基于DIG_化学发光法的Southernblot方法优化
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Key words： Southern blot hybridization DIG labeling Chemiluminescence Nylon membrane Probe
Southern blot 方法是分子生物学中的一项基本 技术，它在检测目的基因拷贝数、鉴定转基因植株、 开发分子标记、筛选 DNA 文库中具有重要的作用， 但该技术步骤较繁琐，要想得到理想的结果，往往费 时费力。传统 Southern blot 分析的探针通常是用32 P 或35 S 标记。近年来，生物素、DIG 等非放射性标记 物越来越多地用来标记核酸探针，克服了放射性同 位素标记技术的固有缺点，并且能够得到可以与放 射性标记 相 媲 美 的 结 果［1］。 由 于 非 放 射 标 记 法 所 需的步骤更多，因此要得到理想的结果就需要注意 更多的细节。本研究结合具体试验，从探针浓度、样
Reverse AGCATTTCGTCGGAATACATC 56
s5 Forward TGTCCGTCGTTCCGCTTTTTTCG 62
Reverse CTATGGAGGTTGCTGCTGATGC 62
n5 Forward TCACCACCCGTTGTGCGGAGCC 64
Reverse GTATGTACGCAGGGAGAGTTTC 64
（ 1 Biotechnology Research Institute，National Key Facility of Crop Gene Resources and Genetic Improvement，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081； 2 College of Life Science，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）
1 061 463
1 304 687 221
1 393 625 791 559 470 333
1． 1． 3 试剂与仪器 DIG high prime labeling and detection starter kit II 购自 Roche 公司。EcoR I，Hind III 限制性内切酶购自 Promega 公司。Taq DNA 聚 合酶购自天根生物公司。琼脂糖购自西班牙。其它 化学试剂购自北京拜尔迪生物技术公司，均为分析 纯。尼龙膜 Hybond-N + 购自 Amersham 公 司； 凝 胶 回收试剂盒购自 Axygene 公司。DNA ladder 0331 购 自 Fermentas 公司。紫外交联仪为 CL-1000 Ultraviolet Crosslinker（ 美国 UVP 公司） 。紫外分光光度计 为 ND-1000（ 美国 NanoDrop 公司） 。 1． 2 方法 1． 2． 1 棉花基因组 DNA 提取 改良的 CTAB 法［2］
n9 Forward CATGGGAATAGATCTGATACC 59
Reverse CAAAATCGAAATAGCGAAATTC 55
a1 Forward ATTTTCAAGTGGATGAGATCGG 59
Reverse GATCACAGAATCCATTGACAGC 61
a6 Forward TATTTCTCATTCACAAATC
提取棉花嫩叶。液氮研磨时要做到快速充分，苯酚： 氯仿抽提时要多抽提几次，尽量使有机相和水相之 间无白色物质。 1． 2． 2 基因组的酶切 电泳检测提取的基因组 DNA，确保没有明显的蛋白、RNA 残留后，用紫外分 光光度计进行定量。每个样品取 40 μg 进行酶切， 酶切体系为 400 μL，其中包含 40 μL 10 × buffer，300 U 的限制性内切酶，4 μL 的 100 × BSA。酶切时，先 将基因组 DNA、ddH2 O、10 × buffer 加好，反复混匀， 然后再加 入 BSA 和 内 切 酶，再 充 分 混 匀［3］。然 后 37℃ 反应 6 － 8 h。期间每隔 2 h 弹动混匀一次。反 应结束后，取 5 μL 进行电泳检测，一是看酶切是否 完全，二是看各样品间亮度是否一致，若某个样品亮 度明显弱，则应再补切适量的基因组 DNA。若酶切 完全且各样品间 DNA 量一致，则用 0． 8 倍体积异丙 醇和 0． 1 倍体积 3 mol / L NaAc 沉淀酶切产物，然后 用 75% 乙醇涮洗 1 次，晾干后加入 30 － 40 μL ddH2 O 重溶，准备上样。 1． 2． 3 电泳 使用大孔梳齿和大胶板配胶，梳孔容 量要达到 40 μL 以上； 缓冲液为 1 × TAE，琼脂糖浓 度为 0． 8% ； 电泳条件为 35 V，16 h，即通常要跑足 500 Vh。 1． 2． 4 转膜 电泳结束后，用 0． 25 mol / L HCl 溶 液浸 泡 凝 胶 15 min 后，用 碱 变 性 液 （ 1． 5 mol / L NaCl，0. 5 mol / L NaOH） 处 理 1 h。然 后 使 用 BioRad 公司的 785 型真空转印仪进行转膜。