细胞体外加力的实验方法共18页

细胞膜张力拉管实验-概述说明以及解释

1.引言

1.1 概述

细胞是构成生物体的基本单元，其中细胞膜是细胞的重要组成部分之一。细胞膜具有许多重要的功能，其中之一是维持细胞内外的稳定环境。细胞膜的特殊性质——细胞膜张力对于细胞的正常功能发挥起着重要的作用。

细胞膜张力是指细胞膜表面内外两侧分子之间的相互作用力。这种力量是由细胞膜内的脂质分子和蛋白质分子之间的相互作用所产生的。细胞膜张力不仅对维持细胞的形态结构和稳定性起着重要作用，同时也能够调节细胞的信号传递和物质运输等生物学过程。

拉管实验是一种常用的研究细胞膜张力的方法。它通过在细胞膜上制造局部张力区域，然后观察和测量张力的改变来研究细胞膜张力的性质和功能。这一实验方法利用了拉力测量技术、荧光探针标记技术等不同手段对细胞膜张力进行定量和定性分析。

拉管实验的应用和意义非常广泛。首先，通过拉管实验可以深入了解细胞膜张力的调控机制和生物学功能，有助于揭示细胞内外环境和细胞活动之间的关联性。其次，拉管实验的技术手段和方法也可以被广泛应用于

药物筛选、细胞疾病诊断和治疗等领域，为医学研究和临床应用提供了重要的依据和工具。

细胞膜张力拉管实验是一个非常有前景和潜力的研究领域。本文将详细介绍细胞膜张力的概念和作用、拉管实验的原理和方法以及拉管实验在细胞生物学研究中的应用和意义。通过对实验结果的分析和结论的讨论，我们希望能够为进一步研究细胞膜张力的调控机制和生物学功能提供一些有益的启示和指导，并展望未来在该研究领域的发展方向。

1.2文章结构

文章结构部分的内容可以包括以下信息：

不同应力条件对体外培养成肌细胞命运的影响

细胞的增殖，同时抑制分化培养基诱导的细胞分化相关基因ｍｏｅｉ的表达。当牵张应力大于１％，ｙｇｎｎ等后可以观察到明显的０
ＤＡ断裂。Ｎ除此以外，我们还发现牵张应力大于１％，后细胞内开始出现大量的ＰＲ剪切产物，力的增加而增多。当周期性０ＡＰ随应牵张应力超过１％１ｃｃｅ／ｉ时，ｙｌＳｍｎ整体存活细胞数明显降低。５Ｏ结论：高强度牵拉介导的细胞凋亡，参与整体细胞数的减少，可
Ｆｅｅｃｌ细胞加力仪器与弹性加力板对体外培养ＣＣ２１ｘｒｅｌ２１成肌细胞施加不同频率、幅度的牵张应力，变量代表应力幅度。通形
过ＭＴ实和ＰＲ剪切实验测定在受到不同大小的牵张应力作用下（，，Ｏ，５，Ｏ／０ｃｃｅ／ｉ）ＣＣ２Ｔ验ＡＰＯ５１％１％２％１ｙ１Ｓｍｎ的２ｉ细胞的增％％殖和凋亡情况，通过检测细胞分化相关基因的表达改变，分析应力条件下细胞分化状态的改变。结果：％５的周期性应力可以促进
能不利于组织Fra Baidu bibliotek的重塑和再生。
［关键词］周期性牵张应力；凋亡；增殖；分化
［中图分类号］８１［Ｑ１．文献标识码］［３Ａ文章编号］８６５（０１０— ７Ｏ１０ — ４５２１）７１８一３００Ｃｏｒｅａｔｗｅｅｎｃｙｉｔｅｃｈｍａｇｎｔｄｄｏｂｌｔｌｆｅｉｏｒｌｉｂｅｔｏｎｃｌｓｒｔｃｉｅｓａｎｍｙｕａｓｓｃｅｌａｔｉｖｔｎｒ

