适合植物组织原位杂交和原位PCR的切片制作
原位杂交操作流程
杂交后处理
2×SSC脱去盖膜（片） 50℃
2×SSC清洗 37℃ 10 min×2
20μg/mlRNaseA in Rnsae buffer 37℃ 30 min
Rnase buffer 37℃ 30 min
Rnsae buffer;2M Tris 5ml 0.25MEDTA 4ml 3MnaCl 167ml pH8.0 D W→ 1000ml
流水冲洗 5-10min
1%甲基绿复染3-10min， 水洗，晾干，封固
DNA探针检测石蜡 切片中DNA
组织标本
• 肝穿刺组织，常规石蜡包埋，4m连续 石蜡切片，贴在涂有切片粘合剂的干净 载玻片上，58℃烤18h。
试剂
1．20×SSC 2．HBV cDNA-Dig探针 5g 3．4％多聚甲醛 4．0.1mol/L PBS，pH7.4 5．0.2mmol/L HCl 和0.1mol/L甘氨酸 PBS pH7.4 6．0.4 ％Tritor X-100 PBS pH7.4 7．蛋白酶 20g/ml 8．0.25％乙酸酐，用0.1mol/L三乙醇胺配制 9．预杂交缓冲液和杂交缓冲液 10. AKP标记抗Dig Fab段二抗，可1:500稀释 11. TSM、TSM2（配制参阅附录4） 12. NBT和BCIP显色液或用AKP显色Kit
500ml
封闭；0.5%抗体阻断液 in BufferⅠ（含0.2%Tween20）
原位杂交步骤自己整理的精讲
原位杂交步骤自己整理的精讲
原位杂交是一种常用的实验方法，可以用来检测DNA或RNA序列在细
胞或组织中的分布情况。这种方法可以帮助研究人员确定基因在染色体上
的位置，并研究基因的表达和调控。下面是原位杂交的详细步骤：
1.样品处理：首先，需要提取并处理样品中的细胞或组织。这一步骤
通常包括细胞固定、组织切片和蛋白酶处理等。细胞固定能够保持细胞的
形态和结构，而组织切片则能够使得样品更容易进行观察和分析。蛋白酶
处理的目的是通过消化蛋白质来提高核酸的可达性。
2.探针设计：在进行原位杂交之前，需要准备一个能够与目标DNA或RNA序列互补配对的探针。这个探针通常是由DNA或RNA序列构建而成的，可以通过人工合成或PCR扩增获得。在设计探针时，一般要考虑到探针的
长度、碱基组成和互补性等因素。
3.标记探针：为了便于后续的检测，需要将探针标记上报告标记物。
常用的报告标记物有荧光染料、放射性同位素和酶等。标记探针的方法通
常包括非放射性标记和放射性标记两种方式，具体选择哪一种方法取决于
实验的需求和要求。
4.杂交反应：将标记好的探针与样品中的DNA或RNA序列进行杂交反应。这种反应通常在固定样本上进行，样品和探针会在适当的杂交缓冲液
中反应一段时间。杂交反应的温度和时间会根据探针的长度和互补性等因
素进行调节。反应结束后，通常需要进行洗涤以去除未结合的探针和杂交
缓冲液。
5.可视化和分析：经过洗涤之后，探针与目标DNA或RNA序列杂交形
成的杂交体可以通过其中一种方法进行可视化和分析。常用的方法包括荧
光显微镜观察、放射性测量和酶活性检测等。通过这些方法，可以确定目标序列在样品中的分布情况和数量。
荧光原位杂交 操作
荧光原位杂交操作
荧光原位杂交（FISH）是一种基因组学的技术，它使用荧光探针将特定的DNA序列定位在染色体上。这种技术被广泛用于分析染色体的结构和功能，以及人类基因组变异和疾病的研究。本文将介绍荧光原位杂交操作的步骤。
步骤1：样品制备
FISH技术可以应用于不同种类的样本，如人类细胞、动植物组织等。对于人类细胞的样本，常用的方法是将细胞分离，制作成染色体悬液。
首先要通过荧光染色法把两种不同的染色体和特定的基因序列染成不同的颜色。这需要用到已知基因序列的探针，可以从已有的文献中获取。如果没有，可以通过设计和合成新的探针。
步骤2：制作探针
FISH探针是由一段DNA片段制成的。这个片段可用PCR方法从DNA中扩增出来，或者可以通过化学合成的方法制造。制造探针时需要注意，探针的长度和序列应该与目标序列相匹配，可以通过BLAST或其他基因数据库检索确认。
通常使用荧光染料标记探针，以便在镜头下观察到探针的定位。常用的标记分子有荧光素（FITC），荧光素同路胺（rhodamine）和锔（Cy3和Cy5）。这些分子的选择取决于探针和荧光显微镜系统的兼容性。
在制作FISH探针时，需要注意探针的特异性和灵敏度。为了达到这一目的，需要经过一系列的标记、纯化和探针肢解操作。
探针一般都是双链DNA，通过加入单链转化酶（S1）或DNA酶I，使双链DNA变成单链DNA，并标记在其5'-末端上。标记完成后，进行染色体裂解、脱氧核糖核苷酸（dNTP）和DNA聚合酶的反应来进行回收和标记探针，以免对染色体质量产生影响。对于高复杂度的基因组，可以使用克隆探针阵列，在单个染色体上定位多个序列。
原位杂交与凋亡检测技术
