详细版实验一--质粒DNA的提取.ppt

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9. 小心吸取上清液中至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，加 入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，于冰上放置10min， 4℃ 离心，15,000rpm，10min。
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5. 氨苄青霉素（Amp）
用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20℃冰箱保存备用。
6. RNaseA 将RNA 酶 A溶于10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中， 配成10 mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟， 缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。
溶液III：由KAc与HAc组成，是pH值为5.5的高盐溶液。能中和溶液II的碱性，
使DNA复性。但是质粒DNA与染色体DNA复性的速度不同。K+离子会与SDS形
成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋
白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离。
溶液I：低浓度的葡萄糖溶液使细胞处于低渗状态而细胞澎胀；葡萄糖的作用是 增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。 EDTA的作用是螯和掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子，防止DNA酶对质粒 分子的降解作用。 Tris•Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。
溶液II：SDS的作用：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。 NaOH(pH>12)的作用：破坏氢键，使DNA分子变性。
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2. 溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L ）；Tris·HCl（ 25mmol/L， pH8.0）； EDTA （10mmol/L） 3. 溶液Ⅱ： NaOH （0.2mol/L） ；SDS （ 1%，新鲜配制） 4. 溶液Ⅲ： 60ml的 5mol/L KAC ； 11.5ml的冰醋酸 ； 28.5ml H2O
这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与 线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离 它们。
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结构的三大要素： • 多克隆位点 • 选择标记（耐药性，LacZ） • 独立的复制单位 种类： • 质粒 • 噬菌体 • 酵母人工染色体（YAC） • 反转录病毒载体 • 表达载体等
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实验仪器、材料与试剂
（一） 仪器
1. 恒温摇床
2. 超净工作台
3. 高压灭菌锅
4. 高速台式离心机
5. 微量取液器
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（二） 材料
大肠杆菌E. coli DH 5α含重组质粒 pET-32a-SmPR10
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（三） 试剂
1. LB液体培养基（1L） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml，搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调
节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。 LB固体培养基（1L）
在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。
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实验一 质粒DNA的提取
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1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果及讨论
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实验目的
了解碱法提取质粒的原理； 掌握碱法提取质粒的方法； 掌握DNA琼脂糖电泳的原理和方法。
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实验原理
质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复 制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小 型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室 常用的方法。
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Gene fragment (SmPR10)
Vector (pET-32a)
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pET-32a-SmPR10
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质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的 差异来达到的目的。
当菌体在NaOH和SDS溶液(碱性条件pH 12.5)中裂解时，蛋白 质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同， 染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断 裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入 乙酸钾溶液p1Hk恢b到复2至00中kb性时, 在高盐浓>度4的00情0k况b 下，染色体DNA 之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀； 不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清 中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA 及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化 质粒DNA。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。
7. 酚/氯仿(1:1)，氯仿/异戊醇(24:1)，乙醇 ，75%乙醇。
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实验步骤
质粒的提取
1. 用灭菌的牙签挑取单菌落放入1-2ml LB液体培养基（含Amp 0.1 mg/ml ）中，37℃振荡培养过夜。
2. 将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中，10,000 rpm离心1min，弃上 清液。
3. 加入100 l SolutionI，涡旋使细胞充分悬浮。 4. 加入200 l SolutionII，立即上下颠倒离心管5-10次，使之混匀
（注意动作轻），冰上放置5min。 5. 加入150 l SolutionIII，立即上下颠倒离心管5-10次，使之混
匀（注意动作轻） ，冰上放置5min。
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6. 15,000rpm，离心10min，将上清移至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，注意所取体积（约400 l ） 。
7. 加入等体积酚/氯仿（1:1），颠倒数次混匀（注意动作轻）， 12,000rpm，4℃，离心3min，取上清液。
8. 小心吸取上清液中至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，加入等 体积的氯仿/异戊醇（24:1），颠倒数次混匀， 12,000rpm，4℃， 离心3min，取上清液。
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pET-32a Vector
The pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E. coli.
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pET-32 cloning/expression region