详细版实验一--质粒DNA的提取.ppt
合集下载
实验一质粒DNA的提取(共27张PPT)
Байду номын сангаас
SDS （ 1%，新鲜配制）
1. 柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500 l 的平衡 The pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E.
8. 小心吸取上清液中至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，加入等体积 的氯仿/异戊醇（24:1），颠倒数次混匀， 12,000rpm，4℃，离心3min， 取上清液。
9. 小心吸取上清液中至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，加入2 倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，于冰上放置10min， 4℃离心， 15,000rpm，10min。
至，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。 LB固体培养基（1L）
在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。
2. 溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L ）；Tris·HCl（ 25mmol/L， ）； EDTA （10mmol/L） 3. 溶液Ⅱ： NaOH （） ；SDS （ 1%，新鲜配制） 4. 溶液Ⅲ： 60ml的 5mol/L KAC ； 的冰醋酸 ； 28.5ml H2O
当菌体在NaOH和SDS溶液(碱性条件pH 12.5)中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同，染色体DNA双螺旋 结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘 绕仍会紧密地结合在一起。当加入乙酸钾溶液pH恢复至中性时, 在高盐浓度 的情况下，染色1k体b到DN20A0之kb间交联形成不溶性>网4状00结0k构b并与蛋白质-SDS复 合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而 留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、 RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质 粒DNA。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。
SDS （ 1%，新鲜配制）
1. 柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500 l 的平衡 The pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E.
8. 小心吸取上清液中至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，加入等体积 的氯仿/异戊醇（24:1），颠倒数次混匀， 12,000rpm，4℃，离心3min， 取上清液。
9. 小心吸取上清液中至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，加入2 倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，于冰上放置10min， 4℃离心， 15,000rpm，10min。
至，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。 LB固体培养基（1L）
在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。
2. 溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L ）；Tris·HCl（ 25mmol/L， ）； EDTA （10mmol/L） 3. 溶液Ⅱ： NaOH （） ；SDS （ 1%，新鲜配制） 4. 溶液Ⅲ： 60ml的 5mol/L KAC ； 的冰醋酸 ； 28.5ml H2O
当菌体在NaOH和SDS溶液(碱性条件pH 12.5)中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同，染色体DNA双螺旋 结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘 绕仍会紧密地结合在一起。当加入乙酸钾溶液pH恢复至中性时, 在高盐浓度 的情况下，染色1k体b到DN20A0之kb间交联形成不溶性>网4状00结0k构b并与蛋白质-SDS复 合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而 留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、 RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质 粒DNA。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。
质粒的提取和纯化ppt
一.质粒的概念和提取原理
质粒在细胞内的复制一般有两种类型: 紧密控制型(Stringent control) 松驰控制型(Relaxed control)
一.质粒的概念和提取原理
在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性 大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环 的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。 将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件 下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和 蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而 质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除 去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋 白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯 仿抽提进一步纯化质粒DNA。
二，碱裂解法的操作步骤
1,取培养至对数生长后期的含质粒的细菌培养液, 高速离心,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。 2, 加入溶液I,充分悬浮菌体细胞。 3,加入新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心 管数次,以充分混匀内容物,冰浴5分钟。 4,加用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内 容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。 5,4℃下离心15分钟。
三，煮沸法快速提取质粒的操作步骤
（6） 用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的 上清液中加入 8 m l 5%CTAB(十六烷基三甲基溴化氨) ， 用混合器混匀后，高速离心 5min ，弃上清液，用滤纸吸 干离心管中的液体。 （7） 加入 1.2M 氯化钠 300 m l ，充分溶解沉淀物，再 加入 750 m l 的冷乙醇，充分混匀后，离心 15min ，弃 上清液。 （8） 取 1ml 70% 冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，离心 5min 。弃上清液，用滤纸吸干管壁上的液体，置室温中 使核酸沉淀自然干燥 5-10min 。 （ 9 ） 沉淀物溶于 50 m l TE 缓冲液中， 混合器混匀 。 （10） 即成质粒制备液，制备的质粒供下一步实验使用.
