DNA克隆
基因克隆的原理
基因克隆的原理基因克隆是一种重要的生物技术手段，可以通过复制和传递DNA 分子，实现对特定基因的扩增和增殖。
基因克隆的原理是利用DNA 重组技术，将所需基因的DNA片段插入到载体DNA上，然后将重组的DNA转化到宿主细胞中进行复制和表达。
基因克隆的过程可以分为DNA分离、DNA切割、DNA连接和DNA转化等几个步骤。
需要从源生物体中提取目标基因所在的DNA。
DNA分离是基因克隆的第一步，通常使用细菌或真菌等生物作为DNA的来源。
提取DNA的方法有很多种，常见的有碱裂解法和酚氯仿法等。
这些方法能够将DNA从细胞中释放出来，获得纯净的DNA溶液。
接下来，通过DNA酶切割技术将目标基因从DNA中剪切出来。
DNA酶切割是基因克隆的关键步骤，通过使用特定的限制性内切酶，可以将DNA分子切割成特定的碎片。
限制性内切酶能够识别特定的DNA序列，并在特定的酶切位点上切割DNA，产生具有粘性末端的DNA片段。
然后，将目标基因与载体DNA进行连接。
载体是一种能够自我复制的DNA分子，可以将目标基因插入到载体中进行复制和表达。
常用的载体有质粒、噬菌体和人工染色体等。
连接的方法有多种，常见的是使用DNA连接酶将目标基因与载体DNA连接起来。
连接后的DNA分子称为重组DNA。
将重组DNA转化到宿主细胞中。
转化是指将重组DNA导入到宿主细胞中，使其能够进行复制和表达。
常用的转化方法有热激法、电穿孔法和化学法等。
转化后，宿主细胞将能够复制和表达重组DNA 中的目标基因。
基因克隆技术的应用非常广泛。
通过基因克隆，可以获得大量目标基因的DNA，用于研究基因的结构和功能，以及开发新的药物和治疗方法。
此外，基因克隆还可以用于制备重组蛋白、产生转基因生物和进行基因治疗等领域。
总结起来，基因克隆的原理是利用DNA重组技术将目标基因插入到载体DNA中，然后将重组DNA转化到宿主细胞中进行复制和表达。
基因克隆技术的应用非常广泛，对于研究基因和开发生物技术具有重要意义。
基因克隆(包括DNA提取技术步骤)
基因克隆DNA克隆是指在体外将目的基因或DNA片段同能够自我复制的载体DNA 连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，又称为重组DNA技术。
DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等。
一 DNA的提取二目的DNA片段的获得（酶切）三体外重组1 LB培养基的配制2大肠杆菌感受态细胞的制备3载体的选择四导入受体细胞五重组子的筛选1插入失活法实验一DNA提取取0.5克以下的鱼类组织或20ul血液：1 准备1.5ml离心管，加入500ul裂解液，取组织放入离心管，破碎。
（常温操作）2 恒温箱裂解，55℃。
30min。
3 加等体积Tris饱和酚(酚：氯仿：异戊醇25：24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。
（注意酚在油层下面）4 取上清（把枪头去掉部分，注意液面。
蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中），加入等体积CI(氯仿：异戊醇24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。
5 汇集上清，加2倍无水乙醇(-30度保存)，颠倒混匀可观察到絮状DNA。
在-30度冰箱沉淀30min。
离心4度12000g 10分钟。
6 弃去上清，75%乙醇洗涤，7500g离心5分钟。
7 重复一次上述操作。
7 在无菌台干燥半小时，乙醇挥发。
8 溶解于200ulddwater。
9 定量DNA。
裂解液的配制1ml体系200ul 0.5M EDTA（PH=8.0高压灭菌。
作用抑制酶的活性。
）螯合DNA酶发挥作用需要的金属离子。