转膜条 件： 5 inch Hg，75 min。10 × SSC 转膜，转完后，用 2 × SSC 涮洗尼龙膜 2 － 3 次。 1． 2． 5 紫外交联 将尼龙膜放到紫外交联仪中交 联 1 min，照射剂量大约为 0． 1 J / cm2 。 1． 2． 6 预杂交 交联结束后，直接将尼龙膜放入杂 交管中，加入预杂交液，在杂交炉中慢速转动 1 h。 1． 2． 7 探针的制备与处理 做 4 管 50 μL 的 PCR 反应体系来扩增目的基因片段，凝胶回收后用紫外 分光光度计进行定量，取 1 μg DNA 按照试剂盒中 的要求进行标记，标记条件为 37℃ ，20 h，期间弹动 混匀数次。同时，将 DNA Marker 也进行标记。标记 结束后，沸水浴处理 10 min，－ 20℃ 冻存备用。使用 时，将目的基因探针和 Marker 探针同时加到预杂交 液中，探针总浓度为 25 ng / mL，其中 Marker 探针占
c2 Forward GATGCAGCGGAACCATGGC
64
Reverse CTGCACTGACCATAGTAAACTC 61
c3 Forward ATGATTGAATCTCAGAGGCAC 59
Reverse ACCACCCCACCAATAGATAGA 61
n6 Forward TTCTGTTTTGTCGAGCCTTGCTTTG 60
收稿日期： 2011-02-22 基金项目： 国家转基因生物新品种培育科技重大专项（ 2008ZX08005-004） 作者简介： 张晓，男，博士研究生，研究方向： 植物基因工程； E-mail： enerrgy@ 126． com 通讯作者： 郭三堆，男，研究员，研究方向： 棉花基因工程研究； E-mail： gsdui@ mail． caas． net． cn
·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2011 年第 9 期
基于 DIG － 化学发光法的 Southern blot 方法优化
张晓1，2 张锐1 于源华2 史计1 孟志刚1 孙国清1 周焘1 郭三堆1
（ 1 中国农业科学院生物技术研究所 国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程，北京 100081； 2 长春理工大学生命科学技术学院，长春 130022）
关键词： Southern blot DIG 标记 化学发光法 尼龙膜 探针
Optimization of Southern Blot Analysis Based on DIG-Chemiluminescent Detection
Zhang Xiao1，2 Zhang Rui1 Yu Yuanhua2 Shi Ji1 Meng Zhigang1 Sun Guoqing1 Zhou Tao1 Guo Sandui1
品处理、洗膜方法、探针标记及曝光时间等多个方面 对试验方法进行了改进，得到了结果理想、重复性好 的一套方法。
1 材料与方法
1． 1 材料 1． 1． 1 植物材料 棉花细胞质雄性不育系 P30A、 P53A、P80A、S25-4A、96-48A、AP25MA、1081A、 CMS-D8； 保 持 系 P30B、P53B、P80B、S25-4B、9648B、AP25MB、1081B； 恢复系 Y18。 1． 1． 2 基因探针 Southern blot 所用探针及引物如 表 1 所示，引物由上海生工合成。
摘 要： 目前，基于 DIG-化学发光法的 Southern blot 技术已在生物实验室广泛应用，但在试验过程中经常会遇到背景 黑、目的信号弱等问题，以致不能获得理想结果。在棉花线粒体基因组 RFLP 分析过程中结合前人经验对基于 DIG-化学发光 法的 Southern blot 技术在探针标记、探针浓度、探针剥离等方面进行了优化。优化后的方法重复性好，一张转好的尼龙膜最多 可以反复使用 11 次； 一份杂交液在两年内至少可以反复使用 5 次且不会明显降低杂交效果。
206
生物技术通报 Biotechnology Bulletin
2011 年第 9 期
表 1 探针名称及引物序列
探针 引物
引物序列（ 5'→3'）
Tm（ ℃）
产物大 小（ bp）
cb Forward GCATTTGATAGATTATCCAAC 55
Reverse GAATGGGCGTTATGGCAAAG 60
Abstract： Southern blot technology based on the DIG-chemiluminescent detection has been widely used in Biology laboratory，but various troubles were appeared in the experiment，such as high background and low sensitivity which can cause obtain ideal results． According to the RFLP analysis of cotton mtDNA and combined with others’experience，we optimized the Southern blot method based on the DIG-chemiluminescent detection． We focused on labeling of probe，concentration of probe，stripping and reprobing of DNA blots． With the optimized method，a nylon membrane can be used for 11 times，and a piece of hybridization solution can be used for 5 times within two years without decreasing performance obviously．