质粒DNA的提取及浓度测定
60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸，
28.5mL H2O
TE缓冲液或水（+ 20mg/ml RNase ）:
10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，70％乙醇
精选版课件ppt
20
注意：
• 用移液器操作时，每一步都要格 外小心，特别是在加入溶液II 和 III后，一定不要剧烈振荡，以免 切碎DNA(包括质粒DNA和基因组 DNA)！！！
8. 将分离出的质粒D精N选版A课置件pp于t -20℃保存备用。 23
Biodev（博大泰克）质粒快速 提取试剂盒（plasmid rapid isolation kit）
碱裂解法；离心柱结构；特殊硅基质吸附材料。
使用前按说明再溶液I中加入RNase；向洗脱液 中按1:3的比例加入无水乙醇。
精选版课件ppt
6. 沉淀用0.5ml 70％乙醇清洗一次， 12000r/min 离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上 ，除尽乙醇，室温自然干燥;
7. 加入30-50ml含有20mg/ml RNase的灭菌蒸馏水 或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min ，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提);
存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细 胞中，在细菌细胞中最多。
精选版课件ppt
28.5mL H2O
TE缓冲液或水（+ 20mg/ml RNase ）:
10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，70％乙醇
精选版课件ppt
20
注意：
• 用移液器操作时，每一步都要格 外小心，特别是在加入溶液II 和 III后，一定不要剧烈振荡，以免 切碎DNA(包括质粒DNA和基因组 DNA)！！！
8. 将分离出的质粒D精N选版A课置件pp于t -20℃保存备用。 23
Biodev（博大泰克）质粒快速 提取试剂盒（plasmid rapid isolation kit）
碱裂解法；离心柱结构；特殊硅基质吸附材料。
使用前按说明再溶液I中加入RNase；向洗脱液 中按1:3的比例加入无水乙醇。
精选版课件ppt
6. 沉淀用0.5ml 70％乙醇清洗一次， 12000r/min 离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上 ，除尽乙醇，室温自然干燥;
7. 加入30-50ml含有20mg/ml RNase的灭菌蒸馏水 或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min ，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提);
存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细 胞中，在细菌细胞中最多。
精选版课件ppt
质粒的提取和电泳ppt课件
重组质粒的进一步酶切鉴定
如何鉴定平板上的菌落为含有重组质粒的菌落？
平板筛选： 大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未含 有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或重 组质粒的细胞
提取的质粒
质粒电泳筛选重组质粒
重组质粒的进一步酶切鉴定
小量制备质粒和电泳分析
质粒……
质粒
是存在于细菌染色体外的小型闭 合环状双链DNA分子，在宿主细 胞内可独立自主复制并赋予宿主 细胞一定的遗传性状
5mol/L 醋酸钾
11.5ml
冰醋酸
28.5ml
水
4）20mg/ml RNase----降解细菌RNA 工作浓度30～50 g/ml 其他试剂作用和成分同实验一。
质粒DNA的制备
碱裂解法提取质粒操作步骤
（1）（细菌的收获：）
取1.5 ml 工程菌液6,000转/分，离心2min， 弃上清。
（2）（细菌的裂解：）
1) 细胞悬浮液（溶液I）--悬浮菌体 50 mmol/L 葡萄Fra Baidu bibliotek 25 mmol/L Tris.Hcl PH 8.0
10 mmol/L EDTA.Na2 PH 8.0
2) 细菌裂解液（溶液II） --裂解菌体
0.2mol/L
NaOH
1%
SDS
3）中和液（溶液III） ----中和NaOH
60 ml
如何鉴定平板上的菌落为含有重组质粒的菌落？
平板筛选： 大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未含 有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或重 组质粒的细胞
提取的质粒
质粒电泳筛选重组质粒
重组质粒的进一步酶切鉴定
小量制备质粒和电泳分析
质粒……
质粒
是存在于细菌染色体外的小型闭 合环状双链DNA分子，在宿主细 胞内可独立自主复制并赋予宿主 细胞一定的遗传性状
5mol/L 醋酸钾
11.5ml
冰醋酸
28.5ml
水
4）20mg/ml RNase----降解细菌RNA 工作浓度30～50 g/ml 其他试剂作用和成分同实验一。
质粒DNA的制备
碱裂解法提取质粒操作步骤
（1）（细菌的收获：）
取1.5 ml 工程菌液6,000转/分，离心2min， 弃上清。
（2）（细菌的裂解：）
1) 细胞悬浮液（溶液I）--悬浮菌体 50 mmol/L 葡萄Fra Baidu bibliotek 25 mmol/L Tris.Hcl PH 8.0
10 mmol/L EDTA.Na2 PH 8.0
2) 细菌裂解液（溶液II） --裂解菌体
0.2mol/L
NaOH
1%
SDS
3）中和液（溶液III） ----中和NaOH
60 ml
质粒提取实验PPT(完整版)
可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。共价闭环超螺 旋DNA＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之 间
DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电 压、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。