过度周期性机械应力刺激可引起软骨细胞炎症反应及凋亡

4608｜中国组织工程研究｜第25卷｜第29期｜2021年10月

过度周期性机械应力刺激可引起软骨细胞炎症反应及凋亡

伍伟挺1，黎润光2，曹生鲁2，梁双武

2

文题释义：

软骨细胞：作为关节软骨内单一细胞类型，软骨可通过分泌Ⅱ型胶原及蛋白聚糖而直接参与软骨细胞外基质的合成及代谢，其正常生物学功能对关节软骨生理结构的维持有重要意义。

周期性机械应力：将生长完好的软骨细胞接种于Ⅱ型胶原包被的6孔双向应力细胞培养板1 d ，应用Flexcell-5000T Tension System 系统拉伸装置对软骨细胞施加周期性机械应力，周期为6 s(含3 s 受力、3 s 放松)，进行拉伸24 h ，频率0.5 Hz ，细胞所受应力值大小由弹性膜拉伸应变率表示，同时设计不受力对照组，标记并收集各组细胞待用。

摘要

背景：软骨细胞为软骨的惟一细胞成分，软骨细胞表型丢失是骨关节炎的特征性改变，而周期性机械应力刺激对软骨细胞的生物特性有重要影响，明确周期性机械应力对软骨细胞的作用机制可为骨关节炎的治疗提供借鉴。目的：观察周期性机械应力对体外软骨细胞炎症反应和凋亡的影响。

方法：将原代大鼠软骨细胞接种于Ⅰ型胶原包被的Bioflex 板中培养1 d 后，采用细胞体外加力实验系统(Flexcell-5000T Tension System)处理细胞，在拉伸频率为0.5 Hz 条件下将软骨细胞拉伸24 h ，依据拉伸应变率大小分为对照组(0%拉伸)、2%拉伸组、6%拉伸组、8%拉伸组、10%拉伸组、14%拉伸组。拉伸结束后采用ELISA 法检测软骨细胞炎症反应(白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α)，TUNEL 染色及Annexin V-FITC/PI 法检测凋亡情况，利用RT-PCR 检测内质网应激信号分子(半胱氨酸蛋白酶12、蛋白激酶R 样内质网激酶、葡萄糖调节蛋白78)。

实验方法总结材料2：细胞实验部分

实验方法总结（2）：细胞生物学部分

1. 原代细胞分离与培养 (2)

1.1原代细胞分离 (2)

1.2原代细胞培养 (2)

2. 干细胞分离培养 (3)

2.1胚胎干细胞诱导分化 (3)

2.2肿瘤干细胞（CSC）分离鉴定 (3)

3. 细胞增殖相关研究方法 (5)

3.1 MTT分析法 (5)

3.2 XTT (6)

3.3 WST-1 (6)

3.4 CCK-8(WST-8) (7)

3.4 平板克隆形成 (7)

3.5 软琼脂克隆形成 (8)

3.6 BrdU (8)

4. 细胞转移相关研究方法 (9)

4.1 划痕 (9)

4.2 细胞粘附 (9)

4.3 Transwell迁移 (10)

4.4 Transwell侵袭 (10)

5. 血管生成 (11)

6. 细胞周期：PI染色 (11)

7. 细胞凋亡检测 (12)

7.1 AnnexinV/PI双染色法 (12)

7.2 TUNEL法 (12)

7.3 线粒体膜电位(MMP)检测 (13)

8. 细胞分选 (14)

8.1 流式分选 (14)

8.2 磁珠珠分选 (15)

9. 细胞转染 (15)

10. 细胞慢病毒感染 (15)

11. 基因稳定细胞株的筛选 (16)

12. 耐药细胞株的筛选 (17)

13. 细胞共培养 (17)

13.1直接共培养 (17)

13.2间接共培养 (17)

1.原代细胞分离与培养

1.1原代细胞分离

人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来。

第一，悬浮细胞的分离方法

组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10 min。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。

