质粒DNA的提取和鉴定
阳性克隆鉴定和质粒DNA提取
鉴定步骤
01
菌落PCR法鉴定步骤
02
1. 挑取单菌落至PCR管中，加入裂解液裂解菌体。
03
2. 设计特异性引物，并进行PCR扩增。
鉴定步骤
3. 电泳分析PCR产物，观察是否有特异性条带。 质粒DNA酶切法鉴定步骤
1. 提取质粒DNA。
鉴定步骤
01
2. 选择合适的限制性内切酶进行酶切。
02 3. 电泳分析酶切产物，观察是否有特异性条带。
提高基因工程实验的准确性
确保质粒DNA的质量和纯度，可以提高阳性克隆鉴定的准 确性，为后续实验提供可靠的基因材料。
推动基因工程领域的发展
对阳性克隆鉴定与质粒DNA提取的关联性进行深入研究， 有助于推动基因工程领域的发展，为基因治疗、基因编辑 等应用提供技术支持。
05
实验设计与操作注意事项
实验设计原则
试剂盒法
使用商业化试剂盒进行质粒DNA提 取，操作简便且提取效率高。
提取步骤
细菌培养
将含有目标质粒的细菌接种到适当的 培养基中，进行扩增培养。
细菌收集
通过离心等方法收集细菌沉淀。
02
01
03
细胞裂解
使用碱裂解法、煮沸法或试剂盒法等 方法裂解细菌细胞壁，释放质粒DNA。
质粒DNA定量
使用分光光度计等方法对提取的质粒 DNA进行定量。
质粒dna的提取与鉴定实验报告
质粒dna的提取与鉴定实验报告
质粒DNA的提取与鉴定实验报告
引言：
DNA是生物体内重要的遗传物质，其中质粒DNA作为细菌细胞外的环状DNA 分子，在基因工程、遗传学和生物技术研究中具有重要的应用价值。本实验旨在通过提取和鉴定质粒DNA，探究其结构和功能。
材料与方法：
1. 细菌培养液：含有质粒DNA的细菌培养物。
2. 离心管：用于离心细菌培养物。
3. 离心机：用于离心细菌培养物。
4. 细胞裂解液：用于破坏细菌细胞壁，释放质粒DNA。
5. 蛋白酶K：用于降解蛋白质，去除细胞核酸。
6. 高盐溶液：用于沉淀质粒DNA。
7. 乙酸：用于沉淀DNA。
8. 冷乙醇：用于沉淀DNA。
9. 紫外分光光度计：用于测定DNA的浓度和纯度。
10. 凝胶电泳仪：用于鉴定提取的质粒DNA。
实验步骤：
1. 取适量细菌培养液，离心细菌培养物，收集菌体沉淀。
2. 加入适量细胞裂解液，充分混匀，使细菌细胞壁破裂，释放质粒DNA。
3. 加入适量蛋白酶K，降解蛋白质，去除细胞核酸。
4. 加入高盐溶液，使质粒DNA沉淀。
5. 离心沉淀，收集质粒DNA。
6. 加入适量乙酸和冷乙醇，沉淀DNA。
7. 离心沉淀，收集DNA。
8. 使用紫外分光光度计测定DNA的浓度和纯度。
9. 使用凝胶电泳仪鉴定提取的质粒DNA。
结果与讨论：
通过实验，我们成功提取了质粒DNA，并进行了鉴定。首先，通过紫外分光光
度计测定，我们得到了DNA的浓度和纯度。浓度的高低反映了提取的DNA量，纯度则表示DNA中杂质的含量。高浓度和高纯度的DNA适合用于后续实验。
质粒dna的提取与鉴定实验报告
质粒DNA的提取与鉴定实验报告
引言
质粒DNA的提取与鉴定是分子生物学实验中常用的技术之一。质粒DNA是一种圆形的DNA分子，广泛存在于细菌和真核生物中。提取和鉴定质粒DNA能够帮助研究人员进行基因克隆、基因表达调控等实验。
本实验旨在介绍质粒DNA的提取与鉴定步骤，以供初学者了解和学习。
实验材料
•细菌培养物
•质粒DNA提取试剂盒
•去离子水
• 1.5 mL离心管
•微量离心管
•离心机
实验步骤
步骤一：培养细菌并收获培养物
1.取一支含有目标质粒的细菌培养物，将其接种至含有适当抗生素的培
养基中。
2.在37℃恒温摇床上培养过夜，确保细菌得到充分生长。
步骤二：收获细菌培养物
1.将培养基离心机中以12000转/分钟离心2分钟，以沉淀细菌细胞。
2.弃去上清液，将细菌细胞沉淀保留在离心管中。
步骤三：质粒DNA的提取
1.选择一款质粒DNA提取试剂盒，按照说明书中的步骤操作。不同试
剂盒所用方法有所差异，详细操作请参照试剂盒说明书。
2.在质粒DNA提取试剂盒提供的试剂中加入细菌细胞，充分混合。
3.通过离心将细菌细胞裂解，释放出质粒DNA。不同试剂盒所用离心
条件有所不同，一般为高速离心1-3分钟。
4.弃去上清液，留下含有裂解细胞的混悬液。
步骤四：质粒DNA的纯化
