细胞的总蛋白质提取全过程及经验
蛋白质提取操作流程(细胞裂解)
蛋白质提取操作流程(细胞裂解)蛋白质提取操作流程（细胞裂解）
概述
细胞裂解是一种常用的方法，用于从生物样本中提取蛋白质。本文档介绍了蛋白质提取的操作流程。
材料
- 细胞样品
- 细胞裂解缓冲液
- 蛋白酶抑制剂
- 蛋白质稳定剂
- 超声波处理设备
- 冷冻离心机
步骤
1. 将冷冻的细胞样品取出并迅速转移到冰上。
2. 加入适量的细胞裂解缓冲液，并配制成细胞样品的适当浓度。
3. 加入蛋白酶抑制剂和蛋白质稳定剂，以保护蛋白质的完整性
和稳定性。
4. 将样品放入超声波处理设备中，进行超声波处理，用于破碎
细胞并释放蛋白质。
5. 将超声波处理后的样品置于冷冻离心机中，以去除细胞碎片
和残余的细胞组分。
6. 将离心后的上清液收集，并继续进行后续的蛋白质提取实验。
7. 根据实验需要可以进一步对蛋白质进行纯化、浓缩和分析等
处理。
注意事项
- 在细胞裂解过程中，应确保样品保持在低温环境下，以避免
蛋白质的降解和失活。
- 在超声波处理过程中，应注意操作时间和功率，以免对蛋白
质造成过度破坏。
- 细胞裂解缓冲液的选择应根据实验需求和细胞类型进行优化。
- 在蛋白质提取过程中，应避免受到外部污染和杂质的影响，
以保证提取到高质量的蛋白质样品。
总结
本文档介绍了蛋白质提取的操作流程，包括细胞裂解、超声波
处理和离心等步骤。正确的操作方法和注意事项对于获得高质量的
蛋白质样品至关重要。
实验一 动物细胞蛋白质的提取和含量测定
实验一动物细胞蛋白质的提取和含量测定
实验目的：学习动物细胞蛋白质的提取方法，并利用比色法测定蛋白质含量。
实验原理：
蛋白质是生物体中丰富的一类生物大分子，广泛分布于细胞内和细胞外，并参与生物体内多种生命过程。动物细胞蛋白质的提取是分离蛋白质与其他细胞成分的过程，主要包括以下步骤：细胞破碎、离心、过滤、沉淀、溶解等。
比色法是常用的蛋白质含量测定方法，其基本原理为：在一定条件下，吸收光谱的特定波长处与蛋白质浓度成正比关系，当分子光吸收强度与物质的摩尔吸光系数（ε）和浓度（c）成比
例时，吸收光强度与摩尔浓度成正比。
实验材料：
鼠肝组织（或其他动物细胞）、PBS缓冲液、离心管、低速离心机、高速离心机、比色皿、分光光度计、升酸钠（NaOH）、双氧水（H2O2）、标准蛋白溶液。
实验步骤：
1.将肝组织切碎并加入PBS缓冲液中，用器皿以适量缓慢但均匀的方式搅拌，使细胞尽可能充分破碎，制成15%（w/v）的
组织均浆。
2.将组织均浆经低速离心（1000×g，5分钟）离心去除大的组织碎片和细胞核，得到上清液。
3.取出上清液，经高速离心（12000×g，10分钟）离心，得到上清液中的细胞蛋白质沉淀。将上清液去除，并将沉淀用PBS缓冲液洗涤2-3次。
4.将蛋白样品溶解在PBS溶液中，并将其含量测量。用比色法测量蛋白质的含量。
5.将一定量的标准蛋白质溶液（如蛋白质量为0.5mg/ml）放入比色皿中，取等体积的PBS作为对照。将吸收光谱测试于580nm光波下。
6.将需要测定的试样溶液（不稀释或稀释到正常范围内）的吸光度值与标准曲线进行比较，并评估试样的蛋白质含量。
蛋白提取步骤
提蛋白及WB的步骤
整个过程细胞或蛋白都必须放冰上
准备工作：前一天准备：借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂是否充足、
当天准备：洗玻璃板、开紫外，冰块、碎冰、标记离心管及离心管、细胞刮板、
开低温高速离心机
细胞裂解液配制：
1ml cell lysis
10ul NP-40（离心机后）
25ul 焦磷酸钠
40ul NaF
1ul β-甘油磷酸
2 ul Na3VO4
