固相萃取_反相高效液相色谱法测定西藏红豆杉叶中紫杉醇的含量

固相萃取)反相高效液相色谱法测定西藏红豆杉叶中紫杉醇的含量

吴 江1,卢永昌2,朱小军2

(1.青海民族学院科技处,青海西宁 810007;2.青海民族学院化学系,青海西宁 810007)

摘 要:目的 建立固相萃取)反相高效液相色谱法测定西藏红豆杉叶中紫杉醇含量的方法.方法:以中性氧化铝富集待测组份,用Kromasil-C 18(250mm @416mm,5L m)色谱柱,检测波长227nm 、柱温35e 、流速018mL #mi n -1时,以MeO H 和'2O(含0104%H 3PO 4)65B 35洗脱.结果:紫杉醇富集在氯仿:甲醇(100B 5)(V B V)洗脱液中,线性范围为0125~1.5L g(r =019996),加标回收率为9813%(RSD=1146%).结论:测定方法快速,结果准确、可靠.

关键词:西藏红豆杉;紫杉醇;固相萃取;R P )HP LC

中图分类号:O629 文献标识码:A 文章编号:1001-7542(2006)03-0071-03

红豆杉(Ta xus)中的紫杉醇(Taxol)是一种有效的抗癌新药,对晚期卵巢癌,转移性乳腺癌和非细胞性肺癌等多种癌症有显著疗效.目前国内外紫杉醇的供药主要依靠从红豆杉属植物中提取得到.关于紫杉醇的HPLC 分析,国内外已有不少报道[1~5]

,但由于红豆杉属植物种类繁多,且红豆杉中紫杉醇含量均极低,还含有大量化学结构和极性等与紫杉醇结构相似的其它紫杉烷类化合物,因此给分离检测工作带来很大困难,同时,红豆杉树叶提取物中往往含有大量的蜡、脂类物质等,这些杂质的存在,严重影响了色谱柱的寿命.我们在对西藏产红豆杉树叶的研究中,建立了固相萃取)反相高效液相色谱法测定其中紫杉醇含量的方法,该法简便快速,准确度高,收到满意的效果11 仪器、试剂及样品采集

Agilent1100高效液相色谱仪(配置:手动进样器、在线脱气机、高压二元梯度泵、恒温柱温箱、DAD 检测器、Agilent1100色谱工作站);Kromasil-C 18(250mm @416mm,5L m)色谱柱;KQ3200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);SZ-97自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂).

甲醇:高效液相色谱专用试剂(山东禹王实业有限公司禹城化工厂);水:自制三重蒸馏水;磷酸:AR 级(北京红星化工厂).紫杉醇对照品购于瑞士百灵威公司(批号A017040001),纯度大于99%.

样品采集:西藏红豆杉树叶于2003年8月采于西藏樟木.所有样品均由中科院西北高原生物研究所胡凤祖副研究员鉴定,阴干后粉碎过80目筛,冷藏保存.

2 溶液配制

211 对照品储备液 准确称取对照品紫杉醇110mg,置于110mL 容量瓶中,以甲醇溶解并定容,配制成相应浓度的对照品储备液,使用时稀释成所需浓度.

212 样品溶液 准确称取粉碎至80目的样品5g,加入甲醇20mL,超声提取1h,抽滤,以甲醇洗涤滤渣2次,每次1mL.滤渣重复上述操作,所得滤液与前一次滤液合并,回收大部分溶剂后,与2g 中性氧化铝吸附混合,干燥1小时装入预先装填好的中性氧化铝(10g)小柱上,用氯仿100%淋洗至流出液无色,然后用三氯甲烷)甲醇(100:5)洗脱至绿色带至柱底层止,温水浴挥干,残渣用甲醇溶解并定容至2mL,即得供试品溶液.

3 色谱条件

收稿日期:2006-03-20作者简介:吴江(1963-),男(汉族),浙江绍兴人,青海民族学院副教授.

2006年

第3期 青海师范大学学报(自然科学版)

Journal of Qinghai Normal University(Natural Science) 2006

No 13

色谱柱:Kromasil )C 18(250mm @416mm,5L m)柱;流动相:甲醇:水为65:35;流速018mL #min -1;检测波长为227nm;柱温35e .该色谱条件下紫杉醇被洗脱且达到基线分离,保留时间为2410min(见图

1).

图1 紫杉醇对照品(A)和样品(B)色谱图

Fig 11 Chromatogra ms of Ta xol (A)and s ample of Ta xus (B)

4 线性关系考察

准确称取紫杉醇标准品1100mg,定容于1mL 甲醇中,稀释得0.100mg #mL -1浓度的甲醇溶液,然后在确定的测试条件下分别进样215L L 、510L L 、715L L 、10L L 、1215L L 、15L L,测得标准工作曲线为:A=446139x )56105(A:色谱峰面积.x:紫杉醇绝对含量),相关系数r=019996,线性范围:0.25~115L g.5 检测限

在选定的色谱条件下,分别以不同浓度当信噪比S/N=3时,测得该条件下紫杉醇最低检测限为215ng.

