致病性马兽疫链球菌的分离鉴定_生物学特性及其M_like基因的序列分析

第 １１ 期
王淑杰，等． 致病性马兽疫链球菌的分离鉴定、生物学特性及其 Ｍ－ｌｉｋｅ 基因的序列分析
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病的主要病原。马链球菌兽疫亚种属于兰氏分群的 Ｃ 群链球菌，是马链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ， Ｓｔｒ．ｅｑｕｉ） 的一个亚种，具有宿主多样性，易于变异，可通过 外伤、手术等途径感染多种动物，引发败血症、脑 膜炎、心内膜炎、关节炎等［１－３］，该菌也可以感染人［４－５］， 为一种人兽共患病病原。辽宁省锦州市某猪场自 ２０１０ 年以来经常爆发关节炎病疫情，为确定致病菌 我们将患猪的关节液涂板，结果检出革兰氏阳性链 球菌，经鉴定为马链球菌兽疫亚种，通过药物敏感 性试验测定该分离菌对药物的敏感性，为该病的有 效防治提供实验依据。
ＷＡＮＧ Ｓｈｕ－ｊｉｅ１，２， ＪＩＡＮＧ Ｃｈｅｎｇ－ｇａｎｇ２， ＷＵ Ｊｉａ－ｎａｎ２， ＬＩＵ Ｙｏｎｇ－ｇａｎｇ２， ＪＩＮ Ｊｉａ－ｍｉｎ１， ＬＩＵ Ｈｅ２， ＣＡＩ Ｘｕｅ－ｈｕｉ２＊， ＺＨＡＮＧ Ｘｉｕ－ｙｉｎｇ１＊
（１． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｒｂｉｎ １５０００１， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐｌａｇｕｅ Ｄｉａｇｎｏｓｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ，
结果 Ｒｅｓｕｌｔ
－ ＋ － － － ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ － － － ＋ ＋ ＋
编码数 ｃｏｄｅｄ ｎｕｍｂｅｒ
２
４
６
３
６
０
７
１
２
３
２ ０００ ｂｐ
１ ０００ ｂｐ ７５０ ｂｐ ５００ ｂｐ
２５０ ｂｐ １００ ｂｐ
１： Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ； ２： ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ Ｍ－ｌｉｋｅ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ； ３： ＤＬ２０００ Ｍａｒｋｅｒ
素 Ｇ、红霉素、克拉霉素、克林霉素、米诺环素、环丙沙星、左氟沙星、多粘菌素 Ｂ、呋喃妥因敏感，对氯霉
素、四环素、诺氟沙星、复方新诺明不敏感。
关键词：马兽疫链球菌；分离；鉴定；ＰＣＲ
中图分类号：Ｓ８５２．６１
文献标识码：Ａ
文章编号：１００８－０５８９（２０１２）１１－０８７８－０４
Isolation and identification of a Streptococcus equi subsp. zooepidemicus and the M-like gene analysis
2.2 生化鉴定结果 用 ＡＰＩ ２０ ＳＴＲＥＰ 试验条进行 生化试验，分离菌的菌液在 ＡＰＩ ２０ ＳＴＲＥＰ 试验条上 培 养 ４ ｈ 后 的 生 化 反 应 结 果 见 表 １， 其 数 码 为 ２４６３６０７，与 ＡＰＩ ２０ ＳＴＲＥＰ 的分析图谱索 引 比 对 确 定为 Ｓｔｒ．ｅｑｕｉ．ｚｏｏｐｉｄｅｍ，表明该分离菌为马链球菌兽 疫亚种。 2.3 类 M 蛋白基因 PCR 扩增结果 扩增 Ｍ－ｌｉｋｅ 基 因的 ＰＣＲ 鉴定结果为 Ｍ－ｌｉｋｅ 基因阳性（图 ２），结合 生化试验结果，确定该分离菌为马链球菌兽疫亚 种，将其命名为 １０ＪＺ１２。 2.4 同源性分析 与 １３ 株 Ｓ．ｅｑｕｉ 的比对表明，１０ＪＺ１２
用 ＭＥＧＡ５．０ 软 件 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ 方 法 构 建 遗 传 进 化树。 1.7 药物敏感性试验 采用药敏纸片法分析分离细 菌对临床常用的 １５ 种药物的敏感性，按照说明书的 操作流程进行操作。 1.8 分离菌株的小白鼠致病性试验 参照文献［７］ 将纯培养物接种到 ＴＨＢ 肉汤过夜培养后计数，腹腔 接 种 ５ 只 小 鼠 ，每 只 注 射 ０．５ ｍＬ （１．７５ ×１０８ ｃｆｕ） 分 离 菌 ；另 取 ２ 只 小 鼠 接 种 等 量 ＴＨＢ 肉 汤 作 为 对 照 组，隔离观察小鼠发病及死亡情况，观察期为 １ 周。无菌采集死亡小鼠的腹腔脏器，划板分离细 菌，观察其菌落形态、生长特性和生化特性。
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中国预防兽医学报