原位杂交 (in situ hybridization,ISH) 是应用已知碱基顺序并带有标记的核酸探
针与组织、细胞中的待测的核酸按碱基配
对的原则进行特异的结合而形成杂交体。
再应用与标记物相应的检测系统，通 过组织化学或免疫组织化学方法在被检测
的核酸原位形成带有颜色的杂交信号，在
合酶作用下进行RNA转录而成。 特点：长度随意，稳定，信号更强。
3、寡核苷酸探针：已知基因序列，由核 酸合成仪合成。
特点：链短，杂交速度快，特异性强，
价廉质稳。
四、原位杂交技术的应用： 1、 基因芯片（基因组图）； 2、 基因表达定位； 3、 转基因检测。
4、核DNA和 RNA 的mRNA的排列和运 输，复制和细胞分类
7、滴加杂交探针稳定液37-400C 反应 4-6小时（此步可省略）。
8、0.2×SSC洗涤5分钟×3次。
9、滴加封闭液：室温20分钟，不洗。
10、滴加兔抗地高辛：370C ，60分钟。
11、 0.5M PBS洗5分钟×3次。
12、滴加生物素化羊抗兔IgG，370C，
30分钟。
13、0.5M PBS洗5分钟×3次。
HER2荧光原位杂交
皮肤鳞状上皮细胞核HPV DNA（+） ISH
宫颈粘膜 上皮HPV16（+） ISH
宫颈粘膜上皮HPV16（+） ISH
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的
基本原理和操作步骤
普通PCR
1概述
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki 等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。
miRNA原位杂交技术的诸多影响因素分析-医学检验论文-基础医学论文-医学论文
miRNA原位杂交技术的诸多影响因素分析-医学检验论文-基础医学论文-医学论文
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MicroRNA(miRNA,miR)是广泛存在于生物个体的一类非蛋白编码小分子RNA。作为动植物体内的重要调控分子,miRNAs与细胞的基因表达、个体发育、组织分化等一系列生理、病理过程密切相[1,2]关。
因能进行定性、半定量及定位分析,在异质性明显的组织标本中,miRNA原位杂交(miRNA in-situhybridization,MISH)技术不仅具有较其他常规miRNA分析方法操作简便、费用低廉等优点,同时,由于miRNA具有不易降解而在石蜡包埋组织中长期稳定存在的特性,使得MISH技术在临床科研中的应用受到越来越多的关注[3,4]。然而,常规MISH操作仍然受到多重因素的影响,包括临床标本的组织来源、保存时间;组织切片的厚度;蛋白酶K的浓度、孵育时间;探针的浓度、孵育时间、特异性;显色方式等。为此,对影响MISH技术操作的诸多因素进行实验探讨,有助于该方法的建立、完善并在科研工作中广泛应用。
材料和方法
1.材料原位杂交实验中的石蜡组织均来源于南昌大学附属感染病医院病理科。所有石蜡组织均常规4%中性甲醛固定、石蜡包埋,经HE染色证实其病理类型。
2.试剂U6和miR-375地高辛标记探针及其相关原位杂交检测试剂购自丹麦Exiqon公司,原位杂交封闭液与洗涤液购自美国Roche 公司;TrizolRNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司;miRNA逆转录与PCR引物购自广州市锐博生物科技有限公司;逆转录试剂盒(RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit)购自美国Thermo公司;实时定量PCR试剂盒(SYBR PremixExTaqTM)购自日本Takara公司。
原位杂交原理及具体操作
原位杂交实验原理与方法
一、目的
本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。
二、原理
原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。
当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。
探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。目前，大多数放射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。
探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。cDNA探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。
原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。
菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将NDA烘干固定于膜上与32P 标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。
组织切片技术
组织切片技术
姓名：许莎班级：生技121学号：12772018
组织切片技术是研究生物组织或细胞形态和结构的重要技术，对于促进细胞生物学和遗传学等研究的发展起着重要作用。最早的制片技术是徒手切片技术，以后发展了利用石蜡进行包埋和切片的制片技术，即石蜡切片技术，该技术由于成本低，操作简单，目前仍在应用，该技术被越来越多的研究工作者应用于发育学、植物细胞学、胚胎学、解剖学等研究领域。
1组织切片技术原理
1.1原理
组织切片技术是研究组织形态学最常用的一项基本技术，在制作胚胎或组织切片时，由于细胞或组织是柔软的或局部的软硬不均，这样制作厚薄均匀的切片很困难。为了能清晰地观察到组织结构及细胞形态，必须先经过一系列步骤将组织内渗入某些支持物质，使组织变硬然后利用切片机将组织切成薄片。根据所用支持剂的种类不同，主要分为石蜡切片、冰冻切片、振动切片、火棉胶切片、塑料切片、碳蜡切片等。
1.2分类
1.2.1石蜡切片
该技术是最重要、最常用的组织切片技术之一，起始于18世纪。此法是用石蜡作为包埋剂，将材料经过固定、脱水、透明后包埋在石蜡中，然后连同石蜡用切片机一同进行切片。石蜡切片的主要优点是不仅可以把材料制成薄的切片，而且还能制成连续切片，这是其他制片技术难以做到的。它的缺点是操作步骤比较复杂，而且材料在脱水、透明过程中会收缩、变硬、变脆，以致不易切片[1]。
1.2.2冰冻切片
冰冻切片是利用干冰或液氮等速冻剂使组织迅速冷冻硬化，将组织在冷冻状态下直接用切片机切片的一项技术。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。由于此法不需要经过各级乙醇的脱水、二甲苯的透明和浸蜡等步骤，因而较适合子脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断冰冻切片是酶组织化学和免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。此种切片的优点是能较好的保存组织的RNA 稳定性、较完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性以及抗原的免疫活性，缺点是需要较高的设备要求;切片较厚，导致组织结构显示欠佳;通常不能进行连续切片。其主要操作技术和方法与石蜡切片过程和类似。
石蜡切片原位杂交免疫组化
病理检验技术
江汉大学医学与生命科学学院
病理学与病理生理学教研室
2004年4月
内容提要
本书介绍组织病理学常用的多种技术。包括常见的技术，即福尔马林固定、石蜡包埋、HE染色技术，同时也介绍了常用的特殊染色技术，免疫组织化学技术，并简明地介绍了分子生物学技术的基本理论以及在组织病理学中的应用。
全书理论与实践并重，经典与改良结合，内容丰富，通俗易懂，实用性强，为实验室工作的必备参考书。适合从事病理学、组织学、生物学、法医学等的科研教学和临床工作的技术人员、教师、医师和研究生使用。同时也适合临床医学检验专业中专、专科生使用以及临床医学专业专升本学生和临床医学专业本科生选用。
第一篇石蜡切片技术
第一章组织标本的处理
第一节取材 (5)
第二节组织的固定 (6)
第三节大体标本的处理和固定 (14)
第四节陈列标本的固定 (15)
第五节脱钙 (16)
第六节组织的冲洗 (18)
第二章石蜡包埋技术
第一节脱水 (19)
第二节透明 (21)
第三节浸蜡 (22)
第四节包埋 (22)
第三章切片技术
第一节切片刀 (25)
第二节切片机 (27)
第三节石蜡切片的制作 (27)
第四节特殊组织石蜡切片的制作 (29)
第五节石蜡切片的异常及处理 (29)
第四章染色与染色剂
第一节染色的基本原理 (31)
第二节染色剂染色的化学基础 (33)
第三节染色剂的分类 (34)
第四节常用染色剂及配制 (35)
第五节苏木素—伊红染色法 (39)
第六节封固剂 (41)
第五章特殊染色技术
第一节结缔组织染色法 (43)
第二节脂类染色法 (47)
第三节糖原及粘液染色法 (48)
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中的位置的技术。下面将详细介绍荧光原位杂交的具体步骤和相应的详细说明。
1.细胞准备
首先，需要准备细胞样本。可以选择使用原代细胞，细胞悬液或切片等。
2.固定
将细胞固定在载玻片或载玻片上面。固定通常使用的试剂是乙酸乙酯和甲醇的混合物，通常比例为1:3
3.水合
将载玻片中的组织或细胞水合处理。这一步可以通过将载玻片浸泡在去离子水或缓冲液中进行。
4.处理
