稳定同位素标记方法在蛋白质组学定量分析中的应用

收稿日期:
2005201227;修回日期:2005207228
作者简介:孟丽丽(1977～),女(汉族),河北人,硕士生(导师:齐孟文),从事核技术应用与酶联免疫试剂盒开发
第18卷第4期
2005年11月
同　位　素
Journal of Isotopes
Vol.18　No.4Nov.2005
稳定同位素标记方法在蛋白质组学定量分析中的应用
孟丽丽,齐孟文
(中国农业大学核技术应用实验室,北京　100094)
摘要:蛋白质表达水平定量分析是蛋白质组学研究的一项关键内容,它依赖于精确的、高通量的、具重复性的技术。

目前,应用稳定同位素标记技术定量蛋白质表达水平是最准确的方法之一,且联合色谱质谱技术更具优势。

本文论述了这一技术的广泛应用和最新的研究进展。

关键词:蛋白质组;稳定同位素标记;质谱;定量分析
中图分类号:TL92;TQ937 文献标识码:A 文章编号:100027512(2005)0420245205
Application of Q uantitative Proteomics Expression
Analysis Using Stable Isotope Labeling
M EN G Li 2li ,Q I Meng 2wen
(L aboratory f or A p plication of N uclear Techniques ,China A g riculture Universit y ,B ei j ing 100094,China )
Abstract :Quantitative protein exp ression p rofiling is a crucial part of proteomics and re 2quires technique t hat are able to efficiently p rovide accurate ,high 2t hroughp ut and rep roduc 2ible differential exp ressio n values for p roteins in two or more biological samples.At present ,stable isotope labeling is p robably considered as one of t he most accurate ways to relatively quantify p rotein expression levels and additionally stable isotope labeling may be directly combined to L C MS/MS app roaches.In summary ,t his technique has it s advantages in quan 2titative proteomics.The application and t he latest p rogresses about t his technique are dis 2cussed.
K ey w ords :proteomics ;stable isotope labeling ;MS ;quantitative analysis
蛋白质组通常定义为一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全套蛋白质[1]。

由于剪切方式的变化和翻译后的修饰,使得蛋白质组研究比基因组更加复杂,增加这种复杂性的另一因素是蛋白质丰度随环境变化而变化,即蛋白质为适应环境自身长期进化或环境应激而发生的改变。

通过了解这些功能活动变化的过程,或许
可以揭示为什么“健康”细胞有别于“疾病”细胞和细胞为什么有不同的行为方式。

蛋白质组学研究的一项关键内容,是在对比环境下对蛋白质的差异表达进行准确的定量分析,通过比较正常与异常细胞或组织中蛋白质表达水平的差异,进而找到此环境下密切相关的差异蛋白所引发的疾病,从而确定多种致病因子在对机体作用时最
重要的靶分子,为临床诊断、病理研究、药物筛选、新药开发、新陈代谢研究等提供理论依据。

过去,主要采用二维差异凝胶电泳(DIGE)技术分析蛋白质的差异表达。

近年来发展起来的一种稳定同位素标记(Stable Isotope Labe2 ling)及质谱分析技术,因其使用稳定同位素标记,使得质谱检测更具特异性,加之质谱分析固有的准确性和采用束流检测后的高度灵敏性,使其在低丰度蛋白质的分析中展现出良好的应用前景。

1　技术介绍
近年来,基于质谱技术,稳定同位素标记技术定量分析蛋白质表达水平获得了很大进展。

它是在两套对比标本中用同一核素的不同稳定性同位素标记蛋白或多肽。

通常是用富含某种重质同位素(比如:2H、l3C、l5N、l8O)的试剂标记与被分析肽段相同的肽段作为其内标物,被分析肽段则与正常的同种试剂(即其中所有元素的含量皆为天然丰度)结合。