２０１２ 年
表 １ 分离株生化试验鉴定结果 Ｔａｂｌｅ １ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ
试验 Ｔｅｓｔ 丙酮酸钠 ＶＰ 马尿酸盐 ＨＩＰ 七叶灵 ＥＳＣ 吡咯烷酮 －β－ 奈胺 ＰＹＲＡ ６－２－ 荼 －αＤ－ 半乳糖呲喃甙 Ａ－ＧＡＬ 荼酚 ＡＳＢ１－ 葡萄糖醛酸盐 Ｂ－ＧＵＲ ２－ 荼 －βＤ－ 半乳糖呲喃甙 Ｂ－ＧＡＬ ２－ 萘 － 磷酸盐 ＰＡＬ Ｌ－ 亮氨酸 －β－ 萘胺 ＬＡＰ Ｌ－ 精氨酸 ＡＤＨ Ｄ－ 核 糖 ＲＩＢ Ｌ－ 阿拉伯糖 ＡＲＡ 甘露醇 ＭＡＮ 山梨醇 ＳＯＲ 乳糖 ＬＡＣ 海藻糖 ＴＲＥ Ｉ 菊糖 ＩＮＵ 棉子糖 ＲＡＦ 淀粉 ＡＭＤ 糖原 ＧＬＹＧ β－ 溶血环 βＨＥＭ
第 ３４ 卷 第 １１ 期 ２０１２ 年 １１ 月
中国预防兽医学报
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
Ｖｏｌ． ３４，Ｎｏ．１１ Ｎｏｖ． ２０１２
ｄｏｉ： １０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００８－０５８９．２０１２．１１．０７
致病性马兽疫链球菌的分离鉴定、生物学特性 及其 M- like 基因的序列分析
1 材料和方法
1.1 病料、主要试剂和实验动物 从辽宁省锦州市 一猪场采集关节肿胀猪的关节液、革兰氏染液、鲜 血 琼 脂 平 板 、 Ｔｏｄｄ－Ｈｅｗｉｔｔ 肉 汤 （ＴＨＢ） 和 琼 脂 购 自 ＯＸＯＩＤ 公司；Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶购 ＴａＫａＲａ 公司；细 菌 ＤＮＡ 提取试剂盒购自 ＴｉａｎＧｅｎ 公司；药敏片购自 杭州天和试剂公司；ＡＰＩ ２０ ＳＴＲＥＰ 链球菌鉴定系统 购自法国梅里埃公司；８ 周龄清洁级 ＩＣＲ 品系小鼠 购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心。 1.2 细菌分离培养 将无菌采集的患猪关节液划线 接种于血平板培养基上，于 ３７ ℃恒温培养 １８ ｈ。 1.3 革兰氏染色镜检 在血平板培养基上挑单个菌 落用常规方法进行革兰氏染色镜检。 1.4 分离菌株的生化试验 挑取单个 菌 落 于 ＴＨＢ 液体培养基增菌，将纯菌悬液接种于干燥的酶底 物，采用 ＡＰＩ ２０ ＳＴＲＥＰ 链球菌鉴定系统进行生化鉴 定，按照使用说明书进行操作，参照分析图索引或 应用鉴定软件包得到鉴定结果。 1.5 分离菌株的 M- like 基因鉴定 参照文献［６］建 立的方法，所用的引物为：Ｍ－ｌｉｋｅ＿Ｕ：５＇－ＧＣＡＧＣＣＣ ＴＣＴＴＧＧＴＴＧＧＴ－３＇ 和 Ｍ－ｌｉｋｅ＿Ｌ： ５＇－ＴＡＣＣＴＣＣＴＧＣＧ ＡＣＴＧＣＧＴＣ－３＇，预扩增片段为 ３６４ ｂｐ；以分离细菌 的 ＤＮＡ 为模板进行扩增，反应条件为：９５ ℃ ５ ｍｉｎ； ９４ ℃ ４５ ｓ、 ５６ ℃ ４５ ｓ、 ７２ ℃ ４５ ｓ； ７２ ℃ １０ ｍｉｎ。 扩增产物由华大基因技术服务有限公司测序。 1.6 M- like 基 因 的 序 列 分 析 将 测 定 的 序 列 采 用 ＢＬＡＳＴ 分析比对，再 应 用 ＤＮＡＳｔａｒ 软 件 中 的 Ｍｅｇ－ Ａｌｉｇｎ 程序与 ＧｅｎＢａｎｋ 登录的 Ｓ．ｅｑｕｉ 中 １３ 个不同的 菌株的 Ｍ－ｌｉｋｅ 基因序列进行比对和同源性分析；应
＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ
收稿日期：２０１１－１０－１１ 基金项目：转基因生物新品种培育重大专项（２００９ＺＸ０８００９－１４１Ｂ） 作者简介：王淑杰（１９７９），女，黑龙江绥化人，博士研究生，助理研究员，主要从事动物细菌学与免疫学研究． ＊ 通信作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ＺＸＹ０４５１＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ；ａｃｉ１３９＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
分离；对分离细菌进行形态学观察、生化反应、致病性试验及药物敏感性试验；并对其 Ｍ－ｌｉｋｅ 基因进行克隆和
测序分析。结果在显微镜下观察到周围具有透明的 β 溶血环的革马兽疫链球菌 （命名为 １０ＪＺ１２）；分离株 １０ＪＺ１２ 对小鼠的致死剂量为 １．７５×１０８ ｃｆｕ；并对苯唑西林、青霉
2结果
2.1 分离培养与形态学特征 将关节液在血平板上 培养 １８ ｈ 后，形成白色、透明、边缘整齐的带有 β 溶血环的光滑型菌落，直径约 ５．０ ｍｍ，革兰氏染色 镜检可观察到散在排列的革兰氏阳性中长链球菌； 图 １ 为分离菌经革兰氏染色后的镜下形态。