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wenku.baidu.com
Reverse AGCATCATTCAAGTAAATACAG 55
a9 Forward ATGTTAGAAGGTGCAAAATCA 55
Reverse AAAACGAATGAGATCAGAAAG 55
c1 Forward CCACAAGGATATAGGGACTC 60
Reverse GATTGTTACGACCACGAAGAAAC 61
2011 年第 9 期
张晓等： 基于 DIG － 化学发光法的 Southern blot 方法优化
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1 /6（ 如果不需要指示条带的精确大小，Marker 探针 也可以不加） 。将杂交液用 0． 22 μmol / L 或 0． 45 μmol / L 滤膜进行过滤后，便可用来杂交尼龙膜。 1． 2． 8 杂交 杂交时间为 20 － 36 h，杂交液体积为 3． 5 mL /100 cm2 尼龙膜。探针浓度 25 ng / mL。即： 配置 3． 5 mL 杂 交 液，则 所 需 的 探 针 量 为 ［（ 25 × 3． 5） /2 300］× 20 = 0． 76 μL。 1． 2． 9 洗膜 2 × SSC /0． 1% SDS，室温，5 min，洗 两次。0． 5 × SSC /0． 1% SDS，66℃ ，每次 45 min － 2 h，洗两次。 1． 2． 10 封闭 100 mL blocking buffer，室温，1 h。 抗体： 1 ∶ 12 500，1． 6 μL antibody，20 mL blocking buffer。 1． 2． 11 洗 涤 washing buffer （ blocking buffer， 0. 3% Tween 20） 洗 2 h 后过夜。 1． 2． 12 加反应底物 洗涤完成后，将膜浸到 detection buffer 中充分浸透，然后尼龙膜放到保鲜膜 上，迅速均匀滴加上 CSPD，然后用尼龙膜覆盖保鲜 膜。置于 37℃ 培养箱中孵育 15 min。 1． 2． 13 压片 根据尼龙膜上信号强弱，将 X 光胶 片曝光 15 min － 2． 5 h。 1． 2． 14 X 光胶片的冲洗 显影 3 min； 定影 45 s， 然后用清水反复冲洗。 1． 2． 15 探针剥离方法 用尼龙膜完成对一个基因 探针的检测后，及时将之置于无菌水中浸泡 5 min， 然后放 入 杂 交 管 中，加 入 适 量 0． 2 mol / L NaOH / 0. 1% SDS 溶液，37℃ ，慢速转动，洗两 次，每 次 15 min； 用足量 2 × SSC 浸泡两次，然后用保鲜膜包裹， 置 4℃ 冰箱中保存。
Southern blot 方法是分子生物学中的一项基本 技术，它在检测目的基因拷贝数、鉴定转基因植株、 开发分子标记、筛选 DNA 文库中具有重要的作用， 但该技术步骤较繁琐，要想得到理想的结果，往往费 时费力。传统 Southern blot 分析的探针通常是用32 P 或35 S 标记。近年来，生物素、DIG 等非放射性标记 物越来越多地用来标记核酸探针，克服了放射性同 位素标记技术的固有缺点，并且能够得到可以与放 射性标记 相 媲 美 的 结 果［1］。 由 于 非 放 射 标 记 法 所 需的步骤更多，因此要得到理想的结果就需要注意 更多的细节。本研究结合具体试验，从探针浓度、样
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（ 1 Biotechnology Research Institute，National Key Facility of Crop Gene Resources and Genetic Improvement，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081； 2 College of Life Science，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）