50ul 10%SDS（蛋白质变性剂）10ul 1MTris-cl（PH=8.0高压灭菌）缓冲溶液5ul PK（消化）735ul 灭菌超纯水EDTA（0.5 M，pH8.0）将186.1 g 二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na.2H2O）加入800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
分子生物学(DNA概述、PCR、DNA克隆、内切酶)
此处缺失不影响裂解性周期
插入型及替代型载体
用插入型载体进行克隆 噬菌体基因组是一 个线性分子，但其两 个末端具有12个核苷 酸的单链突出，称为 cos位点。 cos位点序列与 噬菌 体的体外包装密切相 关。
< 18 kb
串联体
37-52 kb
体外包装混合物
体外包装
筛选重组噬菌体
噬菌体感染20分钟后细菌死亡
某些大肠杆菌菌株具有一个修饰的lacZ基因，该基因中缺失lacZ’部分。
பைடு நூலகம்
单一限制性酶切位点簇
< 10 kb
IPTG：异丙基硫代半乳糖 苷，一种酶的诱导剂。
+IPTG
Lac筛选（蓝白斑筛选）
3.1 克隆载体及其使用方式
B. 建立在大肠杆菌噬菌体基因组基础上的 克隆载体
最初尝试着发展能操作大片段DNA分子的载体集中 在噬菌体上。 噬菌体存在两种感染周期： 裂解性感染周期 溶源性感染周期
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黄石国家公园蘑菇泉
210万年/3次
嗜热水生菌YT-1是由布罗克和他的学生从该湖湖底的喷泉口 水样分离得到的。
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2.2 核酸酶
B. 检查限制性消 化的结果
琼脂糖凝胶电泳
Restriction digest of large size genomic DNA
琼脂糖凝胶电泳
PAGE电泳 脉冲场凝胶电泳
2.2 核酸酶
B. 检查限制性消化的结果
第五章DNA克隆用载体
三、质粒的构建
（一） 质粒人工构建的方法 方法就是在天然质粒的基础上进行
DNA重组，拼拼接接，以改变其性 能。
（二） 质粒人工构建的目的
（1）加入合适的选择标记基因，如两个 以上，易于用作选择；
（2）增加或减少合适的酶切位点，便于 重组；
（3）缩短长度，切去不必要的片段，提 高导入效率，增加装载量；
质粒pBR322 DNA
pBR322 质粒图谱
多克隆位点
氨苄青霉素 抗性基因
四环素抗 性基因
pUC系列的质粒载体
pUC系列的质粒载体集中了当时载体的诸多优点。 包括4个部分： ①来自pBR322的复制起点(ori)； ②氨苄青霉素抗性基因(ampr)； ③大肠杆菌乳糖操纵子的调节基因(laci)启动子 (Plac)和β 半乳糖苷酶的α -肽(lacZ)； ④位于lacZ基因中靠近5′端的一段多接头，或称为 多克隆位点(MCS)。
因此通过蓝白斑筛选可 以筛选、鉴定重组体与非重 组体载体。
pGEX-6P-1 质粒物理图谱
SV40， 猴空泡病毒40
巨细胞病毒 （CMV）
（二）不相容性
利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被导入同一细胞 中，它们在复制及随后分配到子细胞的过 程中，就会彼此竞争，它们在单细胞中的 拷贝数也会有差异，拷贝多的复制更快， 结果在细菌繁殖几代之后，细菌的子细胞 中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这 两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细 胞中，这就是所谓的质粒不相容性。
MAC (Mammalian Artificial Chromosome)
病毒载体
E.coli E.coli 酵母细胞 哺乳类细胞 动物细胞
环状 环状 线性染色体 线性染色体 环状
cdna基因克隆的基本原理和流程
一、CDNA基因克隆的基本原理CDNAplementary DNA）是DNA的互补序列，通过反转录酶将mRNA作为模板合成的一种DNA。
