质粒DNA的提取和鉴定
质粒DNA的提取与电泳鉴定_百替生物
质粒DNA的提取与电泳鉴定质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。
大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
质粒DNA的提取
质粒DNA的提取一、原理采用碱变性发抽提取质粒DNA。
该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。
在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。
而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、方法1.挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。
2.将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。
反复数次，收集全部菌体。
3.倾去上清，滤纸吸干。
4.加30μlTE缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。
5.加30μlTENS溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/LNaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。
6.加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染色体DNA。
7.上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。
8.上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。
9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。
10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。
lI．加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。
12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混匀。
(完整版)质粒DNA的提取、纯化与鉴定
分子生物学实验报告题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定姓名：学号：班级：时间：一、实验目的：1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。
2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。
3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。
4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。
5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。
二、实验原理：1.质粒DNA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。
少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。
碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
提取质粒实验报告
提取质粒实验报告提取质粒实验报告引言：质粒提取是分子生物学中常用的实验技术之一，通过提取质粒，可以获得目标基因的DNA序列，进而进行进一步的研究和应用。
本实验旨在通过一系列步骤，从细菌中提取质粒，并对提取的质粒进行分析和鉴定。
实验材料与方法：1. 实验材料：- 大肠杆菌培养液- 质粒DNA提取试剂盒- 离心管- 离心机- 试剂盒中的缓冲液、溶解液、洗涤液、洗涤缓冲液、洗涤液浓缩液、洗涤缓冲液浓缩液、洗涤缓冲液浓缩液2、洗涤缓冲液浓缩液3、洗涤缓冲液浓缩液4、洗涤缓冲液浓缩液5、洗涤缓冲液浓缩液6、洗涤缓冲液浓缩液7、洗涤缓冲液浓缩液8、洗涤缓冲液浓缩液9、洗涤缓冲液浓缩液10- 水浴锅- 离心管架2. 实验方法：- 步骤一：将大肠杆菌培养液离心，收集菌体沉淀。
- 步骤二：将收集的菌体沉淀加入溶解液中，使其充分溶解。
- 步骤三：加入缓冲液，进行离心分离。
- 步骤四：将上清液转移到新的离心管中，加入洗涤液进行洗涤。
- 步骤五：加入洗涤缓冲液进行洗涤。