1ul 蛋白酶抑制剂（用完即放回冰箱）
10ul PMSF（最后加，随加随用，有毒）
细胞裂解和收集
1.观察细胞状态，并准备提蛋白：吸走培养基、用PBS洗细胞两次（倾斜贴壁加PBS，左
右轻轻摇），倾斜贴壁吸走PBS。
2.将细胞盘拿到外间冰上，加裂解液（体积网上推荐：一般106加），冰上静置1-2min。
3.刮细胞：细胞刮板每次用之前拿水涮一涮，甩干，然后从中间到外面打圈刮，再从下往
上，从上往下全面刮，（刮的时候要迅速），最后用枪吸取裂解液至离心管。
细胞破碎
4.超声波破碎细胞：准备三个小烧杯，加满冰块，三个小夹子。（超声波破碎仪的铁棒不
要碰到离心管的壁和底部）
超声波设置：
工作功率5% 工作时间3min
开机时间15s，关机时间30s
温度0度，
报警温度1度
5.4℃、13000r/min，离心15min。（离心机用后一直保持打开的状态，）
蛋白保存
6.蛋白保存及分装：吸上清液至离心管，涡旋、吸一半至另一个管中，涡旋。-80℃保存。注意事项：PMSF一定要现用现加，PMSF在水溶液中不稳定，30min内就会降解一半。样品处理超过1h，补加一次。
BCA测定蛋白浓度
蛋白质提取与制备的原理和方法
蛋白质提取与制备的原理和方法
蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。
蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白
类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用
稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。
细菌总蛋白的提取方法
细菌总蛋白的提取方法
1.培养和收获细菌：首先，选择一种适合您研究目的的细菌株，并在
含有适当的培养基的培养皿中培养。培养温度和时间可以根据具体的细菌
株来确定。在培养到合适的生长期后，用无菌的锥形管或离心管收获细菌。
2. 细胞裂解：将细菌细胞分装到无菌的离心管中，然后通过使用裂
解剂来破坏细胞膜并释放蛋白质。常用的裂解剂有琼脂糖凝胶电泳缓冲液（Tris-HCl），盐溶液（如NaCl）、肌凝蛋白合成抑制剂（例如氯霉素）和酶抑制剂（如苯甲砜）。可以根据具体实验要求进行调整。
3.细胞裂解方法：细胞裂解方法有多种，常用的有超声波法、冻融法、压力法和化学分解法等。其中，超声波法是最常用的方法之一、将装有细
胞的离心管放入冰桶中，使用超声波处理器将细胞破碎。超声波处理时间
和强度可根据具体细菌株的要求进行调整。其他方法也可根据实验要求进
行选择。
4.离心：将经过细胞裂解的混合物离心，以除去碎片、膜片和细胞碎片。将裂解液转移到一个新的离心管中。
5.蛋白质沉淀：在裂解液中添加适当的蛋白质沉淀剂（如三氯醋酸、
硫酸铵等），并在低温条件下静置一段时间，使蛋白质沉淀成块。然后，
使用离心将混合物分解为沉淀和上清液。
6.重悬和洗涤：将蛋白质沉淀用缓冲液或溶液重悬，并通过反复离心
和洗涤步骤去除杂质和残留的蛋白质沉淀剂。这可以通过溶剂中加入催化
剂（如氯化铵）或重悬液进行移液或漩涡混合来实现。
7.可选的纯化步骤：根据研究需要，还可以对提取的细菌总蛋白进行进一步的纯化处理。例如，可以使用离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析和凝胶电泳等技术来获得纯化的蛋白质。
总蛋白提取方法
pregnancy villous EVT's invasion function
Virology Journal
2011, 8:114
（IF=2.55）
● Xin Yue et al.
