蛹虫草产纤溶酶活性菌株的筛选及产酶条件的研究

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高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件优化

傅科鹤，范莉莉，陈慧颖，等．高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件优化［Ｊ］．江苏农业科学，２０２１，４９（３）：２１４－２１８．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２１．０３．０３８高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件优化傅科鹤１，２，范莉莉１，２，陈慧颖１，黄　颖１，张同林１（１．南昌师范学院生物系，江西南昌３３００３２；２．地方鸡种遗传改良省级重点实验室／南昌师范学院生物技术研究所，江西南昌３３００３２）摘要：纤维素是自然界中分布最广泛的一种生物质能源，筛选能够高效降解纤维素的菌株对于开发利用这类物质具有重要意义。

从土壤中分离纯化获得一株高产纤维素酶的菌株ＴＷ０６３－３，通过形态学结合分子生物学鉴定得出，该菌株为草酸青霉。

通过单因素优化试验寻找最佳培养条件，然后通过正交试验确定关键因子的最佳参数。

筛选得出最佳培养条件：１５ｇ／Ｌ羧甲基纤维素钠＋２ｇ／Ｌ硝酸铵，ｐＨ值为３．０，２００ｒ／ｍｉｎ培养６ｄ。

在最佳培养条件下，酶活性比优化前提高了３４．１％，达到５２４．４Ｕ／ｍＬ。

研究结果可为生物降解纤维素酶提供一定的理论及应用价值。

关键词：纤维素酶；草酸青霉；培养基优化中图分类号：Ｓ１８２文献标志码：Ａ文章编号：１００２－１３０２（２０２１）０３－０２１４－０５收稿日期：２０２０－０３－１０基金项目：江西省教育厅项目（编号：１５１２５２、ＧＪＪ１６１２３３）；国家自然科学基金地区项目（编号：３１６６００２０）。

作者简介：傅科鹤（１９７６—），男，江西南昌人，博士，讲师，主要从事微生物土壤修复研究。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｋｈｆｕ０１１２＠１６３．ｃｏｍ。

通信作者：范莉莉，博士，讲师，主要从事木霉菌分子遗传研究。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｌｆａｎ３１＠１６３．ｃｏｍ。

纤维素酶能够将自然界中最丰富的生物质能源———纤维素类物质分解成可溶性单糖，从而为大批量生产生物燃料乙醇提供廉价原料［１］。

产纤维素酶细菌的筛选鉴定及产酶条件研究

产纤维素酶细菌的筛选鉴定及产酶条件研究⼴西轻⼯业GUANGXI JOURNAL OF LIGHT INDUSTRY2009年7⽉第7期（总第128期）⾷品与⽣物纤维素是地球上分布最⼴，含量最丰富的碳源物质，对⼈类⽽⾔，它⼜是⾃然界中数量最⼤的可再⽣资源，是永不枯竭的⽣物资源。

纤维素可被纤维素酶降解⽣成葡萄糖，因此纤维素酶研究开发和应⽤是植物质资源再利⽤的主要途径。

微⽣物是纤维素酶的主要来源，据不完全统计，迄今为⽌，国内外共记录了产纤维素酶的菌株⼤约53个属的⼏千个菌株[1]，其中主要有细菌、放线菌和真菌，⽬前研究的最清楚的是霉菌中的⾥⽒⽊霉T.reesei 。

细菌产纤维素酶的产量较少，主要是葡聚糖内切酶，⼤多数对结晶纤维素⽆降解活性，且所产⽣的酶多是胞内酶或吸附在细胞壁上，不分泌到培养液中，增加了提取纯化的难度[1]，因此对细菌的研究较少。

但由细菌产⽣的纤维素酶⼀般为中性或碱性，近⼗年来随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在洗涤、纺织等⽅⾯应⽤前景⼴阔，细菌纤维素酶制剂已显⽰出良好的应⽤性能和巨⼤的经济价值[2]。

我们从青藏⾼原牦⽜粪中分离到⼀株⾰兰⽒阴性菌Ti-bet-YD4600-2，经16S rDNA 序列⽐对分析，Ti-bet-YD4600-2为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.)菌株。

鞘氨醇单胞菌属是Yabuuchi （1990）[3]等通过研究16S rDNA核苷酸序列，胞内脂质中出现的特殊鞘糖脂和辅酶Q 的主要类型，确定的⼀个新属，该属细菌具有着极强的⽣命⼒，分布⼴泛，对除草剂、偶氮染料、多环芳烃等具有较好的降解作⽤，近年来受到⼴泛重视和研究[4]。

１材料和⽅法1.1材料来源通天河（34°49.753N,92°56.142E ）海拔4604m 处取牦⽜粪样品。

1.2培养基[5]分离平板培养基，复筛培养基，滤纸崩解实验培养基，液体摇瓶培养基。

1.3初筛取样品1g 置于装有100mL ⽆菌⽔的三⾓瓶中，摇匀，从三⾓瓶中取1mL 转移到另⼀盛有100mL ⽆菌⽔的三⾓瓶，在25℃和150r /min 下振荡培养2h ，取0.1mL 振荡培养液涂布筛选到以CMC 为唯⼀碳源的培养基平板，倒置恒温25℃培养3~4d ，注意观察菌的⽣长情况，挑取单菌落⽤斜⾯保存。

高产纤维素酶枯草芽孢杆菌的筛选、应用及其产酶条件研究的开题报告

高产纤维素酶枯草芽孢杆菌的筛选、应用及其产酶条件研究的开题报告一、选题背景纤维素在自工业化以来的几代中一直是一种主要的工业原料，它广泛用于造纸、纤维、食品、能源和医疗等众多领域。

但是，由于极高的相对分子质量和非常结实的结构，纤维素仍然很难分解。

在自然界中，仅仅有一些微生物具有自分解纤维素的能力，其中最著名的一类就是被称为纤维素酶制造细菌。

因此，寻找纤维素酶制造菌是生产纤维素酶的关键。

二、研究目的本研究的主要目的是筛选高产纤维素酶枯草芽孢杆菌并研究其产酶条件，以期为纤维素酶的生产提供基础，同时提高纤维素的利用效率。

三、研究内容1. 枯草芽孢杆菌的分离和纤维素酶活性测定采集自然环境中的样本，使用分离纤维素酶菌的方法，鉴定分离出的枯草芽孢杆菌菌株，测定其产酶能力。

2. 枯草芽孢杆菌的识别和鉴定通过分类学的方法来对分离出的枯草芽孢杆菌的鉴定，进一步确定其物种分类、生态环境等信息。

3. 枯草芽孢杆菌在不同产酶条件下的产酶曲线绘制以实验室条件下对枯草芽孢杆菌的不同降解剂量、pH、温度、时间处理，测定产酶活性及其变化趋势，绘制生长曲线和产酶曲线图。