- 步骤六：加入洗涤缓冲液浓缩液进行洗涤。
- 步骤七：加入洗涤缓冲液浓缩液2进行洗涤。
- 步骤八：加入洗涤缓冲液浓缩液3进行洗涤。
- 步骤九：加入洗涤缓冲液浓缩液4进行洗涤。
- 步骤十：加入洗涤缓冲液浓缩液5进行洗涤。
- 步骤十一：加入洗涤缓冲液浓缩液6进行洗涤。
- 步骤十二：加入洗涤缓冲液浓缩液7进行洗涤。
- 步骤十三：加入洗涤缓冲液浓缩液8进行洗涤。
- 步骤十四：加入洗涤缓冲液浓缩液9进行洗涤。
- 步骤十五：加入洗涤缓冲液浓缩液10进行洗涤。
- 步骤十六：将洗涤后的质粒DNA溶解于水中。
实验结果与讨论：在本实验中，我们成功地从大肠杆菌中提取到了质粒DNA，并进行了分析与鉴定。
通过对提取的质粒DNA进行电泳分析，我们观察到了明显的DNA条带，表明质粒DNA的提取是成功的。
此外，我们还对提取的质粒DNA进行了鉴定。
通过使用限制性内切酶对质粒DNA进行切割，并进行电泳分析，我们可以确定质粒中是否存在目标基因。
质粒dna的提取与鉴定实验报告
质粒DNA的提取与鉴定实验报告引言质粒DNA的提取与鉴定是分子生物学实验中常用的技术之一。
质粒DNA是一种圆形的DNA分子，广泛存在于细菌和真核生物中。
提取和鉴定质粒DNA能够帮助研究人员进行基因克隆、基因表达调控等实验。
本实验旨在介绍质粒DNA的提取与鉴定步骤，以供初学者了解和学习。
实验材料•细菌培养物•质粒DNA提取试剂盒•去离子水• 1.5 mL离心管•微量离心管•离心机实验步骤步骤一：培养细菌并收获培养物1.取一支含有目标质粒的细菌培养物，将其接种至含有适当抗生素的培养基中。
2.在37℃恒温摇床上培养过夜，确保细菌得到充分生长。
步骤二：收获细菌培养物1.将培养基离心机中以12000转/分钟离心2分钟，以沉淀细菌细胞。
2.弃去上清液，将细菌细胞沉淀保留在离心管中。
步骤三：质粒DNA的提取1.选择一款质粒DNA提取试剂盒，按照说明书中的步骤操作。
不同试剂盒所用方法有所差异，详细操作请参照试剂盒说明书。
2.在质粒DNA提取试剂盒提供的试剂中加入细菌细胞，充分混合。
3.通过离心将细菌细胞裂解，释放出质粒DNA。
不同试剂盒所用离心条件有所不同，一般为高速离心1-3分钟。
4.弃去上清液，留下含有裂解细胞的混悬液。
步骤四：质粒DNA的纯化1.将质粒DNA混悬液转移到新的离心管中。
2.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
3.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
4.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
5.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
6.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
7.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
8.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
9.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
10.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
11.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
12.使用去离子水溶解沉淀的质粒DNA，使其浓度适宜。
步骤五：质粒DNA的鉴定1.使用紫外可见光分光光度计测定溶解后的质粒DNA的浓度。
2.准备一份对照组，即只含有去离子水的样品。
质粒dna的提取
质粒DNA的提取1. 引言质粒DNA提取是在分子生物学研究中常用的实验操作之一。
质粒是一类圆环状的DNA分子，存在于原核生物中。
质粒DNA提取的目的是为了获取纯度高的DNA样品，以便进行后续的实验操作，如聚合酶链式反应（PCR）、限制性酶切、测序等。
2. 实验材料在进行质粒DNA提取实验前，需要准备以下实验材料：•细菌培养液：含有所需质粒的培养液。
•碱裂解液：用于裂解细胞并释放质粒DNA的实验液。
•高盐含量的溶液：用于提取DNA。
•蛋白酶K：用于消化蛋白质。
•硅胶粉末：用于吸附DNA。
•乙醇：用于沉淀DNA。
•TE缓冲液：用于溶解和储存提取的质粒DNA。
3. 实验步骤3.1 细菌培养与收获首先，需进行细菌培养和收获，以获取含有所需质粒的培养液。
培养液中的细菌应为含有目标质粒的菌株，如大肠杆菌。
3.2 细胞破碎与质粒DNA释放将收获的细菌培养液进行离心，去除培养液并沉淀细胞。
然后将细胞重悬于碱裂解液中，用震荡器在适当的温度和时间条件下裂解细胞，释放质粒DNA。