三 实验步骤
接含质粒的单菌落于2Baidu Nhomakorabeal LB Amp+液体培养基中
4℃ ，10000rpm，离心10min，取700μL（注不要吸到沉淀物）上清到一新管
加700μL的 氯仿：异戊醇［V:V＝24:1］（混匀），冰上静置5min
质粒检测：
电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺 旋、开环、线型三种构型。
吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波 长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于之间， 说明质粒质量较好，，低于1.8说明有蛋白质污染，大于 1.8说明有RNA污染。
Ⅱ型酶识别的DNA序列一般含有4～6个核苷酸。有的在识别
质粒提取实验
一 实验目的
掌握碱裂解法分离质粒DNA的基本原理和操作要点。 了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术
二 实验原理
质粒是一种染色体外能够稳定遗传的因子，具有双链共价闭环结构的 DNA分子。是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链 DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之 间
DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电 压、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。
三 实验步骤
接含质粒的单菌落于2Baidu Nhomakorabeal LB Amp+液体培养基中
4℃ ，10000rpm，离心10min，取700μL（注不要吸到沉淀物）上清到一新管
加700μL的 氯仿：异戊醇［V:V＝24:1］（混匀），冰上静置5min
质粒检测：
电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺 旋、开环、线型三种构型。
吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波 长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于之间， 说明质粒质量较好，，低于1.8说明有蛋白质污染，大于 1.8说明有RNA污染。
Ⅱ型酶识别的DNA序列一般含有4～6个核苷酸。有的在识别
质粒提取实验
一 实验目的
掌握碱裂解法分离质粒DNA的基本原理和操作要点。 了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术
二 实验原理
质粒是一种染色体外能够稳定遗传的因子，具有双链共价闭环结构的 DNA分子。是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链 DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。
质粒DNA提取PPT课件
5
质粒类型：
• 严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控 制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以， 往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；
• 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛 控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝， 如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成 才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒 pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理 才能达到更高拷贝数。
淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
24
溶液III
醋酸又是为什么而加的呢？ 是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会
打断DNA，所以要中和之。 基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb
大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。
25
溶液III
溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是 为了PDS沉淀更充分一点。
2. 启始复制子（ori, Origin of
replication)； 3. 多克隆位点(MSC, Multiple cloning
site or polylinker)； 4. 标记基因(Marker gene, such as
LacZ gene)。
8
Insert
EcoRI 1.9kb
XhoI
15
加入150uL溶液III（轻轻混匀），室温静置,冰上放置 5min，质粒DNA复性
质粒类型：
• 严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控 制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以， 往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；
• 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛 控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝， 如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成 才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒 pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理 才能达到更高拷贝数。
淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
24
溶液III
醋酸又是为什么而加的呢？ 是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会
打断DNA，所以要中和之。 基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb
大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。
25
溶液III
溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是 为了PDS沉淀更充分一点。
2. 启始复制子（ori, Origin of
replication)； 3. 多克隆位点(MSC, Multiple cloning
site or polylinker)； 4. 标记基因(Marker gene, such as
LacZ gene)。
8
Insert
EcoRI 1.9kb
XhoI
15
加入150uL溶液III（轻轻混匀），室温静置,冰上放置 5min，质粒DNA复性
质粒DNA提取鉴定PPT课件
本次实验用pEC-CT
pEC-CT在pcDNA3 基础上构建
pEC-ct质粒：8.0kb 有Hind Ⅲ, BamH Ⅰ酶切点，
可切出CD基因（1.2kb）
第13页/共43页
质粒DNA提取和纯化步骤：
培养细菌 收集和裂解细菌 纯化质粒DNA
第14页/共43页
细菌的培养
第15页/共43页
细菌培养
质粒（plasmid）
存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，可 在宿主细胞中自主复制，并在细胞分裂时传给子 代。 与染色体ＤＮＡ相比，质粒结构简单，分子大小 不等。小的不到1.0×106道尔顿，大的则超过 200×106道尔顿。
第1页/共43页
质粒含有某些染色体所没有的基因，编码某些功能蛋白质（表 达某种遗传性状，如抗药性（抗氨卞青霉素、抗四环素等）， 耐受重金属，产生细菌素等等）。即很多质粒往往都赋予其宿 主细胞一定的表型。
1. 从-20℃取出储存菌液，斜面划线接种于培养板。
2. 单克隆培养：挑取单个菌落，接种到培养瓶中， 37 ℃培养24 h。
第16页/共43页
3. 扩大培养：培养液3 ml,接种于60 mL 的LB培养液（含Amp 50μg/ml),振摇200
rpm， 37 ℃(4-6 h), 使A580＝0.4-0.6。
• 另外与pBR322相比，pUC质粒载体具有更小的相对分 子量。而且无控制质粒复制的rop基因，使得其拷贝数大 增。每个细胞可达500-700个拷贝。因此，由pUC质粒 重组体转化的大肠杆菌细胞，可获得高产量的克隆ＤＮ Ａ分子。
两大实验：质粒DNA 提取,质粒转化和筛选-PPT资料
4. 加200 μl 溶液Ⅱ（现配现用），轻柔颠倒混匀 4~6次，室温放置4min。
5. 加入150μl预冷的溶液Ⅲ ，轻柔颠倒混匀4~6次 ，冰上放置10分钟。
6. 12 000 r/m离心10 分钟(如果上清液仍然浑浊， 可将上清液移出，再次离心5分钟）。将上清液 转移至EP管中加等体积Tris饱和酚抽提一次， 12 000r/min离心10分钟，取上清转移至EP管中
2. 在宿主菌内，在诱导剂IPTG（异丙基硫代－ β －D－半乳糖苷）条件下，β-半乳糖苷酶（α肽加ω片段）将底物X-Gal(5-溴－4－氯－3－吲 哚－ β－D－半乳糖苷) 切割成半乳糖和深蓝色 的底物5-溴-4-靛蓝 ，使宿主细菌菌落呈现蓝色 。
当载体中β-半乳糖苷酶（lacZ）的α-肽编码 区内具有多克隆区域时，如果在重组质粒中插入片 段使α-肽失活， 则宿主细胞内则不表达有功能的 β-半乳糖苷酶，则得到白色菌落。
pGEM-T Easy Vector Plot
实验二 氯化钙法进行质粒转化及筛选
一、原理
细菌处于0 ℃，在CaCl2低渗溶液（0.1M）中，菌 体细胞膨胀成球形，DNA则与CaCl2形成抗 Dnase的羟基－磷酸钙复合物粘附于细胞表面， 经42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细 胞复原并分裂增殖，重组子的基因在被转化的细 菌中得到表达，在选择性培养基平板上，可选出 所需的转化子。
5. 加入150μl预冷的溶液Ⅲ ，轻柔颠倒混匀4~6次 ，冰上放置10分钟。
6. 12 000 r/m离心10 分钟(如果上清液仍然浑浊， 可将上清液移出，再次离心5分钟）。将上清液 转移至EP管中加等体积Tris饱和酚抽提一次， 12 000r/min离心10分钟，取上清转移至EP管中
2. 在宿主菌内，在诱导剂IPTG（异丙基硫代－ β －D－半乳糖苷）条件下，β-半乳糖苷酶（α肽加ω片段）将底物X-Gal(5-溴－4－氯－3－吲 哚－ β－D－半乳糖苷) 切割成半乳糖和深蓝色 的底物5-溴-4-靛蓝 ，使宿主细菌菌落呈现蓝色 。
当载体中β-半乳糖苷酶（lacZ）的α-肽编码 区内具有多克隆区域时，如果在重组质粒中插入片 段使α-肽失活， 则宿主细胞内则不表达有功能的 β-半乳糖苷酶，则得到白色菌落。
pGEM-T Easy Vector Plot
实验二 氯化钙法进行质粒转化及筛选
一、原理
细菌处于0 ℃，在CaCl2低渗溶液（0.1M）中，菌 体细胞膨胀成球形，DNA则与CaCl2形成抗 Dnase的羟基－磷酸钙复合物粘附于细胞表面， 经42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细 胞复原并分裂增殖，重组子的基因在被转化的细 菌中得到表达，在选择性培养基平板上，可选出 所需的转化子。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告(2020年整理).pptx
将上清转移到另一离心管中。 9、 向上清加入 2 倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置 5～10min。12000r/min，离心 5min。
倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 10、用 1mL70℅乙醇洗涤质粒 DNA 沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干
