实验条件对实验结果的影响，尝试系统评价ＦＣＭ检测胞浆内抗原ＭＰＯ的基本实验方法，并提出ＦＣＭ检测的推荐方案。

与以往文献报告采用临床患者检测不同，本文采用ＨＬ一６０细胞株作为研究对象，细胞株各细胞之间具有齐同性，克服了临床样本之间的差异以及自血病抗原表达的异质性如抗原表达缺失，抗原表达不同步等，使实验结果更为可信。

据我们的实验结果，提出ＦＣＭ检测胞浆内抗原ＭＰＯ的推荐方法如下：样本放置时间在室温下应小于２４小时。

调整样本细胞数为１０×１０９／Ｌ：取１００ｕｌ置于Ｆａｌｃｏｎ管中，加入ＦＡＣＳ破膜剂１×５００ｕｌ，振荡混匀，避光反应１５分钟；加入ＰＢＳ２ｍｌ，３００×ｇ离心５分钟，弃上清；加入ＰＥ标记的ＭＰ０２０ｕｌ，振荡．混匀后避光反应３０分钟左右：加入ＰＢＳ２ｍｌ，３００×ｇ离心５分钟，弃上清；加入ＰＢＳ２ｍｌ，２００×ｇ离心５分钟，弃上清；加入ＰＢＳ０．５ｍｌ重悬浮。

分别以空白管（未加抗体）调整电压，相应阴性对照管划定阴性细胞区域，然后检测标本阳性细胞比例、平均荧光强度算术均值（ＭＦＩ）和平均荧光强度几何均值（ＭＦＩｇｅｏ），计算相对荧光指数ＲＦＩ和ＲＦＩｇｅｏ。

检测急性白血病微小残留病（ＭＩｍ）的指标应在急性白血病中高表达，而在正常人骨髓中低表达或不表达。

临床４１例急性白血病的免疫表型分析显示，ＭＰＯ对急性粒单系白血病具有较高的系列特异性，２４例急性粒单系白血病中２３例表现为ＭＰＯ阳性，达到９５．８％。

ＣＤ３４作为干祖细胞标志，在白血病细胞表面常有较高表达，本实验显示４１例急性白血病中，３６例表达ＣＤ３４，达到８７．８％。

ＣＤ４５／ＳＳＣ比起传统的ＦＳＣ／ＳＳＣ设门可以更好的显示白血病幼稚细胞群。

因此我们推测由ＣＤ３４、ＭＰＯ和ＣＤ４５组合而成的表现型应该在急性粒单系白血病中有较高的表达。

临床病例检测表明ＣＤ３４＋／ＭＰＯ＋／ＣＤ４５叫ｍ“表现型在急性粒单系白血病中有较高的系列特异性，阳性率达到８０％左右。

在正常人骨髓细胞中，ＣＤ３４＋’／ＭＰＯ＋／ＣＤ４５一ｍ“只有极低表达，约１０一５左右。

表明ＣＤ３４＋／ＭＰＯ＋／ＣＤ４５一棚ｊ“确可作为检测微小残留病ＭＲＤ的理想指标。

在用ＣＤ３４＋／ＭＰＯ＋／ＣＤ４５州“表达的ＨＬ－６０细胞株建立的微小残留病细胞模型上，比较ＭＤ．ＦＣＭ方法检测ＣＤ３４＋／ＭＰＯ＋／ＣＤ４５１““与免疫组化方法（ＡＰＡＡＰ法），虽然ＡＰＡＡＰ法可以将形态学和免疫特征相结合，有直观、形象的特点，但其敏感性较ＭＤ—ＦＣＭ差２—３个数量级，ＭＤ．ＦＣＭ可以达到１０一，而ＡＰＡＡＰ法仅有１０～一１０一。

因此流式细胞仪在检测微小残留病时具有更高的灵敏度，作为检测ＭＲＤ方法，比ＡＰＡＡＰ法更适合。

本实验遂利用复旦火学硕士生论文ＣＤ３４＋／ＭＰＯ＋／ＣＤ４５一““来监测急性粒单系白血病患者的微小残留病（ＭＲＤ），ＭＲＤ的检出标准定为１０～。

检测７例ＣＤ３４＋／ＭＰＯ＋／ＣＤ４５“小”表现型的ＡＭＬ患者，显示随着化疗的进行，该表现型细胞逐渐减少。

发现二例患者在白血病复发前ＣＤ３４＋艄Ｐｏ＋／ＣＤ４５刊”阳性细胞增多，提示ＭＲＤ扩大；一例患者在完全缓解期间该表现型消失，但在一月后，再次出现该表现型，其ＭＲＤ复发比临床形态学检测到自血病复发提早约９０天左右。