1.将质粒DNA混悬液转移到新的离心管中。
2.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
3.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
4.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
5.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
6.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
7.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
质粒dna的提取和鉴定
原理示意图
质粒DNA电泳
电场中DNA分子的迁移速度取决于： ❖ DNA分子本身的大小 ❖ DNA分子的空间构型
超螺旋构型（ccDNA) 线形DNA(lDNA) 开链环状DNA(ocDNA) 复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起)
•溴化乙锭（EB）是一种荧光染料(3,8-二氨基5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核 酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙 色荧光
培养3-4小时（OD600＝1.0） 3.取4ml培养液至Eppendorf管中，12000 rpm，4 ℃离心30
秒，弃上清，用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并 重复一次，弃上清，取沉淀。
步骤二 质粒提取
1. 取4ml培养物至Eppendorf管中，12000rpm， 4℃，离心30sec，弃上清。
2. 用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复 一次，弃上清取沉淀，使细胞沉淀尽可能干燥。
3. 将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中，加入10 µl溶菌酶（10mg/ml），剧烈振荡均匀，冰上放 置1分钟。
4. 加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf 管，快速轻柔颠倒5次，混匀内容物，将 Eppendorf管放在冰上3分钟 。
Attention, please!
❖ EB是强诱变剂，配制和使用EB染色液时， 应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将 该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB 的器皿或物品，必须进行清洗或弃去！
质粒DNA的提取及鉴定
实验1 质粒DNA提取及鉴定
1.含质粒DNA细菌于LB培养基中培养过夜，将菌液分装至EP
管中（1ml/支），离心去上清。
2.沉淀重悬浮100ul溶液Ⅰ（50 mmol/L葡萄糖、10mmol/L
EDTA、25mmol Tris-HCl pH8.0）中, 震荡混匀。
3.加入200ul新鲜配制的溶液Ⅱ（1mol/L NaOH 200ul、10%
SDS 100ul、H2O 700ul），颠倒混匀10次。
4.加入150ul溶液Ⅲ（29.4g KAc、11.5ml冰醋酸、加水至100ml）
颠倒混匀，冰浴5min，12000rpm离心10min。
5.上清移至另一干净EP管中，加入等体积饱和酚（约450ul）
充分颠倒混匀，12000rpm 离心10min。
6.上清移至另一干净EP管中，加入等体积酚/氯仿，颠倒混匀，
12000rpm离心10min。
7.上清移至另一干净EP管中，加入2倍体积冷无水乙醇混匀，
静置5min，12000rpm离心10min.
8.弃上清，用0.5ml 70% 乙醇洗涤DNA，弃上清，倒置干燥。
9.加入10ul TE，于1%琼脂糖凝胶电泳观察鉴定。
10.