4. 枯草芽孢杆菌的纤维素酶酶学性质研究测定纤维素酶的酶学性质，如酶的稳定性、酶的特异性、抑制剂对酶的反应等，以推断纤维素的最佳酶解体系。

四、研究意义本研究可以筛选出高产纤维素酶枯草芽孢杆菌，并通过分析产酶条件和纤维素酶的酶学性质，为纤维素酶的生产提供理论基础和技术支持。

五、研究方法本研究主要采用以下研究方法：1. 分离纤维素酶菌并测定其产酶能力。

2. 通过分类学的方法来对分离出的枯草芽孢杆菌的鉴定。

3. 以实验室条件下对枯草芽孢杆菌的不同降解剂量、pH、温度、时间处理，测定产酶活性及其变化趋势，绘制生长曲线和产酶曲线图。

4. 测定纤维素酶的酶学性质，如酶的稳定性、酶的特异性、抑制剂对酶的反应等。

六、研究计划1. 9月-10月：采集样本并分离出纤维素酶菌。

2. 11月-12月：对枯草芽孢杆菌进行分类鉴定，测定其产酶能力。

高产纤维素酶青霉菌的筛选及产酶条件的研究

６６１ｍＬ。．８Ｕ／
关键词：纤维素酶；青霉属；液体发酵中图分类号：Ｔ２１２＋５Ｓ０．文献标识码：Ａ文章编号：１０２１（０７２— ００一ｏ０６— ５３２０）００８５
Ｔｈｅｅｃｆｓｒｅｉｇａｄｃｌｒｏｄｔｎｅｒｓａｈｏｃｅｎｎｎｕｔｅｃｎｉｏｓｕｉｏｉｎｃｌｌｓ・ｐｏｕｔｇｐｎｃｌｕｓｒｉｆａｈｇｅｌｏｅ－ｒｄｃｉｅｉｉｍｔｎｕ－ｎｌｉａ
Ｉｏｒｃｉｍｐｆｔ，Ｍｏｉａｅ，Ｍｏｉａｅｃ，Ａｓｒｉｅｅｅｎｌｌｓｉｎｌｃａｅｉｏｐｇｌａ，Ｐｎｅｌｕｌｅｉｉｉｍ．Ｃｌｌｓｒｄｃｉｎｗｓｃｒｅｕｙｓｂｒｅｌｅｌａｅｐｏｕｔａａｒｄｏｔｂｕｍｅｇｄｕｏｉｆｒｎａｉｎｗｔｔｉ一５．Ｔｅｒｓｌｈｗａｅｕｅ．％ｒｃｔｗｐｗｄｒｆａｂｎｓｕ￣ｄ３ＯｅｍｅｔｔｉｓａｎＸｏｈｒｈｅｕｔｓｏｓｔｔｗｓｄ５Ｏｓｈｉｅｓｒｏｅｔｃｒｏｏｉｅａ．％ａｉ８ｎｂａａｅｍｅｓｎｔｏｅｏｒｅ．￣｜ｍｅｏｄｕ６ｍＬ，ｔｅｉｏｕａｏｍｏｎｓ５Ｏ，ｅｃｋａａｉｇｎｓｕｃｎｌｒｏｕｆｍｅｉｍ０ｈｃｌｔｎａｕｔｉ．％ｎｉ
鉴定为半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，青霉属（ｅｉｌｕ。对青霉菌ｘ一５菌株进行发酵培养Ｐｎｅｌｍ）ｉｉ条件的研究结果表明，以５Ｏ．％稻草粉为碳源，３Ｏ．％豆饼粉为氮源，装液量为６ｍ０Ｌ，接种量为５Ｏ，培养．％温度为２６～２ ℃ ，初始ｐ４５～６０８Ｈ．．，培养１０，产酶活力最高，Ｃ２ｈＭＣ酶活为７．２ＵｌＬＰ酶活为５７ｌ／ｌ，ＦＩ

产纤维素酶菌种的筛选与优化

产纤维素酶菌种的筛选与优化一、菌种筛选的原理与方法菌种筛选的原理是通过筛选产纤维素酶活性高、产量大的菌种。

常用的菌种筛选方法有以下几种：1.传统菌种筛选：分离环境中的纤维素降解菌株，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株，再通过多次温育和活性测定，逐步筛选出高活性的菌株。

2.显性菌种筛选：利用纤维素酶结构上保守的区域设计引物，在环境DNA中扩增出纤维素酶基因片段，使用这些基因片段进行克隆构建，然后在宿主中进行表达，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株。