Cloning and characterization of a hsp70 gene from Asiatic hard clam Meretrix
有效期： 一年。
产品简介： 贝博总蛋白提取试剂盒适用于从各种原代或传代细胞和各种实体组织，如脑、脊髓、
神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等哺乳动物组织 中提取总蛋白。提取过程简单方便，可在 1 小时内完成。该试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合 物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。本试剂盒含有的独特配 方能够溶解细胞膜包括细胞质膜和核膜。提取的蛋白可用于 Western Blotting、蛋白质电 泳、免疫共沉淀等下游蛋白研究。
注：
① 推荐裂解液使用量：100mm 培养皿 500ul；60mm 培养皿 250ul；6 孔板 200ul/孔；24 孔 板 100ul/孔；96 孔板 50ul/孔；75cm2 培养瓶 500ul。
② 建议用 BCA 法进行蛋白定量。
③ 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。
提蛋白质的原理及步骤
蛋白质提取是一项基础实验，通常用于从组织或细胞中提取纯度较高的蛋白质样品，以便进行各种蛋白质研究。常规的蛋白质提取步骤包括以下几个主要步骤：
1. 细胞或组织的裂解：将待提取的样品裂解以释放出蛋白质。裂解方法取决于被裂解的细胞类型，可使用机械法、化学法、超声波或高压等方法进行裂解。
2. 蛋白质的分离：将蛋白质与非蛋白质组分进行分离，常用的方法有沉淀、过滤、离心和柱层析等。
3. 蛋白质的纯化：通过进一步的分离和纯化来获得高纯度的蛋白质。这些步骤通常需要进行多次，每次都使用不同的方法来分离和纯化蛋白质。
提蛋白质的原理是基于蛋白质的化学和物理特性进行分离和纯化。蛋白质分子量大小、电荷、亲水性等特性不同，容易与不同化学试剂、柱层析介质或生物酶相互作用。通过调节这些条件和步骤，就可以使不同的蛋白质与其它组分分离出来，并得到纯度较高的蛋白质样品。
虽然蛋白质提取步骤较多，但因为各种蛋白质的特性不同，所以实验时需要根据需要选择不同的提取和分离方法以获得更理想的效果。
蛋白质提取常用试剂及操作方法
蛋白质提取常用试剂及操作方法
一、原料选择和前处理
（一）原料的选择
早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。
（二）前处理
1.细胞的破碎
材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。
wb蛋白提取步骤
wb蛋白提取步骤
WB蛋白提取步骤
引言：
WB蛋白提取是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质的表达及其相互作用。本文将详细介绍WB蛋白提取的步骤，包括细胞裂解、蛋白质提取、浓缩和检测等关键步骤。
一、细胞裂解
细胞裂解是WB蛋白提取的第一步，旨在破坏细胞膜、细胞核膜以及其他细胞组分，释放出目标蛋白质。常用的细胞裂解方法有机械法、化学法和生物学方法等。其中，最常用的方法是使用细胞裂解缓冲液，通过冷冻-解冻或超声波等方式破坏细胞结构。
二、蛋白质提取
蛋白质提取是WB蛋白提取的关键步骤之一。在细胞裂解后，目标蛋白质以及其他细胞组分被释放到裂解液中。为了提取目标蛋白质，需要将裂解液进行离心，分离出上清液。上清液中含有目标蛋白质，可以用于后续的蛋白质浓缩和检测。
三、蛋白质浓缩
蛋白质浓缩是WB蛋白提取的重要步骤之一，旨在提高目标蛋白质的浓度，便于后续的蛋白质检测。常用的蛋白质浓缩方法有醋酸沉淀法、酒精沉淀法和尿素沉淀法等。在浓缩过程中需要注意控制温
度和pH值，以避免蛋白质的降解和聚集。
四、蛋白质检测