由于目前国内外没有相应资料来借鉴，因此在临床应用中，需要进一步积累病例，总结经验。

关键词：流式细胞术ＦＣＭＭＰＯ微小残留病（ＭＲＤ）复旦大学硕士生论文ＬａｂｏｒａｔｏｒｙａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＯｆＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃＡｎｔｉｇｅｎＭＰＯＤｅｔｅｃｔｉｏｎｂｙＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＣＭ）ＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｄｅｔｅｃｔｉｎｇｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃａｎｔｉｇｅｎＭＰＯｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＣＭ）．ａｎｄｓｔｕｄｙｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌｆａｃｔｏｒｓａｆｆｅｃｔｉｎｇｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃａｎａｌｙｓｉｓ．ＰｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙａｓｓｅｓｓｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｖａｌｕｅｏｆＣＤ３４＊／ＭＰＯ＋／ＣＤ４５一ｍｉ”ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｔｏｔｙｐｅｆｏｒｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｉｎｉｍａｌｒｅｓｉｄｕａｌｄｉｓｅａｓｅｉｎａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｒｅｅｃｏｌｏｒｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃａｎａｌｙｓｉｓＲｅｓｕＩｔｓ：１．ＴａｋｅｍｙｅｌｏｉｄｃｅｌｌｌｉｎｅＨＬ一６０ａｓｔｈｅｍｏｄｅｌ，ｇａｔｅｔｈｅｃｅｌｌｏｎＦＳＣ—ＳＳＣａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｄｏｔｐｌｏｔｉｎＦＣＭ，ｕｓｅＦＳＣＳＳＣａｎｄａｓｅｍｉ—ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｉｎｄｅｘ－－ｒｅｌａｔｉｖｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｄｅｘ（ＲＦｎ—ａｓｒｅｓｕｌｔｓ．Ｔｈｒｅｅｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙａｖａｉｌａｂｌｅｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ／ｆｉｘａｔｉｏｎｓｏｌｕｔｉｏｎｓｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄ．：ＦＡＣＳ、Ｆｉｘ＆Ｐｅｒｍ、Ｆｉｘａｔｉｏｎ＆Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄＦＡＣＳｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｈａｄｍｉｎｏｒｅｆｆｅｃｔ０ｎｔｈｅｌｉｇｈｔｓｃａｔｔｅｒｐａｔｔｅｒｎｓｏｆｔｈｅｔｅｓｔｄｃｅｌｌｓａｍｐｌｅｓ，ａｎｄｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃａｎｔｉｇｅｎＭＰＯｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｓａｎｄＲＦｌｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｈｉｇｈｅｒ．ｔｈａｎｔｈｅｏｔｈｅｒｔｗｏ．Ｂｙｓｔｕｄｉｎｇｔｈｅｏｔｈｅｒｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌｆａｃｔｏｒｓａｆｆｅｃｔｉｎｇｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｆｉｃａｎａｌｙｓｉｓ．，ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｗａｓｓｙｓｔａｍｌｙｅｖａｌｕａｔｅｄ．ｌｅｕｋｅｍｉａｃａＳｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｅｔｄ．ＭＰＯｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｏｔｈｅｒ２．Ｆｏｒｔｙ－ｏｎｅａｄｕｌｔｓａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄｌｉｎａｇｅｍａｒｋｅｒｓｓｕｃｈａｓＣＤｌｌ７ＣＤｌ３ＣＤ３３ＣＤｌ４ＣＤｌ５Ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄＭＰＯｗａｓｔｈｅｍｏｓｔｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｍａｒｋｅｒｉｎｔｈｅｄｉａｇｏｎｏｓｉｓｏｆａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ．ＣＤ３４＋／ＭＰＯ＋／ＣＤ４５－／ｄｊ”ｐｈｅｎｏｔｙｐｅＷａｓｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ，ｉｔＷａｓｎｏｔｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎａｃｕｔｅｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｔｗｅｎｔｙｎｏｒｍａｌｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ，ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｆｉｃａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄＣＤ３４＋／ＭＰＯ＋／ＣＤ４５－／ｄｉｍｐｈｅｎｏｔｙｐｅｗａｓｖｅｒｙｌｏｗｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｎｏｒｍａｌｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｓ，ｊｕｓｔａｂｏｕｔ１０～．３．Ｗｉｔｈａｃｅｌｌｍｏｄｅｌｏｆｍｉｎｉｍａｌｒｅｓｉｄｕａｌｄｉｓｅａｓｅ，ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆＦＣＭａｎａｌｙｓｉｓｗａｓ４复旦大学硕士生论文ｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｉｔｃｏｕｌｄｒｅａｃｈｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆ１ｐｅｒ１０５ｃｅｌｌｓ．ＴａｋｅＣＤ３４＋／ＭＰＯ＋／ＣＤ４５一，ｄ”ａｓＭＲＤｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｄｅｘ，７ａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄＩｅｕｋｅｍｉａｐａｔｉｅｎｔｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ。

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