[工作]体外测定细胞免疫功能的方法是是什么

体外测定细胞免疫功能的方法是是什么0

基本信息：女40岁病情描述：普通外科疾病怎么治疗怎么用药普通外科疾病哪家医院好0

专家意见：0

免疫细胞功能试验包括体内和体外试验。免疫细胞功能体外试验主要根据免疫细胞的增殖活性、分泌活杀伤活性等特性而进行实验设计。具体免疫细胞功能检测内容包括：①淋巴细胞功能检测，包括T细胞增殖试验、T细胞分泌功能测定、T细胞介导的细胞毒试验以及体内试验；B细胞增殖试验、溶血空斑试验、酶联免疫斑点法以及体内试验；NK细胞活性检测方法：酶释放法、放射性核素释放法、化学发光法、流式细胞术法等。②吞噬细胞功能检测，方法有趋化功能检测、吞噬和杀菌功能测定等。0

体外受精需要什么条件0

病情描述：患者性别：胡伟患者年龄：30发病时间：2009年主要表现：阳萎不射精医生诊断及化验结果：正常0

专家意见：0

一、试管婴儿手术流程【做试管婴儿需做的准备】做试管婴儿，必须有结婚证、夫妇身份证及准生证。男方需化验精液，女方亦需完成一些基本的检查，如妇科检查、诊刮、输卵管通透试验、抗精子抗体、肝功能和乙肝两对半、血常规分析和出凝血时间及基础内分泌激素测定(月经第3天)等。若无异常，大夫会为您建立一份病历，告诉您何时进入周期，开始试管婴儿治疗。一般黄体中期即月经第21天开始用药，使体内促性腺激素处于低水平，用药8天左右月经来潮，月经第3-7天，开始肌肉注射促卵泡发育的药物，3天后B超监测卵泡发育情况，调节用药剂量，促卵泡发育药物应用10天左右，卵泡发育成熟，这时经B超引导下经阴道穹窿穿刺可取出卵子，在体外人工受精，培养3天后受精卵发育成胚胎放入宫腔，移植后卧床休息2-4小时。整个过程痛苦很小，一般不需住院。国内试管婴儿一个周期大约需花费3至7万元不等【可百度搜索“试管婴儿的费用”即可知道国内各地医院的大概收费状况】，其中，前期检查，男的和女的共计5000元左右，促排卵打针吃药1万～1.5万(国产药1万元以内)，个人身体情况不同，用药不同，费用也就不同，取卵子加培养1万，移植5000，总计3万……【试管婴儿进行的步骤】1、控制性超排卵2、监测卵泡3、取卵4、取精5、体外受精6、胚胎体外培养7、胚胎移植8、胚胎移植后补充黄体酮9、胚胎移植后第14天验晨尿确定是否妊娠10、妊娠后14天，B超检查胎儿数及胚胎着床部位【患者就诊

体外细胞培养

第一讲体外细胞培养的基本技术

●体外细胞培养条件和基本技术

●体外细胞培养

●体外培养物的生长生物学

●细胞系和细胞株

●培养物的冷冻与复苏

●培养物的污染、检测和排除

●一、体外细胞培养条件和基本技术

体外细胞培养的优缺点

优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。

体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。

一、体外细胞培养条件

（一）、体外培养实验室

1. 准备室

2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。

3. 缓冲室

4. 其他实验室

（二）、体外培养的设备和器具

设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值

3. 倒置显微镜

4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器，

超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置

8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平

培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器，

针头式加压塑料小滤器

2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿

（4）多孔培养板（5）离心管

3. 移液器

4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网

（三）培养用液

•水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS)

Matrigel体外侵袭实验,划痕实验,MTT试验的详细步骤及试剂

五、Matrigel体外侵袭实验所需：

1、Transwell 小室

2、上层培养液：含10g/L BSA的无血清培养液

3、细胞：实验细胞

4、基质胶：Matrigel基质胶为了方便运输和保存，一般是在-20℃（至少保存3个月），呈固体状态。使用前要将Matrigel提前放入4℃冰箱冰上过夜（12h），Matrigel即融化为液体状态备用，避免反复冻融。在冰冻和解冻过程中可能会发生颜色变化属正常现象，一旦解冻，晃动瓶子使其分散均匀。Matrigel冰上维持液态，22～35℃可迅速凝结成胶，使用前接触Matrigel的试管、移液吸头等均须4℃预冷。