3.3 蛋白质消化为了去除细胞中的蛋白质，加入适量的蛋白酶K，进行蛋白消化。
消化的时间和温度应根据实验要求进行调整。
蛋白消化完成后，通过离心将蛋白质沉淀分离。
3.4 DNA提取将消化液中的DNA溶液转移到其它离心管中，并加入高盐含量的溶液。
通过离心将DNA与其他杂质分离。
此步骤中，DNA会被溶液中的硅胶粉末吸附，以去除杂质。
3.5 DNA沉淀将去除杂质的DNA溶液转移到新的离心管中，加入冰冷的乙醇。
通过离心，将沉淀的DNA分离出来。
注意，在沉淀过程中，应避免DNA的过度离心，以免损坏DNA分子。
3.6 DNA溶解和储存将DNA沉淀后，溶解在适量的TE缓冲液中。
TE缓冲液具有适当的pH值和离子浓度，能够稳定DNA分子，并提供良好的保存条件。
4. 实验注意事项在质粒DNA提取实验中，需要注意以下几点：•操作过程应严格遵守无菌操作，避免外源性DNA的污染。
质粒dna提取步骤
质粒dna提取步骤
质粒 DNA 提取是分子生物学实验中的一项基本技术，用于从细菌细胞中分离出质粒DNA。
以下是一般的质粒 DNA 提取步骤：
1. 收集细菌培养物：将含有质粒的细菌培养在适当的培养基上，直到培养物达到合适的密度。
可以使用离心或过滤的方法收集细菌细胞。
2. 细胞裂解：将收集的细菌细胞加入裂解缓冲液中，通过物理方法（如搅拌、超声处理等）或化学方法（如加入裂解酶等）使细胞破裂，释放出质粒 DNA 和其他细胞成分。
3. 去除细胞碎片：将裂解后的混合液通过离心或过滤的方法去除细胞碎片和其他杂质。
4. 沉淀 DNA：向裂解液中加入乙醇或异丙醇等沉淀剂，使质粒 DNA 沉淀。
通过离心将沉淀收集。
5. 洗涤沉淀：用 70%的乙醇洗涤沉淀，以去除残留的盐分和杂质。
6. 干燥沉淀：将洗涤后的沉淀离心，并去除上清液。
然后将沉淀在室温下干燥，以去除残留的乙醇。
7. 溶解 DNA：将干燥的沉淀加入适当的缓冲液中，使质粒 DNA 溶解。
可以在缓冲液中加入 RNA 酶以去除 RNA 杂质。
8. 纯化和浓缩 DNA：可以使用柱层析、电泳或其他方法对提取的质粒 DNA 进行进一步的纯化和浓缩。
9. 质量检测：使用琼脂糖凝胶电泳或其他适当的方法检测提取的质粒 DNA 的质量和完整性。
需要注意的是，具体的质粒 DNA 提取步骤可能因使用的试剂盒或实验条件而有所不同。
在进行质粒 DNA 提取之前，应仔细阅读所使用的试剂盒说明书或相关实验方案，并根据实际情况进行适当的调整和优化。
遗传学 实验四 质粒DNA的提取与鉴定
实验四质粒DNA的提取与鉴定一、实验目的1、熟悉细菌的培养和质粒的扩增。
2、学习和掌握从大肠杆菌中提取质粒DNA的原理和方法以及琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。
二、实验原理质粒广泛存在与原核细胞中，大多是双联的共价闭合环状DNA分子，长度可以从1kb 到200kb不等，是染色体外寄生性的自主复制子，在细胞分裂时能恒定地传递给子代细胞。
在分子生物学研究中，为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA，通常使用松弛型（其复制受宿主的控制不严格，在宿主细胞中拷贝数较多）质粒。
从大肠杆菌中分离质粒的方法很多，常见的有煮沸法和碱变性抽提法。
碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复兴差异而达到分离的目的。
在pH高达12.5的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节pH至中性时，变形的质粒DNA又恢复到原来的构型，通过离心保留在溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。
在抽屉过程中，由于各种因素的影响，同一质粒DNA可能呈现以下不同的构型：①超螺旋型，即共价闭合环状DNA（cccDNA）；②一条链发生一处或多处断裂，致使另一条链发生自由旋转，分子内的扭曲折叠消失，形成松弛的分子即开环DNA（ocDNA）；③两条链都发生了随机的断裂成为线状DNA。
在这三种构型中，cccDNA由于扭曲折叠，体积很小，在具有分子筛效应的琼脂糖凝胶电泳中受到阻力最小，迁移速度最快；ocDNA因扭曲状态被破坏而呈松弛的环状，迁移速度较慢；线状DNA受到的阻力最大，迁移速度最慢。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，除受分子构型的影响，还受所带净电荷多少的影响。
因此在鉴定质粒DNA纯度时，应尽量减少电荷效应。
增大凝胶浓度可以在一定程度上降低电荷效应，分子的迁移速度主要取决于受凝胶阻滞程度的差异，由此将不同构型的质粒DNA 分开。
质粒DNA的提取、纯化及验证