3.基因工程菌种筛选：利用已知纤维素酶的基因进行基因工程，通过载体导入宿主细胞中，通过外源表达基因，从而获得产纤维素酶菌种。

二、菌种优化的原理与方法菌种优化的原理是通过改变菌株基因组或环境条件，提高纤维素酶产量和活力。

常用的菌种优化方法有以下几种：1.自然进化优化：通过长期培养，逐渐挑选出产酶能力强、极端环境适应能力强的突变菌株。

2.诱变优化：利用物理、化学或基因工程等方法对菌株进行诱变，通过筛选获得产纤维素酶能力强、菌株稳定的变种。

3.基因工程优化：利用已知纤维素酶的基因进行基因编程，通过基因工程技术对菌株基因组进行改造，以提高纤维素酶的产量和活力。

三、未来的研究方向1.菌种筛选方法的改进与创新：应综合运用传统筛选、显性筛选和基因工程筛选等方法，发展新的高效、快速的菌种筛选方法。

2.菌种优化技术的优化与提高产量、活性：要通过生理、代谢工程的方法改造纤维素酶产生菌，提高纤维素酶的产量和活力。

3.开发新型纤维素酶菌株：从不同环境中分离筛选出产酶能力强的菌株，进一步发现和研究产纤维素酶的新菌株。

4.提高纤维素酶产量与废弃物转化率的研究：将纤维素酶应用于废弃物转化过程，提高纤维素酶产量和转化率。

综上所述，产纤维素酶菌种筛选与优化的研究是促进纤维素酶应用的关键。

通过不断改进筛选和优化方法，进一步开发新的菌种，提高纤维素酶的产量和活力，将对纤维素酶的应用产生积极的推动作用。

产溶菌酶菌株的筛选和鉴定以及溶菌酶基因的克隆和表达的开题报告

产溶菌酶菌株的筛选和鉴定以及溶菌酶基因的克隆和表达
的开题报告
一、研究背景和意义
溶菌酶是一种重要的水解酶，能够在细菌、植物和动物中发挥重要作用。

溶菌酶能够裂解细菌细胞壁，有着广泛的应用价值，如抗菌剂、食品工业、医药工业等。

因此，对产溶菌酶菌株的筛选和鉴定以及溶菌酶基因的克隆和表达的研究具有重要的现实意义和科学价值。

二、研究内容和方法
本研究拟采用以下方法：
1. 随机采集土壤样品，筛选产溶菌酶的菌株。

首先进行预筛选，将采集的土壤样品通过平板培养进行筛选，然后进行初步鉴定。

2. 筛选到溶菌酶活性较高的菌株后，进行进一步鉴定。

对菌株进行形态鉴定、生理生化特性鉴定以及16S rRNA基因序列分析。

3. 选取菌株的溶菌酶基因全长进行PCR扩增和克隆。

将PCR产物分别克隆到
T/A载体中进行测序，获得目标融合蛋白基因的全长序列。

4. 将溶菌酶基因克隆至表达载体中进行表达。

选取适当的表达宿主菌株，经小试实验筛选合适的表达条件，获得高效表达的目标蛋白。

5. 鉴定表达的目标蛋白。

采用SDS-PAGE对重组蛋白进行分析，Western blot进行检测。

三、预期成果和意义
本研究预期能够筛选到产溶菌酶的菌株，并对其进行鉴定，通过PCR克隆目标融合蛋白基因全长，并将其表达，获得高效表达的目标蛋白。

这将为进一步研究溶菌酶的功能和应用奠定基础。

同时，还能够丰富国内溶菌酶菌株库，为相关领域的研究提供新的菌株资源。

纤维素酶产生菌的筛选-鉴定和产酶条件优化

纤维素酶产生菌的筛选\鉴定和产酶条件优化摘要:采用稀释平板法分离马铃薯瓢虫肠道菌,利用刚果红平板法对产纤维素酶菌株进行初筛,选取透明圈较大的菌株进行摇瓶发酵复筛,根据菌株形态､生理生化特征对菌株进行初步鉴定,通过正交法优化产酶条件｡结果表明,经初筛和复筛得到1株酶活相对较高的菌株B-12,经初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)｡1.25%麦芽浸粉为碳源､1.5%KNO3为氮源､0.2%的NaCl､0.1%的CMC-Na､接种量6%､培养时间44 h为B-12产酶的适宜条件｡优化后发酵液中的内切葡聚糖酶活(CMCA)为111.710 U/mL,较培养44 h后的酶活提高了8.78%;滤纸酶活(FPA)为35.017 U/mL,提高了387.23%;β-葡萄糖苷酶酶活(BGL)为116.799 U/mL,提高了700.38%｡关键词:马铃薯瓢虫;肠道菌;纤维素酶;优化Screening,Identification and Cultural Condition Optimization of Cellulase-producing Strains from the Intestine of Henosepilachna vigintioctomaculata Abstract: The bacteria from the intestine of Henosepilachna vigintioctomaculata were isolated through the pour plate method. They were preliminarily screened using Congo red medium plate method, and then screened according to their cellulase activities by flask shaking fermentation method. The strain was identified based on morphological and physiological characters. In addition, the culture substrates and fermentation conditions were optimized by orthogonal experiment method. A high cellulase-producing strain B-12 was screened from the intestine of H. vigintioctomaculata and it was identified as Bacillus sp.. The best culture conditions were as follows: substrate were 1.25% malt meal, 1.5% KNO3, 0.2% NaCl, and 0.1% CMC-Na, inoculation quantity was 6%, culture time was 44 h. In this condition, the enzyme activity of CMCase, filter paper enzyme (FPA), and β-glucosidase (BGL) were 111.710, 35.017, and 116.799 U/mL respectively, which were 8.78%, 387.23% and 700.38% higher than those of the initial strain respectively.Key words: Henosepilachna vigintioctomaculata; intestinal bacteria; cellulase; optimization地球上的生物资源主要来自光合生物,其中90%以上为木质纤维素类物质,它们代表了生态系统中营养金字塔最庞大的基层[1]｡天然的木质纤维素材料含有纤维素､半纤维素和木质素等｡其中纤维素是地球上最丰富的多糖物质,这类物质是植物细胞壁的主要成分,也是地球上最廉价的可再生资源｡另外,人类活动产生的废弃物中也含有大量的纤维素[2]｡目前,人们对纤维素的降解和利用主要通过纤维素酶的分解来实现｡纤维素酶在再生能源利用方面具有广阔的应用前景,可应用于农业､酿造工业､发酵工业､食品工业以及其他领域[3-9]｡因此研究纤维素酶有着十分重要的意义｡昆虫肠道菌是指能定植于昆虫肠道的微生物,包括土著的昆虫肠道菌和能定植于昆虫肠道环境的微生物[10]｡研究表明一些昆虫肠道菌能帮助昆虫消化食物[10]｡对喜食含纤维素食物的昆虫,我们推测其消化纤维素可能与其肠道菌分泌纤维素酶有关｡马铃薯瓢虫主要为害茄科植物,喜食茄科植物叶片,它消化叶片中的纤维素可能与其肠道菌有关｡本试验从马铃薯瓢虫肠道中分离筛选产纤维素酶菌株并对其产酶条件进行优化,旨在为发现新的纤维素酶高产菌株奠定基础｡1材料与方法1.1材料1.1.1菌株采自浙江省金华市婺城区高村附近马铃薯田地的马铃薯瓢虫肠道中的菌株｡1.1.2培养基①菌种保藏培养基:牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏0.30%,蛋白胨1.00%,NaCl 0.50%,琼脂 1.50%~2.00%,pH值7.4~7.6)｡②初筛培养基:米糠2.00%,NaCl 0.10%,K2HPO4 0.50%,MgSO4·7H2O 0.02%,(NH4)2SO4 0.06%,琼脂1.50%~2.00%,pH值7.0~7.2｡③刚果红纤维素鉴定培养基:羧甲基纤维素钠(CMC-Na)0.30%,NaCl 0.50%,牛肉浸膏0.15%,蛋白胨0.50%,琼脂1.50%~2.00%,pH值7.0~7.2｡④种子培养液:酵母膏 1.00%,蛋白胨 1.00%,NaCl0.50%,CMC-Na 0.50%,pH值7.0~7.2｡⑤液体产酶发酵培养液:配方同种子培养液｡⑥鉴定用培养基:糖发酵试验培养基､葡萄糖蛋白胨水培养基､蛋白胨水解培养基､Simons氏柠檬酸盐培养基､明胶水解试验培养基等｡1.1.3主要试剂葡萄糖､pH值4.6的醋酸缓冲液､DNS､2% CMC-Na底物溶液､0.05%水杨苷的醋酸缓冲液､蛋白胨､牛肉膏等｡1.1.4主要仪器立式电热压力蒸汽灭菌锅,上海中安医疗器械厂生产;LRH-250生化培养箱,上海一恒科技有限公司生产;D-78532台式冷冻离心机,德国Hettich 公司生产;UV-7504紫外可见分光光度计,上海欣茂仪器有限公司生产;SW-CJ-1B 型单人单面净化工作台,苏州净化设备有限公司生产;电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司生产;HH-4数显恒温水浴锅,山东鄞城科源仪器设备厂生产;远红外快速恒温干燥箱,上海跃进医疗器械厂生产｡1.2方法1.2.1纤维素酶产生菌的分离､纯化和初筛马铃薯瓢虫饥饿24 h后,无菌条件下在75%酒精中表面消毒2 min,去离子水漂洗3次,采用稀释平板法分离肠道菌｡待菌长出后用无菌牙签挑选单菌落于刚果红纤维素鉴定培养基上影印2~3皿,37℃下培养2~3 d｡取其中1皿采用刚果红染色法鉴定其产酶能力[11]｡对产生透明圈的菌株进行测量并记录D/d值(D为透明圈直径,d为菌落直径,下同),挑选D/d值大于1的菌株作为初筛菌种,通过连续划线法,分离纯化｡得到的初筛菌株转接到保藏斜面,4℃条件下保藏备用｡1.2.2纤维素酶产生菌的复筛将初筛到的菌株活化后接种于30/250 mL(250 mL 三角瓶装30 mL培养液,下同)种子培养基中,37℃､180 r/min摇床培养过夜｡以2%接种量转接于30/250 mL产酶培养基中,37℃､180r/min培养2~3 d,10 000 r/min冷冻离心10 min,取上清液测定酶活,筛选产纤维素酶最高的菌株｡1.2.3酶活力测定测定方法参照文献[12-16]修正得到｡1)标准曲线绘制｡反应的总体系为3.5 mL,1 mg/mL葡萄糖溶液和去离子水共2 mL,DNS试剂1.5 mL｡取10支试管编号分别为1~10｡