CDNA基因克隆是利用逆转录酶将mRNA逆转录合成cDNA，并通过PCR或其他方法将cDNA插入到质粒载体中，实现对目标基因的克隆。
二、CDNA基因克隆的流程1. RNA提取：首先需要从细胞中提取出总RNA，可以使用TRIzol等试剂进行RNA的提取纯化工作。
2. 反转录合成cDNA：将提取得到的RNA作为模版，利用逆转录酶进行cDNA的合成。
反转录反应通常包括RNA模版、随机引物、dNTPs、逆转录酶和缓冲液，并经过一系列温度循环反应，将mRNA 逆转录成cDNA。
3. cDNA纯化：为了避免反转录反应中产生的非特异性产物和杂质，需要对反转录反应产物进行纯化。
4. cDNA扩增：对cDNA进行PCR扩增，以获得目标基因的cDNA 片段。
PCR反应体系包括cDNA模板、引物、dNTPs、Taq聚合酶和缓冲液，通过一系列温度循环反应，扩增目标基因cDNA片段。
5. 酶切与连接：将PCR扩增得到的cDNA片段与质粒载体进行酶切，并在两者的黏端上连接。
6. 转化：将连接得到的质粒转化入大肠杆菌等细菌中，使其进行复制。
7. 筛选与鉴定：通过筛选和鉴定，选出携带目标基因cDNA片段的质粒，进行测序和分析，最终确定目标基因序列。
三、CDNA基因克隆的应用CDNA基因克隆技术已广泛应用于基因克隆、基因表达等多个领域。
在科研领域中，通过CDNA基因克隆技术可以方便快捷地获得目标基因的cDNA，实现对目标基因的研究和功能分析；在医药领域，CDNA基因克隆技术也被应用于基因治疗、蛋白表达等方面。
总结：CDNA基因克隆是一种重要的基因工程技术，通过反转录酶合成cDNA并将其插入到质粒中，可以方便地获取目标基因序列，具有广泛的应用前景。
掌握CDNA基因克隆的基本原理和流程对于开展相关实验研究具有重要意义。
dna克隆名词解释
dna克隆名词解释DNA克隆是一种生物技术，指的是通过复制和操纵DNA分子，在体外产生相同的DNA分子。
它是基因工程中最基础和重要的技术之一，广泛应用于生物学、医学和农业等领域。
DNA克隆能够帮助科学家们理解DNA的结构和功能，也为疾病的诊断和治疗提供了新的方法。
通过DNA克隆，科学家们可以获取和复制特定的DNA片段，然后将其插入到合适的目标细胞中，使目标细胞具备引入DNA片段所编码的新的特性或功能。
在这个过程中，需要包括DNA提取、切割、连接、转化等多个步骤。
首先，科学家们需要从生物体中提取DNA。
DNA可以来源于细菌、植物、动物等, 例如, 从细菌体中提取的DNA经过PCR扩增后可以得到大量的DNA。
提取的DNA会通过酶切等方法进行切割，切割产生的DNA片段通常会有不同的引物，以便后续连接。
接下来，科学家们需要将DNA片段连接到适当的载体上。
载体是DNA的携带者，通常为圆环状的DNA分子，称为质粒。
质粒可以自主复制，被细胞所识别并复制。
科学家们需要将切割后的DNA片段与质粒通过酶切片段轻松地进行连接，以获得重组DNA分子。
然后，科学家们将重组的DNA分子引入宿主细胞中，这一过程称为转化。
转化可以利用热激或电激等方式进行，以使细胞吸收DNA分子并合成新的蛋白质。
一旦DNA分子成功转化进入细胞，细胞就能够利用这些新获得的基因进行蛋白质合成。
最后，科学家们将细胞培养并分离出含有重组DNA的细胞，这些细胞称为克隆细胞。
克隆细胞在培养和扩增过程中可以形成一定数量的细胞群落。
科学家们可以从这些克隆细胞中提取出DNA，进一步研究其结构和功能。
DNA克隆在生物学研究和应用中具有广泛的意义。
它可以帮助科学家们研究基因组结构和功能，探索人类和其他物种的遗传变异。
此外，DNA克隆也在医学上扮演着重要角色，例如基因治疗、疫苗生产和药物开发等方面。
在农业领域，DNA克隆也被用于改良作物和畜禽的基因，提高产量和抗性。
总之，DNA克隆是一种重要的生物技术，通过复制和操纵DNA分子，能够获取特定的DNA片段并将其插入到目标细胞中。
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
DNA体外重组技术介绍
星活性: 酶切反应条件不能满足最适 条件,导致某些酶产生第二活性.