质粒DNA的提取、纯化及验证姓名：肖风学号：2 2010级生物工程一、【实验目的】1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用，掌握碱变性法提取质粒DNA 的方法。
2、掌握质粒DNA的纯化方法，即用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质。
3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理，凝胶的制备及电泳方法及凝胶中DNA的分离纯化方法。
二、【实验原理】1、碱变性提取法提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。
溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。
由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。
质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
质粒DNA的提取、定量、PCR鉴定
1. 菌液煮沸10min 2、取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各
四、结果分析
1、用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定; 2、加5uLPCR产物进行电泳; 3、预期PCR产物大小约400~500bp;
五、实验原理
* 由1985年穆里斯（K. Mullis）发明，他也因此获得了 1993年的诺贝尔化学奖。
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应， 是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物 为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复 制DNA的过程。
保存：-20 ℃
引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
Taq酶
72℃
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
(%)
100
酶 80
活 性
60
40
20
40 50 60 70 80 90
温度(℃)
（四）dNTP
• dNTP浓度取决于扩增片段的长度 • 四种dNTP浓度应相等 • 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产 量 • dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA 聚合酶的活性。
变性充分：变性温度越高，时间越长变性就越充分。 变性温度、时间要适应：温度过高、时间过长又会影响 Taq DNA 聚 合酶的活性， 变性温度90-95 ℃为宜。
质粒DNA的提取、定量、 与PCR鉴定
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告(2020年整理).pptx
实验一、质粒 DNA 的提取及检测
【实验目的】 1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤 2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的方法和技术 3、学会 PCR 操作的基本技术
第一部分 质粒DNA 的提取
一、实验原理： 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 在拓扑学上的差
二、仪器与试剂 1、仪器 恒温摇床、台式离心机 2、试剂 溶液 I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE 缓冲液、胰 RNA 酶、酚、氯仿
三、实验步骤 1、 将 2mL 含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的 LB 液体培养基加入到试管中，接入含 pUC19
质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。 2、 取 1.5mL 培养物倒入微量离心管中，4000r/min 离心 2min。 3、 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。 4、 将细菌沉淀悬浮于 100μL 溶液 I 中，充分混匀，室温放置 10 min。 5、 加 200μL 溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上 5min。 6、 加入 150μL 溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置 15min。 7、 12000r/min，离心 15min，将上清转至另一离心管中。 8、 向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心 5min，