分别吸取0､0.2､0.4､0.6､0.8､1.0､1.2､1.4､1.6､1.8 mL葡萄糖溶液至1~10号试管中;然后分别吸取2.0､1.8､1.6､1.4､1.2､1.0､0.8､0.6､0.4､0.2 mL去离子水至相应的1~10号试管中｡向1~10号试管中分别加入1.5 mL DNS试剂｡将上述试管一同沸水浴5 min,冷却后稀释至10 mL,在540 nm下用分光光度计测吸光值,绘制葡萄糖标准曲线｡2)内切葡聚糖酶活力(CMCase activity,CMCA)测定｡取4支干净试管,编号(分别为1~4)后加入1.5 mL底物溶液,并向1号试管中加入1.5 mL DNS溶液以钝化其中的纤维素酶,作为空白对照,比色调零｡4支试管置于50℃水浴中预热5 min,再加入0.5 mL酶液(液体发酵液的离心上清液),50℃水浴30 min后立即向2､3､4号试管加入1.5 mL DNS溶液以终止酶反应｡充分摇匀后沸水浴5 min,取出冷却后,加入去离子水定容至10 mL,充分混匀｡以1号试管为空白对照,540 nm测吸光值,2､3､4号3支试管数值取平均值｡3)滤纸酶活力(FPA)测定｡方法同上,将底物溶液换成1 mL缓冲液和50 mg滤纸,加入的酶液量为1 mL,反应时间为1 h｡4)β-葡萄糖苷酶活力(BGL)的测定｡方法同上,将底物溶液换成1.5 mL含0.05%水杨苷的醋酸缓冲液,反应时间为1 h｡5)酶活定义｡在上述条件下,1 mL粗酶液所产生的1 μg葡萄糖定义为一个酶活力单位(U)｡以上的测定中均已扣除了粗酶液中所含有的还原糖量｡1.2.4产纤维素酶菌株的鉴定①菌株的形态特征:菌株平板培养2~3 d,观察菌落形态特征,菌体形态经染色(革兰氏染色､鞭毛染色､芽孢染色等)后,于显微镜的100倍油镜下观察并照像｡②菌株的生理生化特性:生理生化试验包括糖发酵试验､V. P试验､甲基红试验､吲哚试验､柠檬酸盐利用试验､淀粉水解试验､明胶水解试验等｡1.2.5产酶条件的优化对复筛得到的菌株进行产酶条件的优化试验｡1)摇瓶生长曲线的测定｡在基础培养基的基础上,对复筛得到的菌株测定其在摇瓶培养中的生长曲线和产酶曲线,考察菌体生长状况与菌株产酶能力在时间上的相关性｡2)接种量的确定｡将培养12 h的种子液分别以1%､2%､3%､4%､5%､6%､7%､8%､9%､10%､11%､12%､13%､14%､15%､16%的接种量转接入30/250 mL产酶培养基中,置于37℃,180 r/min摇床培养,测定酶活,考察不同接种量对菌株产酶的影响｡3)培养基成分的优化｡①碳源种类对菌株产酶的影响:分别以1%的CMC-Na､葡萄糖､蔗糖､乳糖､酵母膏､牛肉膏､酵母粉､麦芽浸粉､秸秆汁､米糠作为碳源,摇瓶培养后测定酶活,考察碳源种类对菌株产酶的影响｡②氮源种类对菌株产酶的影响:分别以1%的(NH4)2SO4､NH4NO3､KNO3､蛋白胨､尿素､酵母膏､酪蛋白胨作为氮源,以1%葡萄糖作为碳源,摇瓶培养后测定酶活,考察氮源种类对菌株产酶的影响｡③NaCl浓度水平对菌株产酶的影响:在原始液体产酶培养基的基础上分别加入0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%的NaCl,摇瓶培养后测定酶活,考察NaCl浓度水平对菌株产酶的影响｡④底物(CMC-Na)浓度水平对菌株产酶的影响:在原始液体产酶培养基的基础上分别加入0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%的CMC-Na,摇瓶培养后测定酶活,考察底物浓度水平对菌株产酶的影响｡⑤根据上述试验得到的最适培养基组成,选取L9(34)型正交表设计正交试验,试验因素和水平见表1,以上清液酶活大小为指标,选择最优培养基组成｡2结果与分析2.1纤维素酶产生菌的初筛采用刚果红染色法从瓢虫肠道中分离纯化得到16株透明圈较大的细菌,细菌编号及其D/d值分别为:B-1,6.167;B-35,5.667;B-11,5.000;B-19,4.750;B-9,4.000;B-26,3.750;B-37,3.000;B -27,1.833;B-53,3.000;B-47,2.714;B-36,2.667;B-42,2.571;B-32,2.500;B-46,2.429;B-1 2,2.083;B-10,1.420｡2.2纤维素酶产生菌的复筛对初筛得到的16株菌株进行摇瓶复筛,以CMCA为指标,筛选出B-12､B-10､B-53､B-11等4株产纤维素酶活力较高的菌株,CMCA(3次测定的平均值)分别为76.85､68.85､53.94､71.27 U/mL｡菌株B-12的CMCA最高,该菌株用以后续的试验｡2.3DNS法葡萄糖标准曲线葡萄糖标准曲线如图1所示,得到方程y=0.916 9x-0.110 4,r2=0.991 4｡2.4菌株B-12的初步鉴定2.4.1形态特征菌株B-12在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上菌落较大､圆形､边缘整齐､不透明､乳白色､微隆起､湿润､生长较快｡显微镜观察细胞呈杆状,两头稍平;周生鞭毛,革兰氏染色呈阳性;芽孢椭圆形或柱状,中生或偏端生,芽孢囊不膨大｡2.4.2生理生化特征V.P反应为阴性,吲哚反应､甲基红反应为阳性｡该菌株可利用葡萄糖产酸,能水解淀粉,分解明胶,不能利用柠檬酸盐｡结合形态特征和生理生化特征,参考《伯杰细菌鉴定手册》第八版,将菌株B-12鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)｡2.5产酶条件的优化2.5.1摇瓶生长曲线的确定在原始培养基基础上从发酵开始至72 h,连续取样,在600 nm下测定生物量,离心后取上清液测定酶活,得到与时间相关的该菌株的生长曲线以及产酶曲线(图2､图3)｡由图2､图3可知,在3 h左右菌株进入对数生长期,16 h左右菌株生长开始进入稳定期,44 h以后开始进入衰亡期｡CMCA､FPA､BGL开始时增长较为缓慢,CMCA､BGL在44 h时达到最大值,FPA在47 h时达到最大,综合考虑将最佳培养时间定为44 h｡总体趋势表明菌株B-12的产酶能力与菌体生长状况有耦连相关性｡在44 h时CMCA为102.694 U/mL,FPA为7.187 U/mL,BGL为14.593 U/mL｡2.5.2不同接种量对菌株酶活力的影响不同接种量对菌株酶活力的影响结果见图4｡综合考虑,在接种量为6%时3个酶活指标均较高,CMCA为73.901 U/mL,FPA 为8.232 U/mL,BGL为7.140 U/mL｡因此最佳接种量选择6%｡2.5.3不同碳源对菌株B-12酶活力的影响碳源对微生物生长代谢的作用主要是提供细胞碳架､细胞生命活动所需的能量以及合成产物的碳架｡根据微生物所能产生的酶系不同,不同的微生物可利用的碳源不同｡在产酶培养基的基础上改变不同的碳源检测菌株B-12的产酶情况｡由图5可知,不同种类的碳源对菌株产纤维素酶影响不同,其中麦芽浸粉作为碳源时3个酶活指标均较高,CMCA为74.592 U/mL,FPA为6.778 U/mL,BGL为7.667 U/mL｡因此确定麦芽浸粉作为菌株B-12的产酶培养基的适宜碳源｡2.5.4不同氮源对菌株酶活力的影响氮源是合成菌体蛋白质､核酸及其他含氮化合物的重要组成成分｡不同种类的氮源对菌株的产酶影响结果见图6｡当KNO3作为氮源时,3个酶活指标均较高,CMCA为230.080 U/mL,FPA为101.636 U/mL,BGL 为93.009 U/mL｡因此确定该菌株的产酶培养基的适宜氮源为KNO3(图6)｡2.5.5NaCl浓度对菌株酶活力的影响试验设置了0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%等10个NaCl浓度梯度,在不同NaCl浓度下测定纤维素酶的3个酶活指标｡由图7可知,当NaCl浓度为0.2%时,CMCA活性最高,为75.137 U/mL,FPA和BGL活性相对较高,分别为5.533 U/mL和7.485 U/mL｡因此,NaCl浓度为0.2%时菌株B-12的酶活较大｡2.5.6底物(CMC-Na)含量对菌株酶活力的影响试验测定CMC-Na不同添加量(0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%)时菌株B-12的产酶水平｡由图8可知,当CMC-Na浓度达到0.2%时,CMCA活性最高,为90.043 U/mL,FPA和BGL活性相对较高,分别为7.287 U/mL和7.213 U/mL;表明菌株B-12适宜底物(CMC-Na)浓度为0.2%｡2.5.7最适培养基组成确定选取L9(34)型正交表设计正交试验,以上清液酶活大小为指标,选择最优培养基组成｡对正交试验结果进行极差分析(表2)可以发现对于CMCA酶活而言,主要因素的影响顺序为:麦芽浸粉>NaCl>KNO3>CMC-Na,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.0% KNO3､0.1% NaCl､0.2% CMC-Na｡对于FPA酶活,主要因素的影响顺序为:CMC-Na>NaCl>KNO3>麦芽浸粉,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.5% KNO3､0.2% NaCl､0.1% CMC-Na｡对于BGL酶活,主要因素的影响顺序为:KNO3>CMC-Na>麦芽浸粉>NaCl,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.5% KNO3､0.2% NaCl､0.1% CMC-Na｡综合考虑,最终确定最佳培养基配方为:1.25%麦芽浸粉,1.5%KNO3,0.2%NaCl,0.1% CMC-Na｡此时,CMCA､FPA和BGL分别为111.710 U/mL､35.017 U/mL和116.799 U/mL,较菌株培养44 h时的酶活分别提高了8.78%､387.23%和700.38%｡3讨论利用刚果红平板法初筛得到的透明圈比值大的菌株,其酶活并不一定高｡试验中我们发现菌株B-1的透明圈比值高达 6.167,而菌株B-12的透明圈比值仅为2.083,但从摇瓶发酵复筛结果看,菌株B-12的酶活要高于B-1的｡因此,在筛选纤维素酶高产菌株时,摇瓶发酵复筛是必要的｡我们首次从马铃薯瓢虫肠道中分离得到多株产纤维素酶肠道菌并筛选到1株酶活性较高的菌株B-12,产酶条件经优化后,其CMCA为111.710 U/mL,FPA为35.017 U/mL,BGL为116.799 U/mL｡而采用同样的酶活测试方法,林祥木等[17]从土壤中分离得到的最好的菌株其CMCA为36 U/mL,FPA为31 U/mL,BGL不足41 U/mL｡昆虫是地球生物圈中已知种类最多的一群生物[18,19],昆虫种类､数量及分布范围的多样性意味着昆虫肠道菌的多样性[20]｡研究表明昆虫肠道菌是微生物新种的潜在资源[21,22]｡因此,昆虫肠道菌可能是新高产纤维素酶的广泛来源,而从昆虫肠道菌分离产纤维素酶菌还鲜有报道,亟待研究开发｡参考文献:[1] TOMME P, WARREN R A J, GILKES N R. 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产纤维素酶芽孢杆菌筛选及发酵条件的初步研究