图 １ 分离菌的革兰氏染色形态（１００×） Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｓｏｌａｔｅ ｂｙ Ｇｒａｍ ｓｔａｉｎ （１００×）
王淑杰 １，２，姜成钢 ２，武嘉男 ２，刘永刚 ２，金家民 １，刘 鹤 ２，蔡雪辉 ２＊，张秀英 １＊
（１． 东北农业大学 动物医学院药理教研室，黑龙江 哈尔滨 １５０００１；２．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室 ／ 疫病诊断与技术服务中心，黑龙江 哈尔滨 １５０００１）
摘 要：为鉴定锦州某猪场引起关节炎病疫情的病原，本研究将患猪关节液在血平板培养基上培养进行细菌
Ｈａｒｂｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈａｒｂｉｎ １５０００１， Ｃｈｉｎａ）
Abstract： Ａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｉｇ ｓｙｎｏｖｉａ ｆｌｕｉｄ ｏｆ ａｒｔｈｒｏｓｉｓ ｂｙ ｂｌｏｏｄ ａｇａｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ， ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｓｔ， Ｍ－ｌｉｋｅ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ， ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｍｉｃｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ． Ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｓｏｌａｔｅ ｗａｓ Ｇ＋ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍ－ｌｉｋｅ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｗａｓ ９６．２％ ｔｏ ９７．１％ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｓｔｒ．ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ． ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ， ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｓｏｌａｔｅ ｗａｓ Ｓ．ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ． ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ， ｄｅｓｉｇｎａｔｅ １０ＪＺ１２． Ｔｈｅ ｌｅｔｈａｌ ｄｏｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｗａｓ １．７５ ×１０８ ｃｆｕ ｔｏ ｍｉｃｅ， ａｎｄ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｗａｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｏｘａｃｉｌｌｉｎ， ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｇ， ｅｒｙｔｈｒｏｃｉｎ， ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ， ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ， ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ， ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ， ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ， ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ ａｎｄ ｆｕｒａｄａｎｔｉｎ， ｂｕｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ａｍｐｈｅｍｙｃｉｎ， ａｍｂｒａｍｙｃｉｎ， ｎｏｒｆｌｏｘａｃｉｎ．