燥。 11、加 20μLTE 缓冲液，其中含有 20μg/mL 的胰RNA 酶，使 DNA 完全溶解，-20℃保存。
在紫外灯（254nm）下观察染色后的电泳凝胶。DNA 存在处应显出桔红色荧光条带。
第三部分 PCR 扩增制备目的基因
2
学海无 涯
一、实验原理： 是将待扩增的 DNA 模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐
热的 DNA 聚合酶延伸。经过变性—复性—延伸的 n 次循环后，DNA 可被扩增 2n 倍。
二、仪器与试剂 1、仪器 PCR 仪 2、试剂 模板 DNA、Taq DNA 聚合酶、引物、10×Buffer、DNA Marker
三、实验步骤
（1）加样：在 0.2ml PCR 微量离心管中配制 25μl 反应体系。
ddH2O 10×PCR buffer
15.25μl 2.5μl
dNTP（2.5mM）
异来分离它们。在 pH 值介于 12.0～12.5 这个狭窄的范围内，线性的 DNA 双螺旋结构解开 而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒 DNA 的氢键会被断裂，但两条互补链彼此 相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入 pH4.8 的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时， 共价闭合环状的质粒 DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染 色体 DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状 结构，通过离心，染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA，蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下 来而被除去。
倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 10、用 1mL70℅乙醇洗涤质粒 DNA 沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干
燥。 11、加 20μLTE 缓冲液，其中含有 20μg/mL 的胰RNA 酶，使 DNA 完全溶解，-20℃保存。
在紫外灯（254nm）下观察染色后的电泳凝胶。DNA 存在处应显出桔红色荧光条带。
第三部分 PCR 扩增制备目的基因
2
学海无 涯
一、实验原理： 是将待扩增的 DNA 模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐
热的 DNA 聚合酶延伸。经过变性—复性—延伸的 n 次循环后，DNA 可被扩增 2n 倍。
二、仪器与试剂 1、仪器 PCR 仪 2、试剂 模板 DNA、Taq DNA 聚合酶、引物、10×Buffer、DNA Marker
三、实验步骤
（1）加样：在 0.2ml PCR 微量离心管中配制 25μl 反应体系。
ddH2O 10×PCR buffer
15.25μl 2.5μl
dNTP（2.5mM）
异来分离它们。在 pH 值介于 12.0～12.5 这个狭窄的范围内，线性的 DNA 双螺旋结构解开 而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒 DNA 的氢键会被断裂，但两条互补链彼此 相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入 pH4.8 的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时， 共价闭合环状的质粒 DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染 色体 DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状 结构，通过离心，染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA，蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下 来而被除去。
实验一 质粒DNA的提取
1．质粒DNA提取的方法很多，有碱变性法、羟基磷灰石柱层析法、 溴化乙锭一氯化铯 梯度超离心法等。本次实验是一种小量快速提取法。小量快速提取法也 有多种，但基本原理 和步骤是一致的．包括下述步骤：(1)裂解菌体细胞；(2)质粒和染色体 DNA的分离；(3)除去蛋白质。RNA及其他影响限制性酶活性的细胞成 分；(4)除去提玑过程中使用的去垢剂、盐 等。
隔绝空气，阻止酚氧化。
6．关于无水乙醇沉淀DNA的说明：
用无水乙醇沉淀DNA，是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优
点是具有极性，可以以任意比例和水相混溶，乙醇与核酸不会起化学反
应，对DNA很安全，因此是理想的沉
淀剂。
乙醇之所以能沉淀DNA，是由于DNA溶液是以水合状态稳定存在的
DNA，当加入乙醇．乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚
O.25mol／l在pH 8左右的DNA溶液中，DNA分子带负电荷，加一定浓度的
NaAC或NaCl使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电
荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。当加入的盐溶液浓度太
低时。只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全。
但当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好，在沉淀的DNA中，由于
时，目前习惯上常采用如下几种方法：
保存在家用冰箱结冰盒内 过夜
隔绝空气，阻止酚氧化。
6．关于无水乙醇沉淀DNA的说明：
用无水乙醇沉淀DNA，是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优
点是具有极性，可以以任意比例和水相混溶，乙醇与核酸不会起化学反
应，对DNA很安全，因此是理想的沉
淀剂。
乙醇之所以能沉淀DNA，是由于DNA溶液是以水合状态稳定存在的