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1． 1． 3 试剂与仪器 DIG high prime labeling and detection starter kit II 购自 Roche 公司。EcoR I，Hind III 限制性内切酶购自 Promega 公司。Taq DNA 聚 合酶购自天根生物公司。琼脂糖购自西班牙。其它 化学试剂购自北京拜尔迪生物技术公司，均为分析 纯。尼龙膜 Hybond-N + 购自 Amersham 公 司； 凝 胶 回收试剂盒购自 Axygene 公司。DNA ladder 0331 购 自 Fermentas 公司。紫外交联仪为 CL-1000 Ultraviolet Crosslinker（ 美国 UVP 公司） 。紫外分光光度计 为 ND-1000（ 美国 NanoDrop 公司） 。 1． 2 方法 1． 2． 1 棉花基因组 DNA 提取 改良的 CTAB 法［2］
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提取棉花嫩叶。液氮研磨时要做到快速充分，苯酚： 氯仿抽提时要多抽提几次，尽量使有机相和水相之 间无白色物质。 1． 2． 2 基因组的酶切 电泳检测提取的基因组 DNA，确保没有明显的蛋白、RNA 残留后，用紫外分 光光度计进行定量。每个样品取 40 μg 进行酶切， 酶切体系为 400 μL，其中包含 40 μL 10 × buffer，300 U 的限制性内切酶，4 μL 的 100 × BSA。酶切时，先 将基因组 DNA、ddH2 O、10 × buffer 加好，反复混匀， 然后再加 入 BSA 和 内 切 酶，再 充 分 混 匀［3］。然 后 37℃ 反应 6 － 8 h。期间每隔 2 h 弹动混匀一次。反 应结束后，取 5 μL 进行电泳检测，一是看酶切是否 完全，二是看各样品间亮度是否一致，若某个样品亮 度明显弱，则应再补切适量的基因组 DNA。若酶切 完全且各样品间 DNA 量一致，则用 0． 8 倍体积异丙 醇和 0． 1 倍体积 3 mol / L NaAc 沉淀酶切产物，然后 用 75% 乙醇涮洗 1 次，晾干后加入 30 － 40 μL ddH2 O 重溶，准备上样。 1． 2． 3 电泳 使用大孔梳齿和大胶板配胶，梳孔容 量要达到 40 μL 以上； 缓冲液为 1 × TAE，琼脂糖浓 度为 0． 8% ； 电泳条件为 35 V，16 h，即通常要跑足 500 Vh。 1． 2． 4 转膜 电泳结束后，用 0． 25 mol / L HCl 溶 液浸 泡 凝 胶 15 min 后，用 碱 变 性 液 （ 1． 5 mol / L NaCl，0. 5 mol / L NaOH） 处 理 1 h。然 后 使 用 BioRad 公司的 785 型真空转印仪进行转膜。转膜条 件： 5 inch Hg，75 min。10 × SSC 转膜，转完后，用 2 × SSC 涮洗尼龙膜 2 － 3 次。 1． 2． 5 紫外交联 将尼龙膜放到紫外交联仪中交 联 1 min，照射剂量大约为 0． 1 J / cm2 。 1． 2． 6 预杂交 交联结束后，直接将尼龙膜放入杂 交管中，加入预杂交液，在杂交炉中慢速转动 1 h。 1． 2． 7 探针的制备与处理 做 4 管 50 μL 的 PCR 反应体系来扩增目的基因片段，凝胶回收后用紫外 分光光度计进行定量，取 1 μg DNA 按照试剂盒中 的要求进行标记，标记条件为 37℃ ，20 h，期间弹动 混匀数次。同时，将 DNA Marker 也进行标记。标记 结束后，沸水浴处理 10 min，－ 20℃ 冻存备用。使用 时，将目的基因探针和 Marker 探针同时加到预杂交 液中，探针总浓度为 25 ng / mL，其中 Marker 探针占
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BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2011 年第 9 期
基于 DIG － 化学发光法的 Southern blot 方法优化
张晓1，2 张锐1 于源华2 史计1 孟志刚1 孙国清1 周焘1 郭三堆1
（ 1 中国农业科学院生物技术研究所 国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程，北京 100081； 2 长春理工大学生命科学技术学院，长春 130022）
关键词： Southern blot DIG 标记 化学发光法 尼龙膜 探针
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Zhang Xiao1，2 Zhang Rui1 Yu Yuanhua2 Shi Ji1 Meng Zhigang1 Sun Guoqing1 Zhou Tao1 Guo Sandui1
品处理、洗膜方法、探针标记及曝光时间等多个方面 对试验方法进行了改进，得到了结果理想、重复性好 的一套方法。
1 材料与方法
1． 1 材料 1． 1． 1 植物材料 棉花细胞质雄性不育系 P30A、 P53A、P80A、S25-4A、96-48A、AP25MA、1081A、 CMS-D8； 保 持 系 P30B、P53B、P80B、S25-4B、9648B、AP25MB、1081B； 恢复系 Y18。 1． 1． 2 基因探针 Southern blot 所用探针及引物如 表 1 所示，引物由上海生工合成。