蛋白质检测是WB蛋白提取的最后一步，用于确定提取的蛋白质是否含有目标蛋白以及其相对丰度。常用的蛋白质检测方法有SDS-PAGE和免疫印迹等。其中，SDS-PAGE是一种分离蛋白质的电泳方法，可以根据蛋白质的分子量将其分离成不同的条带；免疫印迹则是通过特异性抗体与目标蛋白质结合，然后使用酶标记的二抗进行检测。
总结：
WB蛋白提取是一种重要的实验技术，用于研究蛋白质的表达及其相互作用。其步骤包括细胞裂解、蛋白质提取、蛋白质浓缩和蛋白质检测等。通过合理选择和操作这些步骤，可以获得高质量的蛋白提取物，为后续的蛋白质研究提供可靠的基础。
提取蛋白质步骤
提取蛋白质步骤
蛋白质是生物体内最重要的官能分子之一，是组成生物体的重要基础。在生物学领域，蛋白质的提取方法是非常重要的。下面，我们将介绍蛋白质的提取步骤。
1. 细胞破碎
蛋白质存在于细胞内，因此需要将细胞破碎，以释放蛋白质。破碎细胞的方法有多种，如超声波破碎、高压破碎、玻璃珠破碎等。
2. 去除杂质
细胞破碎后，需要去除杂质。可以采用离心的方法，将混合液放入离心管中，通过高速离心，使得蛋白质与其他杂质分离出来。此外，还可以使用滤纸、膜过滤等方法去除杂质。
3. 溶解
蛋白质在溶液中存在，因此需要将其溶解。常用的溶解液有生理盐水、PBS缓冲液等。在溶解时，需要控制溶液的pH值和温度，以避免对蛋白质的影响。
4. 蛋白质分离
蛋白质的分离方法有多种，如电泳、层析、免疫亲和等。其中，电
泳是常用的方法之一，可以根据蛋白质的大小、电荷等性质进行分离。层析法根据分子量、亲和性等原理进行分离。免疫亲和法则是针对特定蛋白质，利用抗体对其进行识别和分离。
5. 蛋白质纯化
蛋白质分离后，还需要进行纯化，以去除杂质。纯化方法有多种，如柱层析、凝胶过滤、亲和层析等。不同的纯化方法适用于不同类型的蛋白质。
6. 蛋白质定量
蛋白质定量是一个重要的步骤，可以确定提取的蛋白质含量。常用的定量方法有比色法、Bradford法、BCA法等。这些方法都可以通过对特定试剂与蛋白质反应，从而测定蛋白质的含量。
7. 蛋白质保存
提取的蛋白质需要保存，以便后续实验使用。常用的保存方法有冰冻保存、干燥保存等。在保存时，需要注意蛋白质的稳定性，选择合适的保存条件。
细胞的总蛋白质提取全过程及经验
细胞的总蛋白质提取全
过程及经验
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细胞的总蛋白质提取全过程及经验
如果你要自己裂解细胞的时候，需要注意的事项：师兄给你的细胞要赶紧裂解，当然了，你还要看是带瓶子给你还是消化好给你的。一般我使用的时候，是将细胞统一从几个培养瓶中消化收集起来，然后赶紧4 度下离心，用预冷的PBS 或者生理盐水洗涤细胞。也有人喜欢在培养瓶中直接加裂解液，这个一般都是做 western 什么用的，需要的蛋白量不是很多，而且大部分时候都是要有活性的蛋白的。一般1000rpm 足够离心了，转速太快，细胞会破碎，然后会损失蛋白。PBS 洗涤的最后一遍，记得将细胞转移到超声管中，也许是由于普通的10mL 离心管有可能承受不了超声的能量吧，我们师兄师姐一般都用超声管来自装细胞，然后加入裂解液直接超声。3s 每次，间歇3s 60 次，400W，重复工作复位2 次，总共超声180 次就差不多了。裂解后的细胞要赶紧在2500g 下离心30-60min，超声管是没有盖子的，可以直接在上面加一层封口膜离心。在离心的时候，去配制沉淀液，丙酮：无水乙醇：冰乙酸
=50:50:，体积比。一般我加的是裂解液体积的5 倍。沉淀液要预冷，我喜欢将沉淀液放在-20 度下。细胞离心后，上清液加入到沉淀液中，就会看到比较多的白色沉淀出现，-20 度沉淀>2h，然后就可以高速沉淀下蛋白了。这里我们用的体积比较大，一般的离心管不能用，要用 beckman 专用的那种50mL 离心管，25000g，15-30min。 Beckman 离心管比较大，底部是平的，所以蛋白在底部并不是很牢固，在弃去上清液的时候，一定要注意用枪头缓慢的吸出！然后用5mL 做有的丙酮洗涤一遍，再用75%酒精将蛋白转移到4mL 的离心管中，当然，如果你的蛋白很少，的EP tube 也可以使用。