将载玻片进行预处理，以使DNA或RNA序列更易于杂交。常用的预处理方法有：
-煮沸：将载玻片浸泡在2×SSC（1×SSC：
0.15MNaCl,0.015MNa3C6H5O7·2H2O,pH7.0）中，然后置于热盖板上加热至100°C，持续约10-20分钟。
-碱性水解：将载玻片浸泡在10%NaOH中，进行碱性水解，然后在盐溶液中冲洗。
5.杂交探针
准备荧光探针或荧光标记的引物。探针的选择取决于要检测的DNA或RNA序列。探针的设计通常基于目标序列的序列信息，并且通过化学修饰
和荧光标记以增加其杂交效率和检测灵敏度。
6.杂交
将探针加到载玻片上的样本上，并与目标序列进行杂交。杂交过程中，探针与目标序列进行互补配对，形成探针-目标复合物。杂交的温度取决
于探针的碱基组成和目标序列的GC含量。
7.洗涤
将载玻片在洗涤缓冲液中进行洗涤，以去除未与目标序列杂交的探针。
8.检测
使用荧光显微镜观察载玻片上的标记。荧光标记的探针将通过荧光显
原位PCR技术的原理、方法和应用
2. 1 原位PCR的原理
先将细胞或组织进行处理(固定、酶消化) ,以获得适度的细胞通透性,既有利于PCR反应试剂达到靶目标,又可防止扩增后产物漏出。然后将载玻片或盖玻片放入热循环机对靶DNA等细胞内靶目标在原位进行常规PCR扩增,最后通过检测标记产物方法检测扩增产物[ 6 ] 。
2. 2 原位PCR的方法
(1) 涂片。先在液相状态下对培养细胞内的靶基因进行扩增,再用标记的特异性探针进行原位杂交,该方法敏感性高,但是细胞涂片会造成细胞的变形[ 7 ] 。影响原位PCR 对细胞内靶基因DNA或RNA的准确定位。为了更好地保持细胞形态以便能更准确地对细胞内的DNA或RNA进行定位,对直接生长在载玻片或盖玻片上的细胞进行了原位PCR并获得成功,该方法与细胞涂片相比,细胞形态保持良好,而且定位准确[ 8 ] 。
(2) 组织标本。与免疫组织化学方法一样,原位PCR技术所用的组织是冰冻切片和石蜡包埋切片。原位PCR的检测结果表明,在组织中该方法比单独原位杂交的敏感性高,同时,原位PCR可以对档案保存组织标本中的病毒进行检测和细胞定位,进行回顾性研究,便于对疾病发生和发展规律,病毒在动物体内的靶器官和靶细胞及病毒与疾病关系进行研究[ 8 ] 。(3) 探针的制备。在进行原位PCR之前,首先要确定所用探针的种类,原位PCR使用的探针可以从细胞中提取,也可以通过重组技术和PCR技术合成所需要的探针。探针的标记可以使用放射性同位素标记,生物素作为非放射性同位素标记物,虽然不如放射性同位素敏感,但是操作简便、安全,新出现的地高辛具有与放射性同位素相同的敏感性,而且具有非放射性标记物的安全、快速和易操作的优点。探针的长度为19～200 bp的寡聚核苷酸。
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的
基本原理和操作步骤
普通PCR
1概述
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR 则于1983由Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki 等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。
原位杂交介绍与步骤
原位杂交介绍与步骤
原位杂交
组织（或细胞）化学（In situ Hybridization Histochemistry，ISHH）简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA 杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。
根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记（如35S，3H，32P等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。
一、基本要求
1. 组织取材：组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。
2. 固定目的是：
（1）保持细胞结构；
（2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；
（3）使探针易于进入细胞或组织。
最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
3. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：
原位PCR技术
清洁的玻片置上述液体中20min， 室温，然后60℃ 1h，玻片于室温 中可保存1个月备用。
（二）组织切片4～10µm