6 精密度试验

浓度为0101mg #mL -1对照品重复进样6次,每次10L L,测定各次色谱峰面积的RSD%=212%,表明仪器精密度良好.

7 重复性试验

同一样品重复进样6次,测得RSD%=312%,表明方法重复性良好.

8 回收试验

回收率:准确称取粉碎的红豆杉树叶样品5g,加入011mL 的标准品1同212制备1(见表1)

表1 回收率测定值

Table 1 Recove ry o f taxol

样品量(g)

标准品加入量(mg)回收率(%)平均回收率RSD%

5100

010295135.00

010297125.00

010210315981311465.00

010298175.000102961472 青海师范大学学报(自然科学版) 2006年

表2 红豆杉树叶样品中紫杉醇的含量(%,n=3)

Table 2 Contents o f Taxol(%,n =3)

样品(sample)

紫杉醇含量(TaxoL)1

01005522

01006523

01006744

01004715

0100582601007439 稳定性试验准确称取粉碎的红豆杉树叶样品5g,按/2120项下方法操作,分别在0,2,4,6,8h 时分别进样,测定紫杉醇的峰面积,计算得RSD 分别为211%,212%,216%,311%,214%(n=5).表明样品溶液在8h 内稳定.10 测定结果

取/2120项下制备的样品溶液按上述色谱条件进行分析,经DAD 检测器检测紫杉醇的峰纯度且其紫外光谱与对照品一致后,按外标法以峰面积积分值计算,得紫杉醇的含量(每个样品重复进样3次,取平均值).结果见表2.

11 讨论

1111 检测波长的确定 上述对照品溶液进样后,利用DAD 检测器在190~400nm 扫描其吸收光谱,对照品均在227nm 波长处有较高的吸收,选择该波长为检测波长.

1112 提取方法确定 比较了超声及热回流两种提取方法对分析结果的影响,结果表明,热提取3次以及超声提取2次以后,继续增加提取次数对提取率已无明显影响,但超声次数少,提取率比热回流提取法略高,故本试验采用超声提取法.

1113 富集方法的确定 样品经212处理后,与2g 中性氧化铝吸附混合,减压干燥1小时,装在事先装好的中性氧化铝小柱上(10g),先以30mL 氯仿淋洗掉低极性杂质,继以氯仿:甲醇100:5洗脱,每馏分15mL,依次收集洗脱液(紫杉醇洗脱液),将收集的洗脱液温水浴挥干,再以甲醇定容至2mL 后过0145L m 滤膜,在选定色谱条件下分析紫杉醇含量,结果发现,紫杉醇富集在氯仿:甲醇100:5洗脱液的第1、2份中,第3份洗脱液中未检到紫杉醇,可知紫杉醇全部富集于前30m L 氯仿:甲醇100:5洗脱液中.参考文献:

[1] 余琨、丁艳涛,孟宪境,等1紫杉醇在我国的应用近况[J]1肿瘤防治杂志,2001,8(4):440-443.

[2] 张志强,苏志国1氧化铝催化7)))表策杉蘑转化为策杉蘑的机理探索[J]1生物工程学报,2000,16(3):378.

[3] 苏应娟,王艇,李雪雁,等1南方红豆杉不同部位紫杉醇含量的分析[J]1天然产物研究与开发,2001,13(2)19-211

[4] 张鸿,杨明惠1国产红豆杉各部位紫杉醇含量分析[J]1中草药,2000,31(6):434-4351

[5] 邱德有,李如玉,韩一凡1紫杉醇提取分离方法的研究进展[J]1中国药学杂志,1996,31(11):646-6481

Determination of Taxol in Leaf of Yew from Xizang

by Solid -phase Extraction and RP -HPLC

WU Jiang,LU Yong -Chang ,Z HU Xiao -jun

(11The Department of Science and Tenchnology of Qinhai Nationlities University,Xining 810007,China;

21Chemistry Department of Qinghai Nationalities University,Xining 810007,China)

Abstract:Objective:To establish a quantitative method of Taxol in Leaf of ye w by solid -phase extraction and RP -HPLC.Method:The sample were extracted by neutral AI 2O 3solid phase column and elute with chloroform -methanol (100B 5);The taxoL was separated on the column of Kromasil )C 18(250mm @416mm,5L m)which elut -ed with methanol and water(0104%phosphoric acid)65:35;UV detector at 227nm,flow rate at 018mL 1min -1,column temperature at 30e 1Results:The taxoL was enriched at chLoroform -methanoL (100:5),The Linear ranges of taxoL was 0125~115L g (r=019996)recovery was 9812%(RSD=1146%),Conclusions:The method is rapid and precise 1Key words:Taxus from Xizang;Taxol;solid -phase e xtraction;RP-HPLC 73第3期 吴江,等:固相萃取)反相高效液相色谱法测定西藏红豆杉叶中紫杉醇的含量