遗传学 实验四 质粒DNA的提取与鉴定
实验四质粒DNA的提取与鉴定
一、实验目的
1、熟悉细菌的培养和质粒的扩增。
2、学习和掌握从大肠杆菌中提取质粒DNA的原理和方法以及琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。
二、实验原理
质粒广泛存在与原核细胞中，大多是双联的共价闭合环状DNA分子，长度可以从1kb 到200kb不等，是染色体外寄生性的自主复制子，在细胞分裂时能恒定地传递给子代细胞。在分子生物学研究中，为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA，通常使用松弛型（其复制受宿主的控制不严格，在宿主细胞中拷贝数较多）质粒。
从大肠杆菌中分离质粒的方法很多，常见的有煮沸法和碱变性抽提法。碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复兴差异而达到分离的目的。在pH高达12.5的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节pH至中性时，变形的质粒DNA又恢复到原来的构型，通过离心保留在溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。
在抽屉过程中，由于各种因素的影响，同一质粒DNA可能呈现以下不同的构型：①超螺旋型，即共价闭合环状DNA（cccDNA）；②一条链发生一处或多处断裂，致使另一条链发生自由旋转，分子内的扭曲折叠消失，形成松弛的分子即开环DNA（ocDNA）；③两条链都发生了随机的断裂成为线状DNA。在这三种构型中，cccDNA由于扭曲折叠，体积很小，在具有分子筛效应的琼脂糖凝胶电泳中受到阻力最小，迁移速度最快；ocDNA因扭曲状态被破坏而呈松弛的环状，迁移速度较慢；线状DNA受到的阻力最大，迁移速度最慢。
质粒DNA提取鉴定
pBR322质粒(4363bp) : 主要包括：
①限制性内切酶位点（插入 外源基因）；
②含有terr、ampr抗药基因， 可作为筛选标志。
③ 含 有 复 制 起 始 点 ori （ 赋 予
其复制特性）。
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
)
(
四环素抗性基因 （Tetr）失活
M13噬菌体： M13mp系列 pUC系列
2人一组
[操作]
细菌的培养 1. 接种：从-20℃取出菌种，斜面划线接种，37
℃培养24 h 2. 单克隆培养： 挑单个菌落，接种于LB培养
液中（含Amp 50μg/ml) 4-6 h。 3. 菌液0.2 ml＋10 ml LB培养基（含Amp
50μg/ml) 37 ℃培养过夜。
周四A.M.10：00 每小组来一个代表，在林春兰老师指导下完成。
鉴定
(质粒分子量、纯度及是否含有所需要DNA段)
(一) 酶解
双酶切体系：
单酶切体系：
sample
5 ul
BamH Ⅰ 1 ul
sample
5ul
HindⅢ
1 ul
HindⅢ
1 ul
10×buffer 2.5 ul
10×buffer 2.5 ul
ddH2O
15.5 ul
ddH2O 16.5 ul
质粒dna的提取与鉴定实验报告
质粒DNA的提取与鉴定实验报告
1. 实验目的
本实验的目的是通过提取和鉴定质粒DNA，掌握质粒DNA的提取方法并验证提取的质粒DNA的纯度和完整性。
2. 实验原理
质粒DNA提取是将质粒DNA从细菌细胞中分离出来的过程。常用的提取方法包括碱裂解法和商业试剂盒法。本实验使用商业试剂盒法进行质粒DNA的提取。
步骤如下： 1. 培养目标细菌，并收集细菌培养物。 2. 细菌培养物离心，收集细菌沉淀。 3. 加入细胞裂解缓冲液裂解细胞膜。 4. 加入溶解剂，使细胞溶解。 5. 加入酒精，沉淀出质粒DNA。 6. 分离质粒DNA，去除其他杂质。 7. 测定质粒DNA的纯度和完整性。
3. 实验步骤
3.1 培养目标细菌
1.取出目标细菌的冻存管，从-80°C的冷冻库中快速解冻。
2.取出琼脂平板，用无菌技术将细菌转接到琼脂平板上，利用无菌鹤嘴
锄均匀涂抹。
3.将琼脂平板倒置放置在37°C恒温培养箱中，培养一夜。
3.2 收集细菌培养物
1.取出含有细菌的琼脂平板，加入适量的无菌LB培养基。
2.用无菌移液管将培养基中的细菌转移到无菌离心管中。
3.将离心管放入低速离心机中，离心5分钟，将细菌沉淀收集。
3.3 细胞裂解
1.向细菌沉淀中加入适量的细胞裂解缓冲液。
2.充分混合后，放置在冰上浸泡20分钟，使细菌细胞膜裂解。
3.4 细胞溶解
1.加入等体积的溶解剂，充分混合。
2.将含有细胞裂解物的离心管放入冰上浸泡5分钟。
3.5 DNA沉淀
1.向离心管中加入等体积的冷酒精。
2.轻轻倾斜离心管，使酒精与溶液充分混合。
3.放置在-20°C冷冻库中沉淀20分钟。
质粒DNA提取、鉴定
我们单独用酚抽提酚，会有大量的酚溶解到水相中， 而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因 此用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去 除。
至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层 的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
也可用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水
相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀
复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
收集菌体
1. 取6 个1.5 ml Eppendorf管，分别加入细菌 培养液1.4 ml ↓ 9000rpm 2-3min ↓↘弃上清 2. 600 μl STE液依次溶解各管沉淀，合并一管 再用200 μl STE液清洗各管，清洗液合并一 管（收集菌体 ） 200ul ↓ 9000rpm 2-3min ,弃上清 600ul （保留菌体）
能蛋白质（表达某种遗传性状，如抗药性（抗氨 卞青霉素、抗四环素等），耐受重金属，产生细 菌素等等）。即很多质粒往往都赋予其宿主细胞 一定的表型。
质粒分类：
严紧型（每个细胞1－5个质粒）
质粒的复制与宿主染色体复制同步进行，因而一个宿主细
胞中只有一个或几个质粒拷贝。当宿主蛋白合成被抑制，
染色体复制停止，质粒的复制也停止；
鉴定质粒