内标肽段与被分析肽段(组成为一个“分析对”)除了在质量上相差确定的几个单位外,其他的物理、化学性质几乎完全相同,在标记后的诸多分离纯化过程中,其行为很相似,由于质量数的差异,在质谱图上表现为一对峰,峰的间距由内标物所含的重质同位素的个数决定。

目前,各种不同的稳定同位素应用范围极广,而且在蛋白质组实验的不同阶段,它可以和化学方法或生物方法一起使用[2]。

稳定同位素标记技术主要有提取前标记方法(代谢标记方法)、提取后标记方法及反转标记方法[3]。

1.1　代谢标记法
代谢标记方法是指利用培养细胞的代谢作用,将标记了核素的蛋白质掺入细胞内的方法。

通常将一定量细胞种类相同、蛋白质表达水平不同的两个细胞样品,分别置于正常培养介质和富含某种重同位素的相同培养介质中进行标记。

以15N标记为例,经过一段时间培养,在富含15N 的培养介质中,生长繁殖的细胞内,蛋白质被标记。

培养结束后,将在正常介质中生长繁殖的细胞和被15N标记的细胞混合,破碎细胞,通过选择性亲和分离、色谱分离等过程提取相关蛋白质,进行消化酶解,使其成为肽段,最后进行质谱分析。

来自两个对比细胞样本的每一肽段在质谱图中表现为一对峰,峰的间距等于标记肽段中15N原子的数。

通过比较质谱图中同位素标记内标物的一对峰的强度,便可确定对照细胞体系中蛋白质表达水平的差异。

由于两对象测定是在同一分析过程下完成的,因此具有很高的准确性;同时内标质谱法的信噪比高,测定灵敏度也较高。

Annemieke等[4]用酿酒酵母作为实验对象,在设定的实验条件下,于发酵罐中在两种不同的单一营养限制条件下进行酵母繁殖,用硫酸氨(N H4)2SO4作为唯一的氮源,一种培养液富含15N,另一种是正常的培养液。

繁殖一段时间后,破碎细胞并抽取蛋白质,在标本混合前用不同的荧光分子CyDyes进行荧光标记,二维凝胶电泳分离,酶解,用基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI2TO FMS)进行鉴定。

然后将两种酵母细胞混合并破碎后,采用二维差异凝胶电泳(DIGE)和稳定同位素代谢标记技术(Met2 abolic Stable Isotope Labeling)在少量的但具代表性的蛋白位点进行观察对比。

结果显示,两种方法的相关性很好,相关系数达到0.89。

Oda等[5]将S.啤酒酵母细胞分别置于正常及富含15N的介质中培养一段时间后,将分别培养的细胞混合,采用反相液相色谱柱分离,收集到的组分再进行SDS2PA GE凝胶分离,酶解后,对得到的肽段进行质谱分析。

结果表明S.啤酒酵母中有42种高丰度蛋白在表达G1cyclin CL N2时显示出明显差异。

同时Oda等运用这种方法准确定量了蛋白质在不同生长条件下表达量的变化。

在传统的蛋白质研究中,质谱只能应用于蛋白质的鉴定,而不能用于定量分析,这是因为不同的蛋白质或多肽具有不同的离子化率,而用同位素标记差异质谱巧妙地解决了这个问题。

但该方法也有其不足之处。

如,该方法是在细胞培养阶段进行同位素标记,所以不能直接对从组织中提取的细胞进行分析;富集同位素的介质可能会改变细胞生长中的某些过程,从而人为地改变蛋白质组的表达水平,有时可能不能真实反映细胞内蛋白质的表达情况;同位素试剂需要量较大,成本高;只能对已知序列的肽段进行定量分析,在对实际样品进行定量分析时,往往要求在定量分析前进行肽段结构鉴定,即氨基酸序列分析[6,7];同位素标记增加了被标记蛋白质的相对分子质量,从而加大了数据库搜寻的难度[8]。

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1.2　后加标记
后加标记法是指先将细胞或组织破碎,提取出相关待分析成份后,再用同位素进行标记。