之所以用4mL 是因为我每次提取的蛋白量大概>10mg，而冻干后的蛋白复溶后测定浓度，一般要求在5-6mg/mL 之间，所以buffer 的体积也会比较的大。这里蛋白在离心的时候，是片状的，一定要慢慢转移，防止损失，不行就多次转移，每次都将离心管离心去上清。转移后的蛋白离心除去酒精，这时候还是会有部分水分的，就在冻干机里面冻干，尽量在室温下操作。冻干后的蛋白质就可以保存起来了。然后在使用之前，测定蛋白质的浓度，如果你用了8M 尿素溶解，在酶解的时候，就需要稀释到<2M，所以蛋白初始浓度不能太低。在蛋白复溶的时候，尽量在4 度操作，然后一定要慢慢的加buffer，加多了就不好了，只要蛋白能完全溶解就好。完全溶解的蛋白，会有些粘稠，但是绝对不会有不溶物产生，如果产生了不溶物，就说明需要加buffer，一般复溶这一步要进行一个下午最少！
实验记录-Western-Blot之蛋白的提取与定量
细胞蛋白的提取与测定
蛋白提取原理：蛋白质是一切生命活动的承担者，为了研究及探索蛋白质的功能、特异性蛋白表达水平、翻译后修饰（甲基化磷酸化等）、蛋白-蛋白或蛋白-核酸之间相互作用的研究，进一步阐明众多疾病的机制，同时为疾病治疗提供理论依据，因此需要提取目的蛋白，由于蛋白质种类繁多，结构复杂，需要通过一些步骤使细胞裂解、杂志去除、蛋白纯化来得到目的蛋白。
一、贴壁细胞蛋白的提取：（所有操作均在冰上进行）
准备相应数量的EP管标记后放放冰上备用
1.裂解液制备：每1ml蛋白裂解液（RIPA）加入10ul蛋白酶抑制剂（如PMSF保护蛋白，使其免于被蛋白酶降解），配好后冰上备用；
2.此处以6孔板为例，吸掉培养基后每孔加入1-2ml冰PBS溶液，清洗 2-3次，吸净残余BPS（如果有残留的话有可能使提取的蛋白稀释）；
3.加入适当体积的裂解液，让裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min；
4.裂解完成后，用细胞刮刀将细胞刮下，将细胞及裂解液吸入离心管，放离心机4℃
12000rpm 离心30min（离心机提前预冷），上清即为蛋白溶液，细胞碎片沉降于底部；
5.蛋白提取完成后a.可放置于-20℃保存（长期保存放于-80℃）；b.可取出部分进行BCA 定量分析；c.做western blot，需要对蛋白进行变性处理后储存于-20℃或-80℃的冰箱中保存（根据蛋白变性条件不同有所不同，例如在100℃的高温下水浴锅煮5-10分钟）。
二、组织中总蛋白的提取：
1.将已称重的冷冻组织（约50g）放入预冷好的研钵中，用研杵快速研磨组织，（有的需要加入液氮），直至组织被研磨成匀浆（无明显颗粒）；
细胞总蛋白提取实验报告
细胞总蛋白提取实验报告
细胞总蛋白（简称 CRP)是指从细胞分泌出来，然后在一定条件下逐渐氧化，被氧化后产生的具有特殊生理活性的蛋白质。它是一种在体内广泛存在的蛋白质中非常重要的一种蛋白质组分，其结构与人体自身细胞中大量存在的多肽结构相似，可以产生多种生物活性物质，是细胞外基质中重要分子。所以细胞总蛋白又被称为“超级蛋白”、“人体生命之本”。蛋白组分为18种类型。它是人体内含量最多、最重要的一类蛋白质组分，含有大量人体需要蛋白质并且质量要求较高的多肽、氨基酸、核苷酸等成分。目前已发现的蛋白组分共有400多种，其含量与生物活性物质及生物作用有关。其分子量为127 kDa——332 kDa,由200多种氨基酸组成，包括了20多种生物活性物质和生物功能分子。
1.试剂准备
试剂准备：细胞总蛋白(CRP)试剂盒（上海德林生化科技有限公司）准备试剂：纯水四氢呋喃(HF):用于检测纯水中的 CRP浓度和是否为活细胞产生。磷酸二氢钾(PH=5.0):用于检测所需的 CRP浓度并确定其含量。含二氢呋喃磷酸钠钠混合溶液(PH=8.5);三氯生：用于检测细胞总蛋白浓度并确定其含量。四氢呋喃磷酸钠：采用电感耦合等离子体质谱仪测定其含量。过氧化氢：用于检测游离脂肪酸与三甲胺(TMP)(见表1),过氧化氢纯度为99%至99.5%之间（见表