ＰＡ０Ｓ６。
１．复筛——ｃｃｅ１１ ①葡萄糖标准曲线。．２４Ｍｃａ法［￣。ｓ，１３】按参考文献ｌ定并绘制标准曲线。②酶活力测定。样品准备：ｌ２坝０
将芽孢杆菌菌种活化后接种于种子培养基中． ℃ 培养３７
１３２羧甲基纤维素钠（．．ＣＭＣ— ）Ｎａ的配制。２取ｇ羧甲基纤维素钠溶于２００ｍＬ蒸馏水中．浴加热至完全溶解．一层水用纱布过滤。滤液１０取０ｍＬ，入０２ＬＬ的醋酸缓冲液（Ｈ加．ｍｏ／ｐ值为４６２ｍＬ，馏水４ｍＬ混匀，．）０蒸０贮存于冰箱备用（１周后
所有菌种均由四川农业大学生物医学工程实验室保存。
１２培养基．
ＣＭＣ— 培养基（：Ｎａ％）ＣＭＣ— 、白胨０５酵母膏Ｎａ１蛋．、
５ ℃ 水浴锅中预热２ｎ对照管置于沸水浴中１ｍｉ然后０ｍｉ，０ｎ．在４支试管中加入４ｍＬ已预热至５ ℃ 的底物溶液．品管０样置于５ ℃ 水浴准确计时５ｎ取出。每管立即加入ｌ０ｍｉｍＬ２ｌＬ氢氧化钠溶液和２ＬＤＮＳ显色液．ｍｏ／ｍ摇匀后样品管与对照管都置于沸水浴准确计时３ｎ取出．流水迅速冷却，ｍｉ
维普资讯
动物科学
现代农业科技￣０６１月２０件的初步研究
祝小王振华潘康成吴敏峰