提取质粒、单酶切、双酶切样本一起电泳，与marker比 较，估计质粒大小。
线性化（单酶切）：
用HindⅢ将质粒酶切、电泳，估计其分子大小。
质粒DNA的提取和鉴定
质粒DNA的提取和鉴定
背景资料如下：
质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。细菌质粒大小介于1～200Kb之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。
质粒DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件又可以使DNA复性。SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。所以，SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境就会变性。然后，用酸性乙酸钾中和溶液碱性使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA由于分子巨大在短时间内难以复性。离心后，质粒DNA将留在上清中，染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。
测定DNA浓度的方法有两种：一是利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；一是利用溴化乙锭荧光强度法测定样品中溴化乙锭发射的荧光强度来计算核酸的含量。（1）紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm处的吸收峰即可对DNA进行定量。一般在中性pH环境条件下进行测定，此方法常用于测定比较纯净的DNA样品。（2）溴化乙锭荧光强度法：溴化乙锭能与DNA结合并嵌入双链中，当受紫外光照射时会激发产生荧光，且荧光的强度与DNA含量成正比。
质粒DNA的提取和鉴定
序列的查询与获得
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
输入基因名称
选择查询项目
点击“Go”
注意选择人属物种的基因
mRNA序列 蛋白质序列
基因组序列
运行DNAstar软件
点击“OK”
选取编码区序列
密码子使用分析 http://www.kazusa.or.jp/codon/countcodon.html
第二部分，质粒DNA的提取与鉴定
实验目的
掌握碱裂解法提取质粒的方法 了解质粒酶切鉴定原理
质粒DNA的提取方法
方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。 碱裂 解法有操作简便、快速、得率高的优点。
概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理
Bgl II
别位于质粒的第 2bp和第 5622bp处。
实验操作
一 细菌培养与质粒扩增 将微量质粒转化至大肠杆菌中，挑单克隆于LB培养液中培养。 二 质粒提取 1. 取1.5ml培养物倒入 Eppendorf 管中，8000 rpm室温离心1 min； 2. 弃去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥； 3. 将细菌沉淀悬浮于100 µl预冷的溶液I中，剧烈振荡，使沉淀完全分散； 4. 加200 µl溶液II（新鲜配制），盖紧 Eppendorf 管，温和颠倒混合6～8次；
质粒dna的提取与鉴定实验报告
质粒dna的提取与鉴定实验报告
一、实验目的
本实验旨在了解质粒DNA的提取方法、鉴定方法及其应用，并掌握相应的实验操作技能。
二、实验原理
质粒DNA是细胞内存在于细胞质中的一种环状双链DNA，通常具有自主复制和自主转录等特性。提取质粒DNA主要采用碱裂解法，即通过加入碱性物质使细胞膜溶解，从而释放出细胞内的质粒DNA。鉴定质粒DNA则需要使用凝胶电泳法，即将提取出的质粒DNA样品经过电泳分离，从而观察到不同大小和形态的质粒DNA带。
三、实验材料和设备
1. 大肠杆菌菌株；
2. 质粒抽提试剂盒；
3. 1%琼脂糖凝胶；
4. TAE缓冲液；
5. DNA分子量标记物；
6. UV透射仪；
7. 手套、口罩等个人防护用品。
四、实验步骤
1. 大肠杆菌培养：将大肠杆菌菌株接种于LB培养基中，在37℃下静置培养至菌液浑浊；
2. 质粒DNA提取：按照试剂盒说明书进行操作，将培养好的大肠杆菌菌株经过离心分离出细胞沉淀，加入裂解缓冲液后进行碱裂解，最后使用洗涤缓冲液洗涤并提取质粒DNA；
3. 凝胶电泳：将凝胶放置于电泳槽中，加入TAE缓冲液，将提取好的质粒DNA样品和分子量标记物混合后均匀加入凝胶孔中，进行电泳分离；
4. 质粒DNA鉴定：在UV透射仪下观察凝胶板上的DNA带，并根据分子量标记物判断质粒DNA的大小。
五、实验结果
通过实验我们成功地提取出了大肠杆菌中的质粒DNA，并通过凝胶电泳观察到了不同大小和形态的质粒DNA带。根据分子量标记物我们可以初步估计出这些质粒DNA的大小范围。
六、实验总结
本次实验掌握了质粒DNA的提取和鉴定方法，并成功地进行了实验操作。同时也发现了实验中可能存在的问题和改进的空间，例如在质粒DNA提取过程中需要注意细胞沉淀的清洗和干燥等细节问题。通过本次实验，我们对质粒DNA的应用和相关技术有了更深入的了解。
质粒DNA的提取和鉴定
性。
限制性内切酶分析法检测质粒DNA
原理
限制性内切酶是一种能够识别并 切割特定DNA序列的酶。通过使 用限制性内切酶对质粒DNA进行 酶切，可以得到具有特定片段的 DNA片段，从而判断质粒DNA的 结构和大小。
步骤
注意事项
将提取的质粒DNA样品进行限制 性内切酶酶切，然后进行凝胶电 泳分离。通过观察凝胶上的条带， 可以判断质粒DNA的结构和大小。
达到纯化目的。
步骤
细胞破碎、低速离心、收集上 清液、高速离心、收集质粒 DNA。
优点
操作简单，成本低。
缺点
纯度相对较低，易受杂质影响 。
柱式纯化质粒DNA
原理
利用特殊的吸附材料将质粒DNA从溶液中吸附，再通过 洗涤去除杂质，最后释放质粒DNA。
步骤
将细胞破碎后的上清液加入吸附柱、吸附、洗涤、洗脱。
基因表达
在基因表达领域，质粒DNA常被用作表达载体，将目的基因转录和翻译成蛋白 质。通过将目的基因插入质粒，并在宿主细胞中转染，可以实现目的基因的高 效表达。
在基因治疗和基因组编辑中的应用
基因治疗
质粒DNA可以作为基因治疗的载体，将正常的基因导入病变细胞，以补偿缺陷基 因或抑制有害基因的表达。通过这种方式，可以治疗一些遗传性疾病和传染病。
优点
纯度高，操作简便。
缺点