2)。有机过氧化物：用于检测实验中提取 CRP过程中存在的过氧化物含量并确定其成分（见表
3)。
2.器材准备
试剂:1份细胞总量（以细胞密度计),1份蛋白总量（以蛋白浓度计),1份去离子水。2台离心泵：将100 CC去离子水、1000 CC去离子水放入装有去离子水中，各放入1份去离子水和1份去离子水中。在100 CC去离子水中再放入1份去离子水、1份去离子水中继续放入1份去离子水。取去离子水适量、琼脂糖10 ml、琼脂糖40 ml注入50 ml去离子水中。摇匀并过滤5分钟后备用。玻璃针：将玻璃针放入装有去离子水、琼脂糖混合液、1份去离子水中，再依次加入1份去离子水中；台式天平：将盛有纯净水和琼脂糖溶液的培养皿用冰水浴温度保持在20℃左右；离心管：放入30 ml无菌过滤水中进行离心，待上层液清澈透亮之后加入1份去离子水搅拌均匀即可。
细胞总蛋白提取方法
产品号 BB-3108 BB-3103 BB-3106 BB-3401 BB-3154 BB-3151 BB-3124 BB-3152 BB-3301 BB-3127 BB-3311 BB-3182 BB-3185 BB-3191
使用方法：
1. 提取液制备：每 500ul 冷的细胞蛋白提取液中加入 2ul 蛋白酶抑制剂混合物和 2ul 磷酸酶抑制剂，混匀后置冰上备用。
2. 取 5-10×106 个细胞①，在 4℃，1000rpm 条件下离心 5-10 分钟，小心吸取培养 基，尽可能吸干，收集细胞。
3. 用冷 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。 4. 每 5×106 个细胞中加入 500ul 冷的总蛋白提取液，混匀后，在 4℃条件下振荡
modulated by breast cancer resistant protein Chin. J. Cancer. 2010. 29(2):159-165
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柱式细胞总蛋白提取方法
柱式细胞总蛋白提取方法
柱式细胞总蛋白提取方法是一种用于提取细胞中的总蛋白的方法。总蛋白是细胞内所有蛋白质的总和，包括可溶性蛋白和膜结合蛋白。柱式细胞总蛋白提取方法采用多步骤的蛋白提取和富集方法，可以获得高纯度的细胞总蛋白。
以下是柱式细胞总蛋白提取方法的详细步骤：
1.细胞收集和洗涤：将培养的细胞收集到离心管中，通过离心将细胞沉淀。去除上清液，用冷PBS洗涤细胞3次以去除培养基和细胞外蛋白。
2.细胞裂解：向细胞沉淀中加入适量的细胞裂解缓冲液，包括一些蛋白酶抑制剂以防止蛋白降解。用离心管轻轻颠倒细胞混匀，然后在冰上孵育15分钟，使细胞溶解。
3.离心：将细胞裂解液以最高转速离心10分钟，将上清液转移到新的离心管中。上清液中含有可溶性细胞蛋白。
4.柱子填充：根据需要选择合适的蛋白纯化柱子，例如，蛋白A/G柱子用于富集抗体相关的蛋白。将柱子放在柱子支架上，并预先平衡柱子缓冲液。
5.上样：将上一步得到的上清液缓慢而均匀地滴入柱子中，让液体通过柱子。静置片刻，让蛋白结合到柱子中的亲和介质上。
6.洗涤：用适量的柱子缓冲液轻轻洗涤柱子，以去除非特异性结合的蛋白。根据需要可以进行多次洗涤。
7.蛋白洗脱：加入适量的洗脱缓冲液来洗脱结合的蛋白。洗脱缓冲液
的组成根据具体需要进行选择，例如含丰富蛋白的缓冲液用于洗脱膜结合
的蛋白。
8.蛋白检测：用BCA或其他蛋白定量试剂盒检测洗脱液中的蛋白含量。
以上是柱式细胞总蛋白提取方法的简要步骤。使用这种方法，可以从
细胞中获得高纯度的总蛋白，并用于后续的蛋白质组学研究、蛋白质识别
细胞总蛋白提取-考马斯亮蓝测蛋白含量
蛋白样品的获得主要包括破碎法、沉淀法、蛋白溶解等，可以根据实验目前选择最合适的方法，本文主要总结了蛋白抽提的仪器和材料的准备，试剂溶液的配制以及具体的操作步骤。
蛋白提取方法
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 组织和细胞的来源：