产碱性纤维素酶菌株的筛选及酶学性质研究

产碱性纤维素酶菌株的筛选及酶学性质研究摘要：从采集的造纸厂土样中，筛选出ｌ株产碱性纤维素酶酶活力较高的菌株Ｈ－１，经鉴定，该菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌属。

发酵产酶条件和酶学性质研究表明Ｈ－１菌株的适宜发酵条件为：接种量为６％，ｐＨ９．０，温度为３７℃，此条件下的酶活力可达８．６９Ｕ／ｍＬ，是初始酶活力（２．９３Ｕ／ｍＬ）的３倍。

该酶最适反应温度为４０℃，最适反应ｐＨ９．０。

在２５～５５℃，ｐＨ７．０～１１．０仍能保持６０％以上的酶活力，能较好地满足日常洗涤的环境要求。

关键词：碱性纤维素酶（ＣＭＣ酶）；菌株筛选；发酵条件；酶学性质ＳｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆＡｌｋａｌｉｎｅ－ＣｅｌｌｕｌｏｓｅＰｒｏｄｕｃｉｎｇＳｔｒａｉｎａｎｄＳｔｕｄｙｏｎＩｔｓＥｎｚｙｍａｉｃＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎＡｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｒｏｍｓｏｉｌｓａｍｐｌｅｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｐａｐｅｒｍｉｌｌｓ，ｏｎｅｓｔｒａｉｎｃａｌｌｅｄＨ－１ｃａｐａｂｌｅｏｆｄｅｇｒａｄｉｎｇｃｅｌｌｕｌｏｓｅｗａｓｓｃｒｅｅｎｅｄａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＧｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅＢａｃｉｌｌｕｓ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｅｎｚｙｍｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ，ｉｎｏｃｕｌｕｍａｍｏｕｎｔ６％，ｐＨ９．０，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ３７℃．Ｔｈｅｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｕｐｔｏ８．６９Ｕ／ｍＬ，ｗｈｉｃｈｗａｓ３ｔｉｍｅｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅｉｎｉｔｉａｌｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ（２．９３Ｕ／ｍＬ）．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｗｅｒｅａｂｏｕｔ４０℃ａｎｄｐＨ９．０．Ｔｈｅｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｃｏｕｌｄｂｅｍａｉｎｔａｉｎｅｄａｂｏｖｅ６０％ａｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ２５～５５℃ａｎｄｐＨ７．０～１１．０，which ｍｅｅｔｔｈｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆｔｈｅｄａｉｌｙｗａｓｈｉｎｇ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：aｌｋａｌｉｎｅ－ｃｅｌｌｕｌｏｓｅenzyme（ＣＭＣｅｎｚｙｍｅ）；strain sｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ；ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｅｎｚｙｍｅ纤维素酶的研究一般都以有效利用纤维素资源为主，酶作用的ｐＨ多为酸性，当添加到洗涤剂中，由于所处环境为碱性而失去活力，不能发挥作用［１］。

产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定

本科开放项目题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定学生姓名：指导教师：学院：专业班级：2016年3月产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定摘要纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。

据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。

我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。

纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。

但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。

目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。

随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。

采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。

因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。

关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株目录第1章绪论 (1)1.1 实验原理 (1)1.2 实验仪器及试剂 (2)1.2.1 实验材料 (2)1.2.2 实验仪器 (2)1.2.3 培养基 (2)第2章实验步骤 (3)2.1 采样培养 (3)2.2 初筛 (4)2.3 复筛 (4)2.4 酶活的测定 (4)2.4.1原理 (4)2.4.2溶液配制 (4)2.4.3实验步骤 (5)第3章实验结果 (7)3.1 标准曲线的绘制 (7)3.2 菌株复筛结果 (8)3.3 测定纤维素酶活力结果 (9)结束语 (10)参考文献 (11)第1章绪论1.1 实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。

高活性纤维素分解菌株的筛选及其产酶条件的研究

０５、１０ｍＬ、脂２ｇｐ７０７２．ｇ水００琼０、Ｈ．～．．
牛肉膏蛋白胨培养基：肉膏３蛋白胨１ｇ琼脂１ｇ、１０ｍＩ、Ｈ７Ｏ７２牛ｇ、０、ｊ水００ｐ．～．．１１３实验器材高压灭菌锅、温培养箱、微镜、纸等．．．恒显滤
张秀红，张彩琴，张云茹
（西师范大学生命科学学院，西临汾山山０１０）４０４
摘要：本实验采集了不同环境的２ｊ种土样，以滤纸为唯一碳源的赫奇逊培养基进行纤维素用
分解菌的初筛，现香菜地、菜地、草地、菜地里的菌群能很好地分解纤维素，且以细发韭萱菠而菌为主；经ＣＣＮａ平板培养基复筛，果菠菜地土样中的混合菌溶解圈最大最明显，再Ｍ — 结将
酶条件．
１材料与方法
１１材料．
１１１土样菠菜地、．．白菜地、地、草地、菜地、红柿地、萝卜苗地、蓝地、葱萱韭西胡苤小
收稿日期：０２Ｏ — ７２０一１０
作者简介：秀红（９０）女，西襄汾人，西师范大学生命科学学院讲师，士，பைடு நூலகம்要从事微生张１７，山山硕主物的教学与科研工作。

高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究

高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究研究目标本研究旨在筛选高产纤维素酶的菌株，并优化其产酶条件，以提高纤维素降解效率和产酶量。

方法1. 菌种收集与筛选1.收集土壤、水源等环境样品，分离出潜在的纤维素酶产生菌株。

2.通过平板培养和传代培养，筛选出具有纤维素酶活性的菌株。

2. 纤维素酶活性测定1.利用Congo Red染色法测定菌株的纤维素酶活性。

2.选择具有较高纤维素酶活性的菌株作为后续研究对象。

3. 优化产酶条件1.确定最适pH：在不同初始pH值下培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。

2.确定最适温度：在不同培养温度下培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。

3.确定最适碳源：使用不同碳源（如纤维素、木质素等）培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。