变性
94℃
45s
退火
56℃
45s
延伸
72℃
45s
完全延伸
72℃
3min
（3）PCR 结束后，取 10μl 产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
在紫外灯（254nm）下观察染色后的电泳凝胶。DNA 存在处应显出桔红色荧光条带。
第三部分 PCR 扩增制备目的基因
质粒dna的提取与鉴定实验报告
质粒DNA的提取与鉴定实验报告1. 实验目的本实验的目的是通过提取和鉴定质粒DNA，掌握质粒DNA的提取方法并验证提取的质粒DNA的纯度和完整性。
2. 实验原理质粒DNA提取是将质粒DNA从细菌细胞中分离出来的过程。
常用的提取方法包括碱裂解法和商业试剂盒法。
本实验使用商业试剂盒法进行质粒DNA的提取。
步骤如下： 1. 培养目标细菌，并收集细菌培养物。
2. 细菌培养物离心，收集细菌沉淀。
3. 加入细胞裂解缓冲液裂解细胞膜。
4. 加入溶解剂，使细胞溶解。
5. 加入酒精，沉淀出质粒DNA。
6. 分离质粒DNA，去除其他杂质。
7. 测定质粒DNA的纯度和完整性。
3. 实验步骤3.1 培养目标细菌1.取出目标细菌的冻存管，从-80°C的冷冻库中快速解冻。
2.取出琼脂平板，用无菌技术将细菌转接到琼脂平板上，利用无菌鹤嘴锄均匀涂抹。
3.将琼脂平板倒置放置在37°C恒温培养箱中，培养一夜。
3.2 收集细菌培养物1.取出含有细菌的琼脂平板，加入适量的无菌LB培养基。
2.用无菌移液管将培养基中的细菌转移到无菌离心管中。
3.将离心管放入低速离心机中，离心5分钟，将细菌沉淀收集。
3.3 细胞裂解1.向细菌沉淀中加入适量的细胞裂解缓冲液。
2.充分混合后，放置在冰上浸泡20分钟，使细菌细胞膜裂解。
3.4 细胞溶解1.加入等体积的溶解剂，充分混合。
2.将含有细胞裂解物的离心管放入冰上浸泡5分钟。
3.5 DNA沉淀1.向离心管中加入等体积的冷酒精。
2.轻轻倾斜离心管，使酒精与溶液充分混合。
3.放置在-20°C冷冻库中沉淀20分钟。
3.6 分离质粒DNA1.将离心管放入高速离心机中，离心10分钟。
2.将上清液倒出，保留下沉淀。
3.7 测定质粒DNA的纯度和完整性1.使用纳米比色计测定质粒DNA的浓度和纯度。
2.利用琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的完整性。
4. 结果与讨论根据实验结果，我们成功提取到了质粒DNA，并验证了其纯度和完整性。
实验3质粒的提取和鉴定
Ⅱ型限制与修饰系统
• 占90%以上，即通常指的DNA限制性内切酶，它 们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内 进行切割，产生特异的DNA片段；
• Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅 助因子，识别顺序一般为4-6个碱基对的反转重复 顺序；
• Ⅱ型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口： 5’端突出，3’端突出和平末端。
• 溶液Ⅰ—溶菌液： 50mM 葡萄糖，（），10mM EDTA，2mg/ml 溶
菌酶。
• 溶液Ⅱ— NaOH-SDS液：0.2N NaOH，1% SDS。
• 溶液Ⅲ— 3mol/L NaAc（）溶液：5M KAC 10ml，冰醋酸 ，水 。
四步骤(一) 细菌培养与质粒扩增
1. 挑单克隆菌株接种到4ml LB培养液中（含Amp 50µg/ml），37 ℃225rpm振荡培养过夜。
• 12．取样品10 µl加2ul 6× Loading buffer于1 %琼脂糖电泳，电泳凝胶在凝胶成像系统上成像。
双酶切实验材料
• 限制性内切酶：EcoRⅠ、XbaⅠ和HindⅢ • DNA：λDNA和质粒pCDNA-p38 •Cl 10M MgCl2
限制性切酶以内切的方式水解核酸链中的磷酸二 酯键，产生的DNA片段5’端带磷酸基团，3’ 端为-OH。
限制性核酸内切酶分类
• 识别切割特性 • 催化条件 • 是否具有修饰酶活性
• 至2005年1月，共发现限制酶3681种
– Ⅰ 型59种 – Ⅱ 型3612种 – Ⅲ 型10种
• 商业化的限制酶有 588 种，在 Ⅱ 型限制酶 中共有 221 种特异性。