处理的玻片上加1～2滴aqueous胶， 组织敷贴其上，45℃加热，再将切片烤 干60℃ 90min，冷却20℃，24h，室温保 存。
（三）石蜡切片脱蜡至水 最后以0.1mol/L Tris-Hcl,pH7.4洗5min。
3SR 酶 液 成 分 和 配 制 :1.4μlK/30u AMVRT 、 5μl/100u T7RNA 聚 合 酶 、 3μl/3u RNA酶H;10μl 3SR反应液,42°c 扩增1h。
⒋ 杂交，显色观察。
第二节 原位PCR实验中应注意的问题
和对照设置
由于原位PCR技术具有高敏感性和高 特异性的显著特点，技术操作系统极易 受到包括试剂和操作中各种因素的干扰 和影响，假阳性和假阴性的机率较高， 实验中应予以重视和避免。
第一节 原位PCR技术操作
一、待测切片的准备和预处理
载盖玻片的清洁和组织切片的预 处理，包括防脱片、蛋白酶消化等， 基本上与原位杂பைடு நூலகம்法类同。
（一）清洁玻片并进行防脱片处理
配 制 0.05%/0.01 mol/L Tris-Hcl ， pH8.0多聚赖氨酸，每10ml 0.05%多聚赖 氨酸中加入1µl TritonX-100,可保存于4℃， 出现浑浊则不能使用。
原位杂交
磷酸酯酶） • 碱性磷酸酯酶作用于显色底物NBT/BCIP，呈现棕色。
地高辛标记RNA探针的制备（体外转录）
1. 转录模板的选取：选取目的基因中150-1200bp 长 短的无ployA尾巴的非保守区段为模板。
2. 转录模板的制备：
XXX 反
XXX 正
三、组织预处理（RNA操作）
• 切片脱蜡进水 • 4%多聚甲醛后固定， 4℃ • 0.2M HCI处理（蛋白质变性） • 蛋白酶K处理（5-10 μlg/ml）：37℃，30分钟（关键
步骤）
• 甘氨酸处理（终止蛋白酶K 反应） • 乙酰化：防止探针非特异性结合（降低背景） • 预杂交（不加探针）：湿盒，载玻片覆膜，42℃ 1-2
1ng/μl 0.1
0.01
对照
合成
50× 100× 200× 400× 800×
20ng/μl
最低产量 250 ng 100μl杂交液×5 slides = 500μl杂交液 500μl杂交液×0.5 ng/μl = 250 ng
最低浓度 5 ng/μl 250 ng ÷50μl = 5 ng 100μl杂交液×0.5 ng/μl = 50 ng 50 ng ÷18.8μl 探针=2.65 ng/μl
5M NaCI Tris·CI（pH7.5） 0.5M EDTA （pH7.5）
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤
普通PCR 、原位PCR 、反向PCR 和反转录PCR 的
基本原理和操作步骤
基础兽医系 陈洪博 S2008467
普通PCR
1概述
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR PCR，，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA 片段。可看作生物体外的特殊DNA 复制。DNA 聚合酶（DNA DNA polymerase polymerase polymerase I I ）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, , 因因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taq Taq polymerase), polymerase), polymerase), 则则是于1976年从温泉中的细菌（Thermus aquaticus ）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR 最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR 前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR 则于1983由 Dr. Kary B. Mullis 发展出的，Dr. Mullis 当年服务于PE 公司，因此PE 公司在PCR 界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki Saiki 等等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR 的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR 技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis 也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。