4.确定最适氮源：使用不同氮源（如蛋白质、尿素等）培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。

4. 鉴定菌株1.利用生化和分子生物学方法对优选出的菌株进行鉴定，确定其属于哪个科、属、种。

2.利用16S rRNA基因序列分析确定菌株的系统发育关系。

5. 产酶机制研究1.利用电镜观察菌株在不同培养条件下的形态结构变化。

2.利用基因组学方法分析纤维素酶基因在不同条件下的表达情况。

发现1.从环境样品中筛选出了多个具有纤维素酶活性的菌株，其中某一菌株表现出较高的纤维素酶活性。

2.最适pH为7.0，最适温度为50℃，最适碳源为纤维素，最适氮源为蛋白质。

3.经鉴定，该菌株属于纤维素酶产生菌属，并命名为XX菌株。

4.电镜观察发现，在最适产酶条件下，XX菌株的纤维素酶形态结构清晰可见。

5.通过基因组学方法分析，发现XX菌株在最适产酶条件下纤维素酶基因的表达水平较高。

结论1.通过本研究筛选出了一株高产纤维素酶的菌株XX。

2.最适产酶条件为pH 7.0、温度50℃、碳源为纤维素、氮源为蛋白质。

3.该菌株具有潜力应用于纤维素降解和生物质转化领域。

4.通过深入研究其产酶机制，可以进一步优化该菌株的产酶性能和应用前景。

微生物发酵生产纤溶酶及其酶学性质的研究进展

＊收稿日期：０２—０２０８１
２０年第３０２期
根据筛选的纤溶酶产生菌的形态特征、养特培
征、生理生化特征进行菌种鉴定。
１．３酶活测定方法
关键词：纤溶酶；酵；活测定；学性质发酶酶
中图分类号：ＴＱ９０１２．文献标识码：Ａ
ＰｒｇｅｓｏｒｅａｔｏｄＣｈａａｔｒｚｉｎｏｒｓｎＦｅｍｎｔｉｎａｎｒｃｅｉａｔｏ
维普资讯
，）食．
品与崖磅
ＳｉｌｕａｎＦｏｏｄｃ１ｎｎｄＦｒｍｅｌｔｔｔｌｌｎｏｌ
文章编号：６１８２２０）３０７—０１７ —６９（０２０ —０３２
ＡｂｔａｔＴｈｅｍｅｔｔｎａｄａｔｖｔｅｅｔｎａｄｃａａｔｒｚｔｎｏｒｂｉｄｔｎｙｒｎｒｄｃｄｉｔｓｓｒｃ：ｅｆｒｎａｉｎｃ：ｉｙｄｔｃｉｎｈｒｃｅｉａｉｆｆｉｒｎｙｉｅｚｍｅｗｅｅｉｔｏｕｅｎｔｉｏ，ｏｏｃ￣
培养基灭菌一冷却一接人菌种一发酵液一离心
一
收集上清液
溶活性物质的芽孢杆菌、霉菌、孢菌、霉菌。曲镰根
本文就微生物来源的纤溶酶发酵生产、学性质作酶
一
１２２产酶条件选择和优化．．进行碳源、源、氮无机盐等最适培养基配方的确定以及研究ｐ温度、床转速、种量对产酶的Ｈ、摇接影响。韩润林等（００年）２０以恒通气速率为参照对

产纤溶酶菌株的筛选鉴定及其生长条件研究

文章编号：１６７１ — ９６４６（２０１３）０７ｂ一００２８ — ０３
产纤溶酶菌株的筛选鉴定及其生长条件研究
马晶，高玉荣
（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆１６３３１９）
摘要：从酱醅、豆豉原料中筛选高产纤溶酶的菌株，并对其进行鉴定和生长条件的研究。通过酪蛋白平板法初筛和液态发酵复筛，从酱醅、豆豉原料中筛选出１株纤溶酶活力达１９６０Ｕ／ｍＬ的高产菌株Ｍ４。通过个体形态、菌落特６征及生理生化特征将其鉴定为枯草芽孢杆菌纳豆亚种。通过研究液体培养条件对菌株生长的影响，确定菌种液体培养的条件为接种量１．５％，初始ｐＨ值７，转速１６０ｒ／ａｒｉｎ，培养温度３７℃，培养时间１０ｈ。关键词：纤溶酶；筛选；鉴定；生长条件
中图分类号：ＴＱ４６０．１文献标志码：Ａｄｏｉ：１０．３９６９／ｊｉｓｓｎ．１６７１ — ９４６６（Ｘ）．２０１３．０７．０４０
ＳｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄＩｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎｏｆＳｔｒａｉｎＰｒｏｄｕｃｉｎｇＰｌａｓｍｉｎｎｄａｉｔｓＧｒｏｗｔｈＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
第７期（总第３３期）
２０１３年７月
农产品加工（学刊）
ＡｃａｄｅｍｉｃＰｅｒｉｏｄｉｃａｌｏｆＦａｒｍＰｒｏｄｕｃｔｓＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ

纤溶酶高产菌株筛选及其液体发酵条件研究

２实验方法
２１纤溶酶产生菌的分离筛选．
取豆豉等各种待分离食品１，Ｏｇ加入１０ｍ０Ｌ灭菌水中，荡，０振１０℃沸水煮沸５ｍｉ，止片刻后取上层ｎ静
收稿日期：２０ — ９１０７０ —０
基金项目：河南省省属科研单位社会公益项目（６１８２３０４００）１作者简介：周伏忠（９５）男，南浚县人，１６一，河副研究员，硕士，研究方向为微生物发酵工程．
和６～４ｈ在优化条件下，０８．菌株１菌株２液体发酵最高酶活分别为３６４ｍＬ和３９７ｍＬ、０．６ＩＵ／１．６ＩＵ／．
关键词：纤溶酶；菌株筛选；液体发酵
中图分类号：Ｑ９９９３．文献标识码：Ａ
心脑血管疾病是当前危害人类健康，致死亡率最高的疾病之一，中血栓栓塞类疾病如脑栓塞、导其心肌梗塞、肺栓塞等给病患者带来终身痛苦．治疗血栓栓塞类疾病目前最为有效并且可靠的方法是溶栓疗法．然而，统溶栓药物如尿激酶、激酶等具有半衰期短、出血、传链易口服无效等缺点．自从１８９７年日本科学家须见洋行等【ｌ】从ｊ纳豆食品中分离到一种具有强烈纤溶活性的酶即纳豆激酶以来，首先微生物来源的新型溶栓药物的研究开发受到世界各国的普遍重视［４０４２，－１－１１．我国科技人员也从我国各类传统食品如豆豉、酒药

家蚕肠道纤维素酶菌株的筛选及产酶条件的优化研究

基因组学与应用生物学，２０１３年，第３２卷，第２期，第１７７ — １８４页
ＧｅｎｏｍｉｃｓａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｌｏｇｙ，２０１３，Ｖｏ１．３２，Ｎｏ．２，１７７ — １８４
影响，其影响程度由大Ｎｄ，依次为发酵时间、培养基初始ｐＨ、发酵温度、转速。确定菌株ＢＭＣ一２产纤维素酶最优发酵条件为：发酵时间９４．３５ｈ，发酵温度３Ｏ．３ ℃，培养基初始ｐＨ７．０１，转速１７９ｒ／ｍｉｎ。在此条件下，ＣＭＣａｓｅ比活力理论值为２５．８０１Ｕ／ｍｇ，验证值为２５．５２６Ｕ／ｍｇ，较产酶条件优化前提高了１倍，预测模型可靠性高，可应用于菌株ＢＭＣ一２产纤维素酶条件的优化。关键词家蚕，纤维素酶，响应面法，最优发酵条件
ｓｕｉｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅ，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｉｎｉｔｉａｌｐＨｏｆｍｅｄｉｕｍａｎｄｒｏｔａｔｉｏｎａｌｓｐｅｅｄｈａｄｉｎｆｌｕ－
研究报告
ＲｅｓｅａｒｃｈＲｅｐｏｒｔ
家蚕肠道纤维素酶菌株的筛选及产酶条件的优化研究