5、下层培养液：含FBS或趋化因子的培养液

6、细胞培养板：12孔板，24孔板等

十二、Matrigel 体外侵袭实验

1.实验前的准备

(1)使用前要将Matrigel提前放入4℃冰箱过夜，溶胶。

(2)接触Matrigel的试管、移液吸头等均须4℃预冷。

2．包被基底膜（冰上进行）

(1)冻融后，用预冷的移液枪头混匀Matrigel基质成匀浆状。

(2)根据使用需要，用无血清的冷细胞培养基稀释Matrigel胶（稀释比例根据不同细胞系，比例约为1：6～1：3）。

(3)将稀释胶包被于所需的Transwell上室中，包被量至少覆盖整个生长表面，例120μl稀释胶加到12孔transwell上室中。

(4)37℃孵育1小时。

(5)去除未结合的Matrigel，用无血清培养基轻轻冲洗。

3.水化基底膜

吸出培养板中残余液体，每孔加入50μl含10g/L BSA的无血清培养液，37℃，30min。

体外细胞实验方法

细胞株在适当的培养基中保持10% FBS。

从Addgene(质粒)购买HA-FLAG-UCHL3。

#22564，然后再克隆到pGEX-4T-2载体(Clontech)中。UCHL3C94A和S75A突变体由位点定向突变层积产生)。抗uchl3抗体购自ProteinTech公司

(12384 - 1 - ap)。抗ub (P4D1)、抗rpa32 (9H8)、抗brca1 (D9)抗体购自Santa Cruz Biotechnology。抗rad51 (N1C2)是从GeneTex购买的。反

γH2AX(05 - 636),anti-BRCA2(OP95)和anti-MDC1(05 - 1572)

从微孔被购买。Anti-BRCA2(推上a303国道- 435 a)和

anti-γH2AX架a300型(- 081 a)从Bethyl购买实验室。抗53bp1 (NB100-304)购自Novus Biologicals。Anti-Flag(m2)、anti-HA anti-β-actin抗体

购买的σ。反磷（血清/thr）atm/atr衬底抗体（2851）是从细胞信号技术中购买的。

CRISPR / Cas9敲除

(sgRNAs)使用:sgUCHL3-1(5′-GCCGCTGGAGGCCAAT

CCCGAGG-3′)和sgUCHL3-2(5′-GCCCCGAAGCGCGCCC

ACCTCGG-3′)。gRNA序列被克隆到载体中。

LentiCRISPR-V2-puro。细胞被慢病毒感染

sgRNA-puro随后与2μg /毫升嘌呤霉素广泛的选择,和单一的克隆是通过连续稀释和放大。通过免疫印迹鉴定克隆

实验八、卵母细胞的体外培养

一、实验目的

了解卵母细胞体外培养操作要领，掌握卵母细胞体外培养的方法。

二、实验材料

1、卵巢、冷冻精液、M199培养液、血清、促性腺激素、雌激素、石蜡油、A23187、1%BSA、Tyrode’s改良液。

2、器械：培养皿、15ml试管、胶塞、注射针头、培养箱、吸管、离心管。

三、实验内容

（一）卵母细胞的获得

从屠宰场废弃卵巢中抽取卵母细胞已为大多研究者所接受。

真空泵法是一种有效的猪卵母细胞采集方法。

手动抽吸法在卵母细胞的成熟率方面优于真空泵法。

应用乙醚、乌拉糖、846麻醉药（耳静脉注射只）等麻醉后，再按外科手术要求打开腹腔。

将母兔背朝下方固定于兔手术台上。

在兔腹部最后两对乳头的腹中线部剪毛，用沾满肥皂液的纱布清洗局部，再用剃须刀片刮毛，先后用碘酒和酒精棉球由内向外进行消毒。然后盖上创巾并固定。

用手术刀在腹部正中线处皮肤切开2～3cm长的术口，再在腹壁肌白线上切一小口，用中指垫着以手术剪来扩大剪口。

打开腹腔后，沿着子宫轻轻引出输卵管及卵巢。与卵巢下脂肪组织处，用长夹夹住以固定卵巢。仔细观察卵巢的变化。记录排卵点（卵

巢排过卵后的小红点）。

先在卵巢上找到卵泡，用手指固定卵巢，用10ml注射器配上9号针头，吸一些冲卵液（也可用生理盐水代替）,把针头插入卵泡中吸去取卵母细胞。

从卵巢中获得的卵母细胞为什么通常是未成熟：因为卵细胞形成过程中的减数第二次分裂是在精卵结合过程中完成的，所以只有完成受精后卵细胞才是成熟的，当然也已经完成受精了。人工获取的卵细胞一般都是只完成了减数第一次分裂。