1.1.2 仪器设备
机械组织匀浆器
低温高速离心机(>40,000 g)
超速离心机
超生细胞破碎仪
超纯水装置
1.1.3 试剂
三氯醋酸(TCA)
丙酮
二硫苏糖醇(DTT)
尿素
CHAPS
PMSF
EDTA
乙醇
磷酸
考马斯亮蓝R350
抑肽素A
亮肽素
试剂纯度均应是分析纯或以上。
1.1.4 溶液配制
(1) PBS：
NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4，溶于800 ml水中，用HCl调pH至7.4，用纯水定容至1 L;
(2) EDTA 储存液：
18.61 g Na2EDTA•2H2O，溶于70 ml纯水中，用10 mol/L NaOH调节pH 值至8.0 (约需2 g NaOH颗粒)，定容为100 ml。可高压灭菌后分装备用; (3) 亮肽素储存液(50 μg/ml，100×)
10 mg/ml溶于水，-75℃保存;使用时配成50 μg/ml储液，-20℃保存; (4) 抑肽素储存液(70 μg/ml，100×)
1 mg/ml溶于甲醇，-75℃保存;使用时配成70 μg/ml储液，-20℃保存; (5) PMSF储存液(10 mM, 100×):
17.4 mg PMSF，溶于1ml异丙醇中，-20℃ 保存。
DTT 储存液(1 M):
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细胞的总蛋白质提取全过程及经验
如果你要自己裂解细胞的时候，需要注意的事项：师兄给你的细胞要赶紧裂解，当然了，你还要看是带瓶子给你还是消化好给你的。一般我使用的时候，是将细胞统一从几个培养瓶中消化收集起来，然后赶紧4度下离心，用预冷的PBS 或者生理盐水洗涤细胞。也有人喜欢在培养瓶中直接加裂解液，这个一般都是做western什么用的，需要的蛋白量不是很多，而且大部分时候都是要有活性的蛋白的。一般1000rpm足够离心了，转速太快，细胞会破碎，然后会损失蛋白。PBS洗涤的最后一遍，记得将细胞转移到超声管中，也许是由于普通的10mL离心管有可能承受不了超声的能量吧，我们师兄师姐一般都用超声管来自装细胞，然后加入裂解液直接超声。3s每次，间歇3s60次，400W，重复工作复位2次，总共超声180次就差不多了。裂解后的细胞要赶紧在2500g下离心30-60min，超声管是没有盖子的，可以直接在上面加一层封口膜离心。在离心的时候，去配制沉淀液，丙酮：无水乙醇：冰乙酸=50:50:0.1，体积比。一般我加的是裂解液体积的5倍。沉淀液要预冷，我喜欢将沉淀液放在-20度下。细胞离心后，上清液加入到沉淀液中，就会看到比较多的白色沉淀出现，-20度沉淀>2h，然后就可以高速沉淀下蛋白了。这里我们用的体积比较大，一般的离心管不能用，要用beckman专用的那种50mL离心管，25000g，15-30min。Beckman离心管比较大，底部是平的，所以蛋白在底部并不是很牢固，在弃去上清液的时候，一定要注意用枪头缓慢的吸出！然后用5mL做有的丙酮洗涤一遍，再用75%酒精将蛋白转移到4mL的离心管中，当然，如果你的蛋白很少，1.5mL的EPtube也可以使用。之所以用4mL是因为我每次提取的蛋白量大概>10mg，而冻干后的蛋白复溶后测定浓度，一般要求在5-6mg/mL之间，所以buffer的体积也会比较的大。这里蛋白在离心的时候，是片状的，一定要慢慢转移，防止损失，不行就多次转移，每次都将离心管离心去上清。转移后的蛋白离心除去酒精，这时候还是会有部分水分的，就在冻干机里面冻干，尽量在室温下操作。冻干后的蛋白质就可以保存起来了。然后在使用之前，测定蛋白质的浓度，如果你用了8M尿素溶解，在酶解的时候，就需要稀释到<2M，所以蛋白初始浓度不能太低。在蛋白复溶的时候，尽量在4度操作，然后一定要慢慢的加buffer，加多了就不好了，只要蛋白能完全溶解就好。完全溶解的蛋白，会有些粘稠，但是绝对不会有不溶物产生，如果产生了不溶物，就说明需要加buffer，一般复溶这一步要进行一个下午最少！