该方法通常用于标记来源不同、细胞状态相同的肽段,待充分反应后,将两者混合,消化酶解成若干个肽段,然后用高效液相色谱(H PL C)分离,之后用质谱进行鉴定,通过识别并比较质谱图中前后相邻分布峰的强度,确定对比样品对某蛋白质表达水平的差异。

其最典型且已商业化的技术是同位素亲和标记技术(Isotope Coded Affinity Tages,ICA T)。

ICA T[9]化学试剂由生物素部分、同位素标记中间体部分以及半胱氨酸活性烷基化反应连接部分三部分组成。

所使用的试剂是含8个氢原子的(d0)轻试剂或含8个氘原子的(d8)重试剂。

一般实验步骤为:将一个蛋白质样本用轻试剂标记,另一个用重试剂标记,然后将两个样本混合,经胰蛋白酶或Lys2C水解蛋白得到肽片断,混合肽片断,用抗生物素蛋白亲和层析法分离,这些肽段即可进一步通过反向毛细管液相色谱分离后或直接进行质谱分析。

质谱分析时得到的质量数相差8Da的同位素分子质量峰,若一对峰的质量数相差8Da,则为同一种蛋白质,由d0和d8峰的相对强度进行相对定量。

由于ICA T所用试剂在化学结构上相同,且其相对分子量只差8个中子,所以在用质谱检测时,相对量的可信性有所提高。

它无需繁冗的双相凝胶电泳技术,对低丰度蛋白的直接捕获测定以及可靠性都较以往的检测技术有所提高,且ICA T具有广泛的兼容性。

文献[10]进一步发展了ICA T技术,在ICA T技术的基础上增加了了一种光敏的固相(Solid2p hase)修饰剂。

在玻璃微珠上涂上氨丙基材料,再依次连接一个光敏分子和一个对巯基有特异性的碘乙酰分子,将这种固相修饰剂和ICA T平行进行酿酒酵母蛋白质组测定的比较研究。

结果表明,无论是大规模还是小量蛋白质组分析,新试剂对蛋白质的检出率是ICA T的3倍以上。

这种方法与ICA T技术比较,最重要的改进是固相试剂可标记蛋白质水解后的肽段,而ICA T标记的是水解前的蛋白质。

但以上两种化学试剂都存在同样的缺陷,试剂中的生物素既作为修饰剂的载体又作为亲和层析的结合剂,而生物素的分子体积较大且与抗生物素蛋白结合牢固,造成了修饰反应速度低、对肽段离子化的抑制以及洗脱效率不足等弱点。

该法前提是蛋白质中含有半胱氨酸,但事实上不是所有的蛋白质都含有半胱氨酸。

比如,酵母菌中有8%的蛋白质没有半胱氨酸,不过完全可以利用这部分蛋白质合成对其它氨基酸基团专一的ICA T试剂进行分析,这一设想也可以用于研究蛋白质翻译后的修饰[11]。

基于ICA T试剂的上述特性,ICA T与不同的质谱技术联合应用得到了广泛的研究。

Grif2 f rin等[12]运用四极杆飞行时间MALDI Qq TO F 质谱和ICA T技术定量分析了以乙醇和半乳糖为碳源时,酵母细胞的蛋白质组变化。

Smit h 等[13]用ICA T技术和傅里叶转换离子回旋共振质谱(Fourier Transform Ion Cyclot ron Reso2 nance Mass Spectrometry,F TICR MS)相结合,得到一种新的定量蛋白质组学的研究技术。

该技术主要利用了FRICR质谱超强的质量分辨能力,对细胞蛋白混合物进行一维分离后就可鉴定。

最近,Claudia等[14]在应用稳定性同位素标记及质谱法技术时,采用乙酰化和胍化/烟碱化两种方法对M HC配体进行了定量分析。

用1H32乙酸酐和2D32乙酸酐标记酶解后的多肽,可使N端氨基发生完全乙酰化反应。

它不同于用典型ICA T标记的片断,大多数M HC配体C 端不携带赖氨酸或精氨酸,因此,可疑的电荷离子使方法灵敏性降低,因为乙酰基阻挡了N端正价电荷的信息(个别电荷离子的信息会发生变换)。