2.在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子 筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子 质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分 子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。 因此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的 DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不 同的DNA分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次 为线性结构，最慢的可能是复制中间体（没有复制 完的两个质粒连在一起），而不是开环结构（用
质粒dna提取的方法
质粒dna提取的方法
提取质粒DNA的常用方法主要有：
1. 碱裂解法：将含有质粒DNA的细菌株进行裂解，使细菌质粒DNA与蛋白质分离。
一般使用碱性裂解缓冲液（如0.2 M NaOH）和含有细菌裂解酶（如SDS）的胰酶溶液进行裂解，然后使用中性盐溶液（如3 M醋酸钠）进行酸性沉淀，最后通过离心分离沉淀的质粒DNA。
2. 除菌剂法：使用含有除菌剂（如SDS）的裂解缓冲液直接裂解细菌细胞，使质粒DNA与细菌蛋白质分离。
然后使用物理方法（如离心）分离DNA和蛋白质，最后使用醋酸盐沉淀法分离质粒DNA。
3. 膜裂解法：将含有质粒DNA的细菌株均匀涂在含有质粒DNA结合断裂物的特殊膜上，经裂解后，膜上会形成质粒DNA的斑点。
然后使用洗脱缓冲液将质粒DNA从膜上洗脱，得到纯化的质粒DNA。
4. 商业化质粒DNA提取试剂盒：市面上有各种质粒DNA提取试剂盒可供选择，这些试剂盒能够提供简便、快速、高产量且高质量的质粒DNA纯化方法。
根据试剂盒的不同，步骤和原理会有所区别。
不同的方法适用于不同的实验目的和样品类型，请根据具体情况选择合适的提取方法。
质粒dna的提取实验报告
质粒dna的提取实验报告引言：DNA是生命的基本遗传物质，研究DNA的结构和功能对于理解生命的本质具有重要意义。
在分子生物学实验中，质粒DNA的提取是一项关键步骤，它能够帮助我们获得足够纯度和数量的DNA样本，以便进行后续的实验分析。
本实验旨在提取质粒DNA，并验证提取效果和纯度。
材料和方法：1. 细菌培养：选择含有目标质粒的菌落进行预培养，接种至100ml含有适当抗生素的LB培养基中，37℃摇床培养过夜。
2. 提取质粒DNA：使用质粒DNA提取试剂盒，按照说明书进行操作。
主要步骤包括细菌离心、细菌裂解、质粒DNA与蛋白质分离、质粒DNA沉淀和洗涤等。
3. DNA质量和浓度检测：使用紫外分光光度计检测提取得到的DNA样品的260nm吸光度值，计算DNA浓度。
结果和讨论：量和浓度的检测。
质检测结果显示，提取得到的质粒DNA纯度较高，吸光度比值（A260/A280）在1.8-2.0之间，说明DNA中没有明显的蛋白污染。
这对于后续实验如聚合酶链式反应（PCR）等有着重要的影响。
同时，我们还测定了DNA的浓度，得到了大致的目标值，为1μg/μl左右。
在实验过程中，我们需要注意一些关键点，例如细菌的培养条件、细菌离心和裂解的时间和速度、蛋白质分离的温度等。
这些因素都会对质粒DNA的提取效果产生影响，需要精确控制，保证实验结果的准确性。
质粒DNA的提取是分子生物学实验的常见步骤之一，其应用广泛。
例如，可以将提取得到的DNA用于质粒转染、DNA测序、基因克隆等研究中。
同时，提取得到的质粒DNA也可以用于分子诊断、疾病基因检测等临床应用。
结论：提取效果和纯度。
提取得到的DNA可以广泛应用于分子生物学及医学研究领域，为后续的实验工作提供了坚实的基础。
总结：质粒DNA的提取是分子生物学实验中不可或缺的一环。
本实验通过严谨的操作步骤和质量检测，成功地提取了高纯度、适量的质粒DNA。
在今后的实验工作中，我们将继续基于这些DNA 样本，进一步开展相关研究，推动科学的发展和创新。
质粒DNA的提取和鉴定
该技术通常具有快速、高效的特 性，能在短时间内处理大量样本。
高通量质粒DNA提取技术可以提 供标准化的操作流程，确保提取 的一致性和准确性。
质粒DNA的测序技术
下一代测序
质粒DNA的测序技术已发展到下一代测序 阶段，能够快速、准确地测定质粒DNA的 全序列。
深度覆盖
通过深度覆盖测序，可以获得质粒DNA更全面的序 列信息，有助于发现稀有变异和基因组结构变异。
注意事项
凝胶电泳检测质粒DNA时，需要注意电泳条件的选择，如电压、电流和时间等，以确保 分离效果最佳。同时，需要使用已知大小的DNA片段作为标准进行对比分析。
紫外分光光度法检测质粒DNA
01
原理
紫外分光光度法是通过测量物质在特定波长下的吸光度来分析物质浓度
的方法。质粒DNA在260nm波长下有最大吸收峰，通过测量吸光度可
基因组编辑