摘 要： 目前，基于 DIG-化学发光法的 Southern blot 技术已在生物实验室广泛应用，但在试验过程中经常会遇到背景 黑、目的信号弱等问题，以致不能获得理想结果。在棉花线粒体基因组 RFLP 分析过程中结合前人经验对基于 DIG-化学发光 法的 Southern blot 技术在探针标记、探针浓度、探针剥离等方面进行了优化。优化后的方法重复性好，一张转好的尼龙膜最多 可以反复使用 11 次； 一份杂交液在两年内至少可以反复使用 5 次且不会明显降低杂交效果。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin
2011 年第 9 期
表 1 探针名称及引物序列
探针 引物
引物序列（ 5'→3'）
Tm（ ℃）
产物大 小（ bp）
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Abstract： Southern blot technology based on the DIG-chemiluminescent detection has been widely used in Biology laboratory，but various troubles were appeared in the experiment，such as high background and low sensitivity which can cause obtain ideal results． According to the RFLP analysis of cotton mtDNA and combined with others’experience，we optimized the Southern blot method based on the DIG-chemiluminescent detection． We focused on labeling of probe，concentration of probe，stripping and reprobing of DNA blots． With the optimized method，a nylon membrane can be used for 11 times，and a piece of hybridization solution can be used for 5 times within two years without decreasing performance obviously．
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Reverse AGCATCATTCAAGTAAATACAG 55
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2011 年第 9 期
张晓等： 基于 DIG － 化学发光法的 Southern blot 方法优化
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1 /6（ 如果不需要指示条带的精确大小，Marker 探针 也可以不加） 。将杂交液用 0． 22 μmol / L 或 0． 45 μmol / L 滤膜进行过滤后，便可用来杂交尼龙膜。 1． 2． 8 杂交 杂交时间为 20 － 36 h，杂交液体积为 3． 5 mL /100 cm2 尼龙膜。探针浓度 25 ng / mL。即： 配置 3． 5 mL 杂 交 液，则 所 需 的 探 针 量 为 ［（ 25 × 3． 5） /2 300］× 20 = 0． 76 μL。 1． 2． 9 洗膜 2 × SSC /0． 1% SDS，室温，5 min，洗 两次。0． 5 × SSC /0． 1% SDS，66℃ ，每次 45 min － 2 h，洗两次。 1． 2． 10 封闭 100 mL blocking buffer，室温，1 h。 抗体： 1 ∶ 12 500，1． 6 μL antibody，20 mL blocking buffer。 1． 2． 11 洗 涤 washing buffer （ blocking buffer， 0. 3% Tween 20） 洗 2 h 后过夜。 1． 2． 12 加反应底物 洗涤完成后，将膜浸到 detection buffer 中充分浸透，然后尼龙膜放到保鲜膜 上，迅速均匀滴加上 CSPD，然后用尼龙膜覆盖保鲜 膜。置于 37℃ 培养箱中孵育 15 min。 1． 2． 13 压片 根据尼龙膜上信号强弱，将 X 光胶 片曝光 15 min － 2． 5 h。 1． 2． 14 X 光胶片的冲洗 显影 3 min； 定影 45 s， 然后用清水反复冲洗。 1． 2． 15 探针剥离方法 用尼龙膜完成对一个基因 探针的检测后，及时将之置于无菌水中浸泡 5 min， 然后放 入 杂 交 管 中，加 入 适 量 0． 2 mol / L NaOH / 0. 1% SDS 溶液，37℃ ，慢速转动，洗两 次，每 次 15 min； 用足量 2 × SSC 浸泡两次，然后用保鲜膜包裹， 置 4℃ 冰箱中保存。