DNA，当加入乙醇．乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚
O.25mol／l在pH 8左右的DNA溶液中，DNA分子带负电荷，加一定浓度的
NaAC或NaCl使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电
荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。当加入的盐溶液浓度太
低时。只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全。
但当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好，在沉淀的DNA中，由于
时，目前习惯上常采用如下几种方法：
保存在家用冰箱结冰盒内 过夜
实验一、质粒DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳
复制起点 筛选标记基因 多克隆位点
由pUC18载体改建而成，在pUC18 载体的MCS处的Xba I和Sal I识别位 点之间插入了EcoR V识别位点，用 EcoR V进行酶切反应后，再在两侧 的3＇端添加“T”而成。因大部分耐 热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有 PCR 产物的3＇末端添加一个“A”的 特性，所以使用本制品可以大大提高 PCR产物的连接、克隆效率。
Solution III
5mol／L 乙酸钾 冰乙酸 水 60 mL 11．5mL 28．5mL
TE缓冲液 10mmo1／L Tris· HCl 1mmo1／L EDTA(pH8.0) 胰RNA酶溶液
将RNA酶溶于10mmo1/L Tris· HCl(pH7．5)和 15mmo1/L NaCl中，配成10mg/mL的浓度，于100℃加热 15min，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。
• 溶液III：HAc和 KAc组成的高盐溶液 (复性，分离) ① HAc溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发 生缠绕，并使质粒DNA复性。
② KAc会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀
而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成 大分子而与小分子质粒DNA分离。
实验一 质粒DNA的提取及 琼脂糖凝胶电泳检测
实验学时：6 学时 实验类型：综合性 每组人数： 4 人／组
质粒DNA提取及纯化.罗云鹏ppt
用途 Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白 质的溶剂，还有许多重要用途。Tris被 用于不同pH条件下的蛋白质晶体生长。 Tris缓冲液的低离子强度特点可用于线 虫（C. elegans）核纤层蛋白（lamin） 的中间纤维的形成。Tris也是蛋白质电 泳缓冲液的主要成分之一，其在电泳缓 冲液中与甘氨酸构成缓冲体系，稳定电 泳过程中的PH。此外，Tris还是制备表 面活性剂、硫化促进剂和一些药物的中 间物。Tris也被用作滴定标准物。 作为 蛋白缓冲液时，若后续工作需要质谱， 则不适宜用Tris，最好换成其他质谱仪 可耐受的缓冲液。
分子式：C4H11NO3 分子量：121.14 溶液一 CAS号：77-86-1 50mmol/L葡萄糖 ， 25mmol/L Tris-Cl 密度：1.353 10mmol/LEDTA 熔点：167-172℃ 沸点：219-220℃ (10 mmHg) Tris-Cl 闪点：100℃ Tris-HCl缓冲液 水溶性：550 g/L (25℃) （0.05mol/L，25℃）， 外观：白色结晶 水溶性：无色， 中文别名：三（羟甲基） 澄清 氨基甲烷；氨丁三醇； 毒性：毒性低，可致癌，不要 缓血酸铵；三羟甲基氨 直接接触皮肤。 基甲烷；Tris，英文名称： Tris(hydroxymethyl)ami nomethane
EDTA溶液
溶液一的作用 溶液Ⅰ 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl,pH=8.0 葡萄糖增稠,使悬浮后的大肠杆菌不会快速 沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的 活性.这一步溶液中还可以加入RNase,不受 EDTA影响,并且可以在后续步骤中被除去
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
精心整理
21
9. 小心吸取上清液中至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，加 入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，于冰上放置10min， 4℃ 离心，15,000rpm，10min。
精心整理
18
5. 氨苄青霉素（Amp）
用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20℃冰箱保存备用。
6. RNaseA 将RNA 酶 A溶于10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中， 配成10 mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟， 缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。
溶液III：由KAc与HAc组成，是pH值为5.5的高盐溶液。能中和溶液II的碱性，
使DNA复性。但是质粒DNA与染色体DNA复性的速度不同。K+离子会与SDS形
成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋
白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离。