为了避免灵敏性降低,他们对M HC进行了修饰。

该修饰分为两步:第一步,赖氨酸侧链被O2甲基异脲半硫酸盐完全胍基化,它针对所有来源一致的N端未经修饰的ε2氨基酸组;第二步是将所有N端烟碱化并使用具有烟碱的琥珀酰亚胺试剂维持肽链的电荷状态。

该研究组用这两种方法将从癌细胞集落的HL A类分子上提取的多肽链和常规标本标记后,混合标本,最后用纳升电喷雾串联质谱技术(ESI2MS/MS)和高效液相色谱(H PL C)确定了19种天然氨基酸。

乙酰化和胍化/烟碱化方法主要用于对M HC配体的定量观察。

因敏感性及特性不同,这两种方法可根据标本的特性而选择其一,用于定量分析来自两种不同标本源的M HC配体。

而且,乙酰化(D3)和烟碱化(D4)肽链列出的共
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　第4期 孟丽丽等:稳定同位素标记方法在蛋白质组学定量分析中的应用
同洗涤物的程度比典型的ICA T试剂用八聚体的氘原子所包含的肽链多。

第二代13C2ICA T试剂已经发展到可以优化共同洗涤出的多肽[15]。

但因达不到质谱分辨率,现还没有商业化。

利用肽段N端氨基的反应性质,可用同位素进行标记。

同样利用氧原子与C端羧基碳原子的共价结合稳定的性质[16],肽段中C端羧基也可以进行同位素标记。

Yao等[17～19]利用18O 标记2质谱方法对蛋白质组进行了不同角度的研究。

1.3　反转标记方法
文献[18]提出了一种新的标记方法,即反转标记(Inverse Labeling)。

该方法需要进行两组实验,第一组为原标记实验(1.2节),第二组以第一组为基础,将标记试剂反转使用,原来标记正常试剂的样品改用重质同位素试剂,而原来标记重质同位素试剂的样品改用轻质同位素试剂。

然后分别混合,采用质谱进行鉴定。

这种研究思路最大的优点是大大增加了对不同样本中差异蛋白识别的确定性,加快了分析速度,且该方法对体系复杂程度的耐受性也大大增加[3]。

1.4　其它方法
翻译后的修饰作用对细胞机制与功能调节起重要作用,因此,有必要对某一翻译后的修饰作用进行作用位点检测和定量分析。

同位素标记方法目前已应用于磷酸化和糖基化作用的定量分析[20]。

同样可以采用代谢标记[5]、提取后标记[21,22]以及反转标记几种方式进行标记,分析过程与前面讨论过的相应方法类似。

2　结束语
蛋白质组学的研究和基因组一样,依赖于强有力的、高通量、大规模的测定分析技术。

在目前的蛋白质研究中,仍以双相电泳和质谱技术为支柱技术,尽管在分辨率和检出率方面都有很大改进。

但是与基因组学研究相比,由于蛋白质的复杂性和多样性,缺乏一种高通量的识别工具仍然是蛋白质组学深入研究的瓶颈。

走向大规模、分组化和定量化,建立各种技术互补的高通量蛋白质组研究技术平台是今后发展的趋势。

稳定同位素技术既可引入到化学试剂中,又可作为生物标记应用到定量蛋白质组学分析的各个环节,在低丰度蛋白鉴定方面已显示出极大的优势。

目前,蛋白质组研究都仍处于基础研究阶段,对蛋白质组研究还需要一个认识过程以及技术的升级配套过程,蛋白质组研究的产业化还有很长一段路要走。

因此,在蛋白质组学研究的起步阶段,进行方法学研究,对迅速进入到蛋白质组学的前沿,无疑是生命科学研究发展方向决策中的一个重要问题。

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