质粒DNA可以作为CRISPR-Cas9等基因组编辑技术的辅助工具，用于向细胞提 供指导编辑的RNA和Cas蛋白。通过将质粒导入细胞，可以实现对特定基因的敲 除、敲入或突变。
在生物技术和生物工程中的应用
生物制药
质粒DNA常被用于生产重组蛋白药物，如胰岛素、生长激素 等。通过在大规模细胞培养物中转染质粒，可以高效地生产 这些药物。
质粒DNA提取的注意事项
保证细菌的活性和纯度
在提取前应确保细菌处于对数生长期，并去除杂质和死细胞。
避免交叉污染
整个操作过程需在无菌条件下进行，并确保使用的工具和试剂无菌。
保证质粒的完整性
提取过程中应避免质粒断裂或降解，以确保后续实验的准确性。
02
质粒DNA的纯化
离心法纯化质粒DNA
原理
通过高速离心将质粒DNA与细 胞碎片、蛋白质等杂质分离，
动物分子生物学实验6重组质粒DNA的提取及插入DNA的酶切鉴定
125
四、实验步骤
接含质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中 370C，190rpm振荡培养过夜
取1.5ml菌液入1.5ml的dorf管中 6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体 100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）
10min 加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体
3 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中，充分混匀，室 温放置10 min。
4 加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管盖，混匀内 容物，将离心管放冰上5 min。
5 加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数 次使混匀。冰上放置15min。
6 12 000r/min，离心10 min，将上清转至另一离心管中。 向上清中加入等体积酚：氯仿 (1:1)（去蛋白），反复 混匀，12 000r/min，离心5 min，将上清转至另一离心 管中。转移时小心！（total volume: 400 μL）
－ 原核细胞 － 繁殖力强, 2-30 分细胞分裂、加倍
DNA
基因组107bp, 编码约2000种蛋白质
质粒（plasmid）
－ 染色体外的稳定遗传因子
－ 双链、闭环的DNA分子，大小1-200 kb 不等 － 存在于细菌、放线菌和真菌细胞中
－ 具有自主复制和转录能力，并表达所携带的遗传信息
DNA
*溶液II 0.2mol/L溶液(3M, pH=4.8)：
60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O
*饱和酚(pH8.0 Tris-HCl饱和) *氯仿 *3M乙酸钠溶液(pH5.2) * TE缓冲液:
10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, * 100%乙醇与70％乙醇
质粒dna提取原理
质粒dna提取原理
质粒DNA提取原理是通过破坏细菌细胞壁和细胞膜结构，释
放质粒DNA，并利用化学方法提取纯化质粒DNA。
质粒DNA提取的步骤如下：
1. 细胞裂解：将细菌培养物经过离心，得到菌体沉淀，然后加入裂解缓冲液，破坏细菌细胞壁和细胞膜，释放质粒DNA。
2. 质粒DNA纯化：加入一定量的碱性溶液，使细菌染色体DNA变性沉淀，而质粒DNA仍溶于溶液中。
然后通过离心，将质粒DNA沉淀下来。
3. 质粒DNA沉淀：将溶液中的质粒DNA与乙醇混合，使质
粒DNA沉淀成片状。
通过离心，得到质粒DNA沉淀。
4. 质粒DNA溶解：将质粒DNA沉淀洗涤去除杂质，并用适
当的缓冲液将质粒DNA溶解，得到高浓度的质粒DNA。
质粒DNA提取的关键在于破坏细菌细胞结构，释放质粒DNA，然后利用沉淀和溶解等步骤进行纯化。
通过以上步骤，可以提取到纯化后的质粒DNA，用于后续实验或分析。
三、 质粒DNA的提取和电泳鉴定
2. 质粒的酶切鉴定：
质粒DNA酶切反应体系 ▪ 10酶切buffer 1 l
▪ 质粒DNA
▪ EcoR1（10u/l）
5 l
1 l
▪ BamH1（ 10u/l ） 1 l
▪ ddH2O加至
10 l
▪ 37℃水浴保温1h；72 ℃水浴15min终止反应。
3.电泳检测目的基因片段
10%SDS+800μl 双蒸水）溶液，颠倒混匀10次，冰浴5min。动作轻
柔，同时控制好时间！
6. 加入 150μl 预冷的乙酸钾溶液，充分颠倒混匀，冰浴 5min。一定要
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ充分混匀！
实验步骤
7.