溶液I：低浓度的葡萄糖溶液使细胞处于低渗状态而细胞澎胀；葡萄糖的作用是 增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。 EDTA的作用是螯和掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子，防止DNA酶对质粒 分子的降解作用。 Tris•Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。
溶液II：SDS的作用：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。 NaOH(pH>12)的作用：破坏氢键，使DNA分子变性。
17
2. 溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L ）；Tris·HCl（ 25mmol/L， pH8.0）； EDTA （10mmol/L） 3. 溶液Ⅱ： NaOH （0.2mol/L） ；SDS （ 1%，新鲜配制） 4. 溶液Ⅲ： 60ml的 5mol/L KAC ； 11.5ml的冰醋酸 ； 28.5ml H2O
这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与 线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离 它们。
精心整理
4
结构的三大要素： • 多克隆位点 • 选择标记（耐药性，LacZ） • 独立的复制单位 种类： • 质粒 • 噬菌体 • 酵母人工染色体（YAC） • 反转录病毒载体 • 表达载体等
精心整理
5
精心整理
精心整理
10
实验仪器、材料与试剂
（一） 仪器
1. 恒温摇床
2. 超净工作台
3. 高压灭菌锅
4. 高速台式离心机
5. 微量取液器
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
精心整理
11
精心整理
12
精心整理
13
精心整理
14
精心整理
15
（二） 材料
大肠杆菌E. coli DH 5α含重组质粒 pET-32a-SmPR10
精心整理
16
（三） 试剂
1. LB液体培养基（1L） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml，搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调
节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。 LB固体培养基（1L）
在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。
精心整理
实验一 质粒DNA的提取
精心整理
1
1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果及讨论
精心整理
2
实验目的
了解碱法提取质粒的原理； 掌握碱法提取质粒的方法； 掌握DNA琼脂糖电泳的原理和方法。
精心整理
3
实验原理
质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复 制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小 型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室 常用的方法。
精心整理
8
Gene fragment (SmPR10)
Vector (pET-32a)
精心整理
pET-32a-SmPR10
9
质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的 差异来达到的目的。
当菌体在NaOH和SDS溶液(碱性条件pH 12.5)中裂解时，蛋白 质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同， 染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断 裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入 乙酸钾溶液p1Hk恢b到复2至00中kb性时, 在高盐浓>度4的00情0k况b 下，染色体DNA 之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀； 不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清 中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA 及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化 质粒DNA。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。
7. 酚/氯仿(1:1)，氯仿/异戊醇(24:1)，乙醇 ，75%乙醇。
精心整理
19
实验步骤
质粒的提取
1. 用灭菌的牙签挑取单菌落放入1-2ml LB液体培养基（含Amp 0.1 mg/ml ）中，37℃振荡培养过夜。
2. 将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中，10,000 rpm离心1min，弃上 清液。
3. 加入100 l SolutionI，涡旋使细胞充分悬浮。 4. 加入200 l SolutionII，立即上下颠倒离心管5-10次，使之混匀
（注意动作轻），冰上放置5min。 5. 加入150 l SolutionIII，立即上下颠倒离心管5-10次，使之混
匀（注意动作轻） ，冰上放置5min。
精心整理
20
6. 15,000rpm，离心10min，将上清移至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，注意所取体积（约400 l ） 。
7. 加入等体积酚/氯仿（1:1），颠倒数次混匀（注意动作轻）， 12,000rpm，4℃，离心3min，取上清液。
8. 小心吸取上清液中至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，加入等 体积的氯仿/异戊醇（24:1），颠倒数次混匀， 12,000rpm，4℃， 离心3min，取上清液。
6
pET-32a Vector
The pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E. coli.
精心整理
7
pET-32 cloning/expression region