流动力对细胞原癌基因c-fos和c-myc表达的影响

丁库克;许莉莉;王春燕;黄菊英;胡金麟;宋晓燕;曾衍钧

【期刊名称】《北京生物医学工程》

【年(卷),期】2006(025)002

【摘要】目的研究流体力对脑微血管内皮细胞原癌基因c-fos和c-nyc表达的影响,为探索微血管疾病机理提供一定实验依据.方法获取Wistar大鼠脑微血管进行细胞培养,在平行板流动小室中对所培养的细胞施加力学作用,并应用免役组织化学技术观察微血管内皮细胞原癌基因c-fos和c-myc的表达.结果不同的流动力对体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞c-fos和c-myc蛋白表达产生了不同的影响.c-fos 蛋白表达在静态时非常低,但在4dynes/cm2和10dynes/cm2的流体力的作用下可诱导c-fos蛋白水平迅速增加,尤其是10dynes/cm2的流体力,并随着时间的延长而增加,到1h时达到高峰,随后c-fos蛋白表达量出现下降,2.5h时接近基础水平.c-myc蛋白在静态时表达也非常低,经流体力作用后缓慢增多.结论流体力的大小会影响c-fos和c-myc的表达,血液的力学信号传入细胞内并引起细胞的一些应答,也印证了c-fos和c-myc是被血液流体力作用短暂上调的基因,流体力与内皮细胞生长、增殖、损伤也有直接关系.

【总页数】4页(P189-192)

【作者】丁库克;许莉莉;王春燕;黄菊英;胡金麟;宋晓燕;曾衍钧

【作者单位】首都医科大学生物医学工程学院,北京,100069;首都医科大学生物医学工程学院,北京,100069;首都医科大学生物医学工程学院,北京,100069;首都医科大学生物医学工程学院,北京,100069;中国人民解放军总医院微循环研究室,北

细胞应力实验报告

细胞应力是指细胞在外界物理或化学刺激下所产生的反应。细胞应力实验是通

过施加外力或刺激来观察细胞的反应，以便更好地了解细胞的功能和适应能力。本实验旨在探究细胞应力对细胞形态、功能和生理过程的影响，并进一步探讨

细胞应力与细胞内信号传导的关系。

实验一：细胞外力应力对细胞形态的影响

在本实验中，我们选择了人类皮肤细胞作为研究对象。首先，我们将细胞培养

在含有不同浓度的细胞外力应力剂的培养基中，分别为低浓度组、中浓度组和

高浓度组。经过一段时间的培养，我们观察到细胞形态的变化。

结果显示，在低浓度组中，细胞形态基本保持正常，细胞呈现出典型的扁平形状。而在中浓度组，细胞形态开始发生变化，呈现出一定程度的伸展和变形。

在高浓度组，细胞形态更加明显地发生变化，出现了更加明显的伸展和变形现象。

通过这一实验，我们可以初步得出结论：细胞外力应力对细胞形态有一定的影响，较大的外力应力会导致细胞形态的明显改变。

实验二：细胞应力对细胞功能的影响

在实验二中，我们进一步探究了细胞应力对细胞功能的影响。我们选择了肌肉

细胞作为研究对象，通过施加拉力来模拟细胞应力，并观察细胞的功能变化。

实验结果显示，在施加拉力后，肌肉细胞的收缩能力明显增强。这表明，细胞

应力可以促进肌肉细胞的功能发挥，提高其收缩能力。此外，我们还发现，细

胞应力还可以促进细胞的代谢活动，增加ATP的合成速率，从而提高细胞的能

量供应。

通过这一实验，我们可以得出结论：细胞应力可以显著影响细胞的功能，包括

肌肉细胞的收缩能力和代谢活动。

实验三：细胞应力与细胞内信号传导的关系