EcoR I*
GAATTC
AATT
酶切反应体系的建立：
标准的酶切体系 1μgDNA，20μl总反应体积，1U酶，推 荐的Buffer和温度，反应1h
酶切体系组成
• 内切酶 根据实验目的选择，保存，使 用，稀释（避免失活与污染）
第五章
DNA体外重组技术
概述
一、DNA重组技术相关概念
克隆(clone) 来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细 胞
或克动 隆物 化（(c常lo被ni成ng为) 副本或拷贝）。 获取大量单一拷贝的过程，也称无性繁殖。
DNA克隆(DNA cloning)
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传 物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然 的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我 复制能力的DNA分子。
• 大肠杆菌LacZ基因：编码半乳糖苷酶， 分解X-gal，使菌落为蓝色。
pBR322质粒：一种克隆质粒
结构：
ORI：复制起始点， 保证高拷贝自我复制。
Ampr, Tetr：
Ampr
两个抗性基因用于
Tetr
筛选阳性克隆。
Pst I, BamH I：
两个单酶切位点用于 ORI 插入目的基因
pfxBlue: 克隆质粒
质粒载体
体 酵母人工染色体
粘性载体
二、不同载体的特点与分类 （一）质粒载体 1. 质粒(plasmid)
定义: 细菌染色质以外的双链环状DNA， 能自我复制和表达其携带的遗传信息。
染色质 质粒 细菌培养
大肠杆菌
质粒扩增并表达蛋白质
分子生物学名词解释和简答题
既是指有待克隆的DNA，又是指有待研究或应用的克隆产物。
从组织细胞提取
逆转录合成
PCR扩增
化学合成
③简述作为基因克隆的载体有哪些特点，试举例说明。
能自主复制；
具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；
有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；
问答题：
1.简述原核生物和真核生物转录的
不同。
原核为多顺反子，含多个结构基因
真核为单顺反子
原核转录酶只一种，直接起始转录
真核有三种转录酶，需蛋白因子的帮助
两者启动子结构不同
原核转录翻译同步进行
真核转录翻译非同步
原核初级产物具活性
真核加工后才有活性
2.简述复制和转录的异同点。
相同点
酶促核苷酸聚合过程
DNA为模板
方向性连续性简并性通用性
2.简述3种RNA在蛋白质合成中的作用。
mRNA从DNA传递遗传信息
tRNA既是氨基酸转运工具又是读码器
rRNA构成核糖体合成蛋白质
3.简述原核生物肽链合成的主要步骤。
翻译起始
翻译延长进位成肽易位
翻译终止
多核糖体循环
。
名称解释：
转录是遗传信息由DNA向RNA传递的过程，即一股DNA的碱基序列按照碱基互补配对原则指导RNA聚合酶催化合成与之序列互补RNA的过程。
多顺反子mRNA
操纵子是主要调节机制
转录和翻译紧密偶联
阻遏蛋白介导的负性调节为主
转录起始是调节的关键
真核生物基因表达调节特点
转录水平为调节的关键环节
转录以正性调节为主
转录调控中需多种转录因子，始终体现了蛋白与蛋白、蛋白与DNA间的作用
DNA片段的克隆及常见的问题
TA克隆载体简介 TA克隆载体简介
新开发的快速、高效PCR产物克隆的专用载体 新开发的快速、高效PCR产物克隆的专用载体 PCR
pCF-T：TA快速克隆载体 ： 快速克隆载体 pCF-Blunt：多克隆位点为平端，不带T，，其他序列与pCF-T 相 ：多克隆位点为平端，不带 ，，其他序列与 ，，其他序列与 适合平末端DNA片段快速连接 同，适合平末端 片段快速连接
主要内容
DNA克隆简介 克隆简介 DNA克隆的操作步骤 克隆的操作步骤 DNA克隆常见问题及解决方案 克隆常见问题及解决方案
TA克隆的流程 克隆的流程
I.高纯度的基因资源
杂交筛选或PCR扩增目的基因 II.杂交筛选或 扩增目的基因
III.目的基因的纯化 III.目的基因的纯化 IV.目的基因与T载体的连接、 IV.目的基因与T载体的连接、转化 目的基因与 V.目的基因的筛选及鉴定 V.