8. 9.
4℃，12000rpm离心5min，取上清300μl 转移至另一支新的EP 管中。
加等体积异丙醇，冰浴20min，12000rpm离心5min，弃上清 液。 缓慢加入70%乙醇0.5ml，轻轻上下颠倒， 12000rpm离心 1min，吸弃大部分上清，挥干剩余乙醇。注意不要吹打沉淀！
分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；
而染色体 DNA 、大分子 RNA 以及蛋白质 -SDS 复合 物等形成沉淀，可通过离心去除。
实验步骤
1. 在含相应抗生素（ Amp ）的 LB 中接入一单菌落（白色），于 37℃ 剧 烈振摇下培养过夜。 2. 取1.5ml对数生长期的菌体于 Eppendorf 管中，8000rpm 离心1min， 收集菌体。 3. 4. 5. 弃上清液，将EP管倒置在吸水纸上，吸干溶液。 加入100μl GTE缓冲液，轻轻吹打重悬菌体，室温放置5min。 加 入 200μl 新 鲜 配 制 的 NaOH-SDS （ 100μl 2mol/L NaOH+100μl
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3. 溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5乙基-6苯基菲啶溴盐下，发出橙 色荧光
一 细菌培养与质粒扩增
1. 挑单克隆E.coli菌株接种到斜面培养基上（活 化菌种），37℃过夜培养
2. 从斜面培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫升 液体培养液内（含氨苄青霉素），37℃振荡过夜 培养 3. 从中取4毫升种子菌液于含M9培养基中（含Ap）， 37℃振荡培养3-4小时（OD600＝1.0）
2.在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子 筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质 量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的 迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因 此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA 分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构， 最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两个质粒 连在一起），而不是开环结构（用EcoRI来线性化 质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA 的位置与这三条带的位置不一样）
DNA分子大得多，而且染色体DNA被断裂成线
状分子，但质粒DNA为共价闭环结构，当加热
或用酸、碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA
容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却和
回到中性pH时即恢复其天然构象
注意
• EB是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应 带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该 染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的 器皿或物品，必须进行清洗或弃去
5.加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠 倒数次使混匀，冰上放置5min 6.12000r/min，离心5min，将上清夜转至另一 Eppendorf管中 7.向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置510min。12000r/min离心5min。倒去上清夜，把 Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体 8.用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心， 倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥 9.50μL TE缓冲液，使DNA完全溶解（-20℃保存）
二
质粒提取
1. 取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中， 12000r/min，4℃，30sec 2. 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥 3. 将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中， 剧烈振荡 4. 加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧 Eppendorf管，快速颠倒5次，混匀内容物， 将Eppendorf管放在冰上
酶切鉴定
10μL溶液 + 10×内切酶缓冲液2μL + 5～10U酶
到一Eppendorf管 37 ℃，1-2h 加2μL的反应中止液。 电泳： 1. 1％Agrose gel的制备 2. 上样 3. 电泳 4. 紫外灯下观察和拍照
思考题
染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？
参考答案
纯化DNA的方法主要依据染色体DNA比质粒
• 选择哪一种方法主要取决于以下几个因素： 质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于
纯化的技术和实验要求
碱裂解法
基本原理：
1. 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋
白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质
粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离 心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复 性而呈絮状，离心时可沉淀下来
质粒DNA的提取和鉴定
目的
•
•
掌握碱裂解法提取质粒的方法
了解质粒酶切鉴定原理
质粒DNA的提取方法
• 方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析 法，质粒DNA释放法；酸酚法等。 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、 有机溶剂或碱进行处理及用加热处理 • 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培 养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒 DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)