成本较高，某些质粒可能无法完全回收。
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酶切鉴定
10μL溶液 + 10×内切酶缓冲液2μL + 5～10U酶
到一Eppendorf管 37 ℃，1-2h 加2μL的反应中止液。 电泳： 1. 1％Agrose gel的制备 2. 上样 3. 电泳 4. 紫外灯下观察和拍照
思考题
染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？
参考答案
纯化DNA的方法主要依据染色体DNA比质粒
2.在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子 筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质 量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的 迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因 此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA 分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构， 最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两个质粒 连在一起），而不是开环结构（用EcoRI来线性化 质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA 的位置与这三条带的位置不一样）
• 选择哪一种方法主要取决于以下几个因素： 质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于
纯化的技术和实验要求
碱裂解法
基本原理：
1. 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋
白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质
粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离 心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复 性而呈絮状，离心时可沉淀下来
二
质粒提取
1. 取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中， 12000r/min，4℃，30sec 2. 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥 3. 将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中， 剧烈振荡 4. 加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧 Eppendorf管，快速颠倒5次，混匀内容物， 将Eppendorf管放在冰上
5.加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠 倒数次使混匀，冰上放置5min 6.12000r/min，离心5min，将上清夜转至另一 Eppendorf管中 7.向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置510min。12000r/min离心5min。倒去上清夜，把 Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体 8.用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心， 倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥 9.50μL TE缓冲液，使DNA完全溶解（-20℃保存）
DNA分子大得多，而且染色体DNA被断裂成线
状分子，但质粒DNA为共价闭环结构，当加热
或用酸、碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA
容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却和
回到中性pH时即恢复其天然构象
注意
• EB是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应 带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该 染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的 器皿或物品，必须进行清洗或弃去
质粒DNA的提取和鉴定
目的
•
•
掌握碱裂解法提取质粒的方法
了解质粒酶切鉴定原理
质粒DNA的提取方法
• 方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析 法，质粒DNA释放法；酸酚法等。 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、 有机溶剂或碱进行处理及用加热处理 • 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培 养细ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒 DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)
3. 溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核 酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙 色荧光
一 细菌培养与质粒扩增
1. 挑单克隆E.coli菌株接种到斜面培养基上（活 化菌种），37℃过夜培养
2. 从斜面培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫升 液体培养液内（含氨苄青霉素），37℃振荡过夜 培养 3. 从中取4毫升种子菌液于含M9培养基中（含Ap）， 37℃振荡培养3-4小时（OD600＝1.0）