• •
根据Marker的量及其荧光的强弱，可大致对检测的DNA 根据Marker的量及其荧光的强弱，可大致对检测的DNA Marker的量及其荧光的强弱 样品进行定量。 样品进行定量。 使用此法还有一个突出优点， 使用此法还有一个突出优点，即它可令操作者直观地获 悉所检测DNA样品的完整性及其大小。 悉所检测DNA样品的完整性及其大小。 DNA样品的完整性及其大小
反应体系 目的PCR 片段 目的 对照插入片段（ 对照插入片段（700 bp, 50 ng/µl） ） pBS-T载体 载体 Ligase 10×Ligation Buffer × 无菌去离子水 2 – 7 µl —— 0.5-1 µl 0.5-1 µl 1 µl 补足到10 补足到 µl 阳性对照 —— 1 µl 0.5-1 µl 0.5-1 µl 1 µl 补足到10 补足到 µl
基因重组技术
AAAA
逆转录酶
AAAA TTTT
碱水解
TTTT
DNA聚合酶Ⅰ
SI核酸酶
（二）克隆载体的选择和构建 （三）外源基因与载体的连接
目的基因
载体
限制性内切酶
限制性内切酶
T4 DNA连接酶 15º C
重组体
载体自连
目的基因 自连
目录
（四）重组DNA导入受体菌
受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection)
反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针 在3´羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸基
（三）目的基因
cDNA (complementary DNA) 基因组DNA (genomic DNA)
（四）基因载体
定义
为携带目的基因，实现其无性繁殖或 表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分 子。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA
感染 (infection)
（五）重组体的筛选 1. 直接选择法
(1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹
又称重组DNA工艺学。
目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
（二）工具酶
限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ
逆转录酶
T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶
限制性核酸内切酶
定义 限制性核酸内切酶 (restriction 围切割双链DNA的一类内切酶。 endonuclease,
基因克隆步骤完整版
基因克隆步骤完整版基因克隆是一项复杂的生物技术，可以用于生物研究、药物开发和农业改良等领域。
下面是基因克隆的完整步骤：1.设计克隆实验方案：首先，确定要克隆的基因序列。
这可以是来自同一物种的已知基因，或者是从其他物种中提取的基因。
然后，设计适当的引物（引物是专门设计用来扩增特定DNA序列的短片段）用于PCR扩增。
2.DNA提取：提取目标组织或细胞中的DNA。
常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、盐法和商业DNA提取试剂盒等。
3.PCR扩增：使用引物和DNA模板进行多轮PCR扩增，从而产生大量目标基因的复制。
4.凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳分析，以确认扩增是否成功，并确定目标基因的大小。
5.DNA纯化：将目标基因的PCR产物从凝胶中切割并纯化。
这通常通过使用商业DNA凝胶提取试剂盒来完成。
6.多重限制性内切酶切割和连接：根据克隆方案中的设计，使用适当的限制性内切酶切割DNA。
然后，将目标基因连接到一个载体DNA中，这个载体DNA称为克隆载体。
克隆载体通常是一个圆形的质粒DNA。
7.转化：将克隆载体插入到宿主细胞中。
这可以通过热激冷转化、电转化或化学转化等方法实现。
8.筛选转化子：使用适当的筛选方法筛选转化子。
这可以通过选择性培养基，例如含有抗生素的培养基，或者通过对转化子进行荧光筛选等方法。
9.扩增：从筛选出的阳性克隆中提取DNA，并使用PCR或其他方法进行扩增。
10.序列分析：对扩增的DNA进行序列分析，以确认克隆是否成功。
这可以通过将DNA提交给商业实验室进行测序，或者使用自动测序设备进行测序。
11.功能分析：对克隆所得基因进行功能分析。
可以通过转基因生物的研究，观察基因对生物表型的影响。
12.存储和应用：将克隆所得的基因保存在冷冻库中，以备后续研究或应用。
总结：基因克隆是一项复杂的过程，包括基因序列设计、DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳、DNA纯化、限制性内切酶切割和连接、转化和筛选转化子、扩增、序列分析、功能分析和存储等步骤。
DNA的克隆过程概述
DNA的克隆过程概述DNA的克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此DNA克隆又称分子克隆，基因操作或重组DNA技术。
DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等等。
一目的DNA片段的获得DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，这些DNA分子或来自于目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链 cDNA分子。
由于基因组DNA较大，不利于克隆，因此有必要将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。
若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。
如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DN A 或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因。
二载体的选择基因工程的载体应具有一些基本的性质：1）在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力，这样才能使外源重组的DNA片段得以扩增。
2）分子量尽可能小，以利于在宿主细胞中有较多的拷贝，便于结合更大的外源DNA片段。
同时在实验操作中也不易被机械剪切而破坏。
3）载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性标记基因），以赋予宿主细胞的不同表型特征（如对抗生素的抗性）。
4）载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点，为避开外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。
若载体上的单一酶切位点是位于检测表型的标记基因之内可造成插入失活效应，则更有利于重组子的筛选。
DNA克隆常用的载体有：质粒载体（plasmid），噬菌体载体（phage），柯斯质粒载体（cosimid），单链DNA噬菌体载体（ssDNA phