SDS-碱裂解法原理
实验一-碱裂解法提取质粒DNA
实验一、碱裂解法提取质粒DNA及检测
一、实验目的与原理简介
实验背景：质粒DNA的提取是基因工程操作中常用的基本技术。质粒作为载体应具备下列四个特点:
①有足够的容纳目的基因的幅度，并且对于携带的目的基因能够借助载体
的复制和调控系统得到忠实的复制与增殖。
②在非必要的DNA克隆区有多种限制性核酸内切酶的单一识别位点，易于
基因片段与载体的连接、重组与筛选。
③与宿主细胞有相同一个或多个遗传表型（如抗药性、营养缺陷型或显色
表型反应等)。
④拷贝数多,易于宿主细胞的DNA分开，便于分离提纯。
分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA.
实验原理：碱裂解法质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的.在强碱性pH时，染色体线性DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，调节pH值至中性时,变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性纠缠形成网状结构，经过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一直沉淀下来而被除去。
实验目的：提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA的方法。
二．实验试剂
1,SolⅠ100ml： 1M Tris-HCL（pH8.0）2。5ml,0.5M EDTA 2ml, DDW 91ml, 20％
葡萄糖4。5ml( 葡萄糖单独灭,灭完后加入Sol I中），高压灭菌，4°保存.
2,SolⅡ100ml:（新鲜配制，常温使用）10% SDS 50ml, 2M NaOH 50ml.使用前将
SDS碱裂解法原理
SDS碱裂解法原理
SDS碱裂解法是一种常用的蛋白质溶液处理方法，可以有效地将蛋白
质分解为多肽和氨基酸片段。它以十二烷基硫酸钠（SDS）为溶解剂和离
子表面活性剂，利用其疏水性和高电荷密度，使蛋白质在溶液中呈现带负
电荷的形式，从而对蛋白质进行粗化处理和裂解。
SDS是一种表面活性剂，它由疏水烷基链和亲水硫酸盐基团组成。在
水溶液中，SDS的烷基链部分会聚集在一起，形成一个疏水的烷基核。而
硫酸盐基团则向外靠拢，与水分子形成氢键，使整个分子呈肥皂状，也就
是胶束。
在SDS碱裂解法中，蛋白质溶液被加入SDS缓冲溶液中，并在高温下
进行加热。SDS作为胶束结构的疏水核，可以结合到蛋白质的疏水性残基（如疏水性氨基酸，如苏氨酸、脯氨酸等），通过电荷作用力使蛋白质呈
现部分解离的状态。此时，SDS会插入到蛋白质的二级结构中，将其展开，破坏氢键和其他非共价交联，使蛋白质的整体结构变得松弛。
另外，SDS还具有一定的碱解作用。在高碱条件下，SDS分子中的硫
酸盐基团可以离解出一个负离子，从而形成一个更为疏水的碱性羰基离子。碱性羰基离子可以与蛋白质中的氨基酸残基产生酰胺键的亲核取代反应，
使蛋白质发生断裂并最终分解成多肽和氨基酸片段。
除了碱解作用，SDS碱裂解法中的高温加热也起着重要的作用。高温
可以提高反应速率，促进碱解反应的进行。同时，高温还可以降低蛋白质
的折叠状态，使其更易受到SDS的作用，实现蛋白质的粗化和裂解。
总的来说，SDS碱裂解法利用SDS的电荷作用和碱解作用，结合高温
加热，将蛋白质分解为多肽和氨基酸片段。这种方法在蛋白质研究领域广
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用
(2010-11-11 17:19:05)
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分类：Biology
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质粒
溶液
无水乙醇
大肠杆菌
杂谈
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，下面主要介绍碱裂解法提取质粒DNA的方法。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA
分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA 酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下：
碱裂解法提取质粒
碱裂解法抽提质粒原理
碱裂解法从大肠杆菌制备质粒是分子生物学研究的常规技术，以下碱裂解法制备质粒的原理。碱法质粒抽提用到三种溶液，溶液I：50 mM葡萄糖、25 mM Tris-Cl 、10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II：0.2 N NaOH、1% SDS；溶液III ：3 M 醋酸钾、2 M 醋酸。
1、溶液I的作用对于任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此选用适当浓度和适当pH值的Tris-Cl溶液。加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制DNase的活性和微生物生长。此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。
2、溶液II的作用NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer （双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。SDS也呈碱性，但如果只用SDS，达不到彻底溶解细胞的作用，加入SDS主要为下一步做铺垫。这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
3、溶液III的作用SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS能与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度的盐使沉淀更完全。同时，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀。2 M的醋酸可以中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。基因组DNA一旦发生断裂，小于100 kb的片断，就不容易与PDS共沉淀。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA污染。这一步操作混合均匀后在冰上放置，可以使PDS沉淀更充分。
质粒DNA的提取碱裂解法
质粒DNA的提取（碱裂解法）
实验原理：
碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH 值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。
提取步骤：
1.吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心
2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥
2.加入100μLSolutionⅠ，枪头充分打匀，使细胞重新悬
浮。此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率
3.加入200μL新配制的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀（千万
不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min）。这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
4.加入150μL solutionⅢ，颠倒混匀（温和振荡10秒），
使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀
5.4℃下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的1.5mL
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤碱裂解法是一种常用的方法，用于提取质粒DNA（plasmid DNA）纯化。以下是具体的实验原理和操作步骤。
实验原理：
碱裂解法利用碱性溶液将细菌细胞的细胞壁和细胞膜溶解，使细菌细
胞内的质粒DNA被释放出来。接着，使用中性化剂中和碱性溶液，使DNA
带正电荷，而细胞中的蛋白质则带负电荷，从而能够通过离心将DNA与蛋
白质分离。最后，通过浓缩、洗涤和纯化，得到高质量的质粒DNA。
操作步骤：
1.培养细菌：选取含有质粒DNA的细菌菌株，如大肠杆菌。在含有适
当抗生素的培养基中培养细菌菌株。
2.收获细菌：当菌液呈现较稠的浑浊状态时，收取细菌培养物。使用
离心机将菌液离心，分离菌体沉淀和上清液。将上清液倒掉，保留菌体沉淀。
3.碱裂解：将菌体沉淀溶解于碱性溶液中，如盐酸和十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。轻轻混合并将溶液放入水浴中加热，使细菌细胞壁和细胞
膜被溶解。
4.中和：使用中性化剂，如醋酸，使溶液中的酸性物质中和。这样可
以确保DNA带正电荷，而蛋白质和其他污染物则带负电荷。
5.离心：将溶液离心，在离心过程中，DNA会与细胞内其他分子分离，形成一个DNA沉淀。上清液中含有蛋白质和其他污染物。
6.洗涤：使用洗涤缓冲液，如乙酸盐缓冲液，洗涤DNA沉淀，去除残
留的污染物。
7.纯化：用去离子水溶解DNA沉淀，使其溶解在水中。将溶解的DNA
沉淀通过滤纸等过滤装置过滤掉残余杂质。
8.浓缩：通过酒精沉淀法或其他方法，将DNA溶液浓缩到所需的浓度。
9.检测：使用紫外分光光度计等方法，测定提取的质粒DNA的纯度和
碱裂法小规模提取质粒DNA及琼脂糖凝胶电泳
碱裂法小规模提取质粒DNA及琼脂糖凝胶电泳
一．实验原理
碱裂解抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离目的。在碱性条件下，线性大分子细菌染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构互补链变性解开。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离。当用pH4.8的NaAc高盐缓冲液调其pH值至中性，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中为可溶状态。而染色体DNA不能复性，形成缠连的网状结构。通过离心将细胞碎片，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来被除去，质粒DNA及部分RNA，蛋白质则存在于上清中，再用RNaseA 处理，酚/氯仿抽提和乙醇沉淀而获得质粒DNA。质粒（plasmid）通常指细菌中独立于染色体外，能自主复制的遗传因子，它能够稳定地遗传某些性状。天然的质粒都是环状双链DNA，大小从5kb到400kb不等。质粒虽然独立于染色体外自主复制和遗传，但其复制又依赖于宿主编码的酶和蛋白质复制因子。质粒按照其稳定拷贝数的多少可分为严谨型和松弛型，严谨型质粒在每个细菌细胞中有1～5拷贝，松弛型质粒在每个细菌细胞中可达10～200个，甚至更多拷贝。
1.质粒的结构：
(1)抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene)
ori, Origin of replication)； (2)启始复制子（(3)多克隆位点(MSC, Multiple cloning site or polylinker)
质粒DNA的提取实验
实验六质粒DNA的提取
一、实验目的
通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒
二、实验原理
质粒(Plasmid)是独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。它是一种环状的双链DNA分子，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。
本实验利用SDS碱裂解法提取质粒DNA。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被SDS （十二烷基硫酸钠）包盖。当用K+取代Na＋时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。
三、实验材料与试剂
1、实验材料大肠杆菌（含有携带插入片段的质粒PMD-18T）
2、实验试剂
(1) 溶液Ⅰ：Tris·HCl(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L；
(2) 溶液Ⅱ(新鲜配制) ：NaOH 0.2mol/L,SDS 1%(W/V)；
(3) 溶液Ⅲ(100ml)：5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml；
(4) 氯仿－异戊醇（24：1）；
(5) 异丙醇、70%乙醇；
四、实验步骤
（一）提取质粒
1. 挑转化后的单菌落(含PMD-18T质粒)，接种到20ml含有适当抗生素(Amp)的丰富培养基中(LB培养液)，于37℃剧烈振摇下培养过夜。（由老师完成）
2. 将1.5ml的培养物倒入1.5ml的EP管中，于4 ℃以12000rpm离心1min。
质粒DNA-煮沸法
实验结果：获得质粒DNA（pUC118及pEGFP）
四、注意事项——材料Fra Baidu bibliotek备
使用处于对数期的新鲜菌体（老化 菌体导致开环质粒增加） 培养时应加入筛选压力，否则菌体 易污染，质粒易丢失
尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷 贝或大质粒，则应加大菌体用量 菌株不要频繁转接（质粒丢失）
四、注意事项——细胞裂解
• •
TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase
pH值为8.0，可防止DNA发生酸解
五、质粒DNA提取常见问题 问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？
原 因
1. 2. 3. 4.
1.
请涂布平板培养后，重新挑 选新菌落进行液体培养 可减少菌体用量或增加溶液 的用量 不要频繁转接，每次接种时 应接种单菌落。检查抗生素 使用浓度是否正确。 溶液Ⅱ在温度较低时可能出 现浑浊，臵于37℃保温片刻 直至溶解为清亮的溶液。
质粒DNA－煮沸法 煮沸法原理
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线 状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性， 共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成 沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在 液相中，从而可通过离心将两者分开。
(完整版)碱裂解法提取质粒-配方,最好的说明
碱裂解法提取质粒
一、基本概念
1．质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸（DNA）分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒（plasmid)。质粒上常有抗生素的抗性基因,例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome）,这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子.
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子（简称cccDNA）。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0。5％～3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时,质粒也复制一次，每个细胞内只有1~2个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101.pBR322含有抗四环素基因（Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr),并含有5种内切酶的单一切点。如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将DNA片段插入到HindIII、BamHI或SalI切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有DNA插入片段的
质粒的分离与纯化
质粒的分离与纯化
一、质粒的分离方法
质粒是存在于细菌染色外，可自主复制的双链的小型共价闭合环状的DNA,是基因工程中的重要载体。对质粒的提取与纯化是分子生物学的基本技术，由细菌的培养(质粒DNA的扩增)、细菌的裂解(质粒DNA的释放)及质粒DNA的分离、纯化等3个步骤组成。根据所制备的质粒量的不同，可分为小量(1～2ml)、中量(20~50ml)及大量(500ml)制备，但制备的方法与原理基本相同。经典的方法包括碱裂解法、煮沸裂解法和SDS裂解法等。
(一)碱裂解法
在NaOH存在的强碱性(pH值12.0～12.6)条件下，SDS破坏细胞壁并裂解细胞，同时使宿主细胞的蛋白质及染色体DNA发生变性，而质粒DNA由于其分子量小且缠结紧密不易变性，只要不在碱性条件下存在太久，可在pH值调至中性时，恢复其天然构象。在高钾盐条件下，细胞壁碎片、变性的蛋白质及染色体DNA发生沉淀，离心后可除去，而上清液中的质粒DNA 通过无水乙醇浓缩、沉淀。此方法适用范围广，是最简单和最常用的质粒制备方法。(二)煮沸裂解法
先用TritonX-100和溶菌酶破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA变性，而质粒DNA不变性，通过离心于上清液中收集质粒
DNA。由于此法条件较剧烈，一般只用于小质粒DNA(<15kb)的制备。
(三)SDS裂解法
溶菌酶和EDTA破坏细胞壁，再用SDS裂解去壁细菌，温和释放质粒DNA后用酚/氯仿抽提。此法虽条件温和，但产率不高，可用于制备大于15kb的质
粒DNA。
二、质粒DNA的纯化
SDS碱裂解法原理
碱裂解法质粒提取的原理
碱裂解法从大肠杆菌制备质粒,就是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。下面就是该法的提取原理:
碱法质粒抽提用到三种溶液:
溶液I,50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA,pH 8、0;
溶液II,0、2 N NaOH / 1% SDS;
溶液III,3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
溶液I的作用
任何生物化学反应,首先要控制好溶液的pH,因此用适当浓度的与适当pH值的Tris-Cl溶液,就是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖就是干什么的呢？说起来不可思议,加了葡萄糖后最大的好处只就是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此,如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言,几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖就是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA就是Ca2+与Mg2+等二价金属离子的螯合剂,配在分子生物学试剂中的主要作用就是:抑制DNase的活性,与抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA,无非就就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA,其实也没什么大不了的,只要不磨洋工,只要就是在不太长的时间里完成质粒抽提,就不用怕DNA会迅速被降解,因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天您手上正好缺了溶液I,可不可以抽提质粒呢？实话告诉您,只要用等体积的水,或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的就是,菌体一定要悬浮均匀,不能有结块。
溶液II的作用
这就是用新鲜的0、4 N的NaOH与2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH 稀释制备0、4N的NaOH,无非就是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。其实破细胞的主要就是碱,而不就是SDS,所以才叫碱法抽提。事实上NaOH就是最佳的溶解细胞的试剂,不管就是大肠杆菌还就是哺乳动物细胞,碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解,这就是由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的相变化所导致。用了不新鲜的0、4 N NaOH,即便就是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌,自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒,因为SDS也就是碱性的,只就是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为就是为了让基因组DNA变性,以便沉淀,这就是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问,既然就是NaOH溶解的细胞,那为什么要加SDS呢？那就是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点:第一,时间不能过长,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂;第二,必须温柔混合,不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。
sds碱裂解法制备质粒dna
sds碱裂解法制备质粒dna
SDS碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法。该方法利用定量的SDS和NaOH对细菌细胞进行裂解，使DNA迅速释放。接着，加入适当的中和缓冲液，使DNA回复其天然形态，并去除蛋白质等污染物。最后，通过酒精沉淀法或硅胶柱层析法纯化DNA。
以下是该方法的具体步骤：
1.生长细菌
生长适量细菌菌株并收获细菌：可以选择不同种类、不同来源、不同
体积得到不同量的细菌。
2.裂解细胞壁
将细菌沉淀后加入缓冲液和SDS混合。SDS能够破坏细菌的细胞膜，使细胞壁裂解，从而将DNA释放出来。
3.中和
加入NaOH将溶液pH值升高至12，使DNA形状发生改变，变得易于析出。接着，加入Tris-HCl中和缓冲液降低pH值，恢复DNA天
然形态，并使DNA强度不受影响。
4.去除杂质
通过高速离心将DNA沉淀下来，将上清液与DNA分离。可以采用氯仿提取法以去除蛋白质和其他杂质，专用的富集试剂和离心柱可做更细致的纯化。
5.精华DNA
通过酒精沉淀法或硅胶柱层析法纯化DNA。酒精沉淀法适用于大量DNA纯化，但对于大片段、GC富集的DNA适用。硅胶柱层析法适用于小规模、高质量、片段少的DNA纯化，但成本稍高，操作复杂。
总之，SDS碱裂解法是一种快速，简单的质粒DNA提取方法。由于其便捷的操作和高质量的DNA回收率，它已被广泛应用于基因工程和分子生物学等领域。
碱裂解法提取基因组dna的原理
碱裂解法提取基因组dna的原理
碱裂解法是一种用于提取基因组DNA的方法。其原理是通过碱性条件下，破坏微生物细胞壁和膜，使得DNA从胞内中释放出来，加入酸性物质后使得DNA质粒被还原为单股线形式，最终形成可溶于水的DNA溶液。
具体步骤如下：
细菌分离：利用细菌分离技术，将菌落分离出来，得到单一种类的细菌样品。
细胞收集：将细菌样品转移到离心管中，并进行离心来收集细胞。
碱裂解：使用含有NaOH和SDS（十二烷基硫酸钠）的缓冲液，对细胞进行碱裂解，破坏细胞壁和膜，并释放DNA进入溶液中。
中和：加入氢氯酸（HCl）中和反应液，使溶液变为酸性。
沉淀：将反应液中的DNA沉淀出来，用乙醇洗涤、干燥等步骤进行纯化。
重溶：添加缓冲液或去离子水等溶剂，将DNA溶解于液体中，得到基因组DNA。
碱裂解法提取基因组DNA具有操作简单、适用范围广、获得的DNA量大等优点。由于该方法不需要特殊的设备和试剂，被广泛应用于微生物基因组研究领域中。
DNA提取原理和方法
核酸分离、纯化
多糖的去除：
➢ 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体 积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。
➢ 用多糖水解酶将多糖降解。
➢ 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可 以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。
➢ 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μL DNA液中加入 200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。
• 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
• 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
适用于纯度要求高的实验。
• 磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。
基因组DNA－其它方法
➢ 浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
溶液Ⅰ 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl， pH=8.0 葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉 积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。这一步溶 液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在 后续步骤中被除去
溶液Ⅱ 0.2M NaOH / 1% SDS 破细胞的主要是碱，而 不是SDS，所以才叫碱法抽提。
SDS法DNA提取缓冲液
组份
Tris-HCl
DNA提取原理和方法
应用
机体软组织 动物韧性组织 细菌、酵母 细胞混悬液 培养细胞
3冷热交替法
4低渗裂解 Ⅲ化学法 1有机溶剂
细菌、病毒
红细胞 细菌、酵母
2去垢剂
3酶解法
组织、培养细胞
细菌、酵母
基因组DNA的提取
吸附材料结合法： 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
根据核酸分离纯化方式的不同有：
大提&小提
区别： 1. 大提可以用于大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，而 小提用的菌液量很少，一般1.5-5ml。 2.一般试剂盒中大提比小提多了溶菌酶、异丙醇（回收沉 淀核酸）、LiCl（特异性去除RNA）、含一定量PEG的氯 化物（回收质粒DNA）及乙酸铵等，其作用及目的都是有 利于细菌的裂解和质粒的纯化，所以大提的产物比小提的 量多很多，而且纯度很高。 3.小提一般用于质粒鉴定和对纯度要求不是很高的实验， 大提用于质粒的大量提取和转染等纯度要求很高的实验。
after 24 hr;
Proteinase K :
作用：广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很 高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。
4. Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for
15 min at RT; 5. Spin at 13,000 rpm for 30 min at RT;
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碱裂解法质粒提取的原理
碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。下面是该法的提取原理:
碱法质粒抽提用到三种溶液：
溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；
溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；
溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
溶液I的作用
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl 溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
溶液II的作用
这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH 的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。
溶液III的作用
溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M 的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二
烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液III 加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。
酚/氯仿纯化
不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。这时候如果放到－20℃，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，就能得到好的样品。得到的质粒样品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。
质粒检测
琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。