纤溶酶生产菌株的筛选、诱变及发酵工艺的研究的开题报告

纤溶酶生产菌株的筛选、诱变及发酵工艺的研究的开题报告题目：纤溶酶生产菌株的筛选、诱变及发酵工艺的研究一、研究背景和意义：纤维蛋白溶解酶（Fibrinolytic enzyme，简称纤溶酶）是一种能够溶解纤维蛋白、促进纤维蛋白溶解产物清除的酶类。

具有抗凝、抗炎、抗菌、消肿解毒等多种生物学活性，对心血管病等疾病的治疗具有重要意义。

因此，纤溶酶的研究和开发一直受到广泛关注。

目前，纤溶酶的生产主要依靠微生物发酵技术，而纤溶酶生产菌株的筛选和诱变则是提高纤溶酶产量和活性的重要途径。

同时，在生产过程中优化发酵工艺也是提高纤溶酶产量和活性的关键，因此对纤溶酶生产菌株的筛选、诱变及发酵工艺的研究具有重要意义。

二、研究内容和方法：本研究将以呈现高纤溶酶产能的菌株为基础，对其进行诱变，试图获得更高的纤溶酶产量和活性。

同时，将对不同变异菌株进行筛选，优选出纤溶酶产量和活性较高的菌株，并探索其发酵工艺进行优化。

具体的研究过程将包括以下方面：1. 纤溶酶生产菌株的筛选：根据文献报道，寻找已知纳种中纤溶酶活性较高的菌株作为研究对象，或从样品中分离获得纤溶酶生产菌株进行初步筛选。

2. 诱变：采用物理法和化学法对纤溶酶生产菌株进行诱变，通过比较不同变异菌株的纤溶酶产量和活性来优选变异菌株。

3. 发酵条件优化：对优选的纤溶酶生产菌株进行发酵条件的优化，包括菌种预处理、发酵温度、pH值、培养基配方等。

4. 纤溶酶产量和活性的测定：采用UV吸收光度法测定纤溶酶产量，同时采用凝块酶法和定量法测定纤溶酶活性。

三、预期结果和意义：本研究预期可以有效地筛选和诱变出纤溶酶产量和活性较高的菌株，并且可以优化其发酵工艺，进一步提高纤溶酶的产量和活性。

同时，对纤溶酶的生产技术和应用也将有所贡献。

纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及发酵产酶条件优化

纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及发酵产酶条件优化李争明;张娟;邓中洋;卢凡;秦文胜【摘要】To isolate efficient cellulase-producing bacteria, 180 bacterial isolated from rotten wood, humus, and other soil samples, and 44 were screened from them and confirmed as cellulase-producing bacteria by Gram's iodine solution staining. In the subsequent secondary screening tests, those 44 isolates were cultured in fermentation media and their total cellulase activities(FPase)were measured and compared. The strain J1-3-1, with the highest FPase activity, was identified as Sphingobacterium sp. by 16S rRNA sequence analysis. The optimal fermentation conditions for enzymes production of J1-3-1 were determined. Under the optimal conditions, its activities of FPase, CMCase, and β-glucosidase reached 8.76,28.04和7.02 U/mL, respectively. The results demonstrated that J1-3-1 wasa promising candidate for potential industrial production of cellulase.%以腐烂木材、腐殖土等材料作为菌源,从中分离出180个菌株,以期得到具有纤维素酶活性的菌株.采用革兰氏碘液染色法进行定性初筛,获得了44个纤维素酶产生菌株.将此44个菌株发酵培养后,使用滤纸酶活性测定法进行定量复筛,滤纸酶活性最高的是菌株J1-3-1.通过对J1-3-1菌株的16S rRNA的序列测定分析,将J1-3-1鉴定为鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.).经对J1-3-1进行产酶发酵条件优化,分别确立了产生最高滤纸酶(FPase)活性、内切葡聚糖酶(CMCase)活性和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)活性的发酵条件.在最优发酵产酶条件下,菌株J1-3-1的滤纸酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的最高酶活性分别为8.76、28.04和7.02 U/mL.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2015(031)005【总页数】7页(P146-152)【关键词】纤维素酶产生菌;筛选;鉴定;发酵;鞘氨醇杆菌【作者】李争明;张娟;邓中洋;卢凡;秦文胜【作者单位】湖北工业大学资源与环境工程学院微藻实验室工业发酵湖北省协同创新中心河湖生态修复及藻类利用湖北省重点实验室,武汉 430068;湖北工业大学资源与环境工程学院微藻实验室工业发酵湖北省协同创新中心河湖生态修复及藻类利用湖北省重点实验室,武汉 430068;湖北工业大学资源与环境工程学院微藻实验室工业发酵湖北省协同创新中心河湖生态修复及藻类利用湖北省重点实验室,武汉 430068;湖北工业大学资源与环境工程学院微藻实验室工业发酵湖北省协同创新中心河湖生态修复及藻类利用湖北省重点实验室,武汉 430068;Department of Biology,Lakehead University,Ontario,P7B 5E1,Canada【正文语种】中文随着人口的膨胀和经济的迅猛发展，全球对能源的需求量大幅提升，其中化石燃料占能源消耗的85%以上［1，2］。

蛹虫草纤溶酶液体发酵条件的优化

ｓｌｂｅｓａｃＯｇＬｏｕｌｔｒｈ２／，ｙａｔｅｔａｔ／ｅｓｘｒｃ１ｇＬ，Ｍｇ７ｍｍｏ／０ｌＬ．ＴｅｏｔｍｕｈｐｉｍｎｔｌｐＨｓ６０ａｄｔｅｂｓｉｉｉａｗａ．ｎｈｅｔｆｒｎａｉｎｔｍｅｗａ，ｅｐｃｉｅｙｅｍｅｔｔｏｉｓ４ｄｒｓｅｔｖｌ．Ｋｅｒ：ｒｙｅｓｍｉｉｒｓｆｂｉｏｙｉｎｙｙｗｏｄｓＣｏｄｃｐｌａｉ；ｒｎｌｔｃｅｚｍｅｆｒｅｔｔｎｃｎｉｏｔｉ；ｅｍｎａｉｏｄｔｎｏｉ
０引言
随着人们生活水平的提高，心肌梗塞、脑血栓等血管栓塞性疾病已成为严重危害人类健康的高发病，
目前，溶栓疗法是该类疾病的常规治疗方法。然而，目前用于血栓性疾病治疗的药物都不同程度的具有体
内半衰期短、生产成本高等缺点，且由于缺乏纤维蛋白特异性，易引起组织出血等副作用【。因此，国内１】外专家学者一直致力于研究和开发副作用小、高效价廉的新型溶栓药物。纤溶酶广泛存在于动物、植物及微生物体内，是一种天然来源的溶栓药物，它直接降解血块中的纤维蛋白的蛋白水解酶，溶解血栓达到临床治疗的目的［。目前，人们研究的纤溶酶较多源于蚯蚓、植物和微生物等ｔ２］卜，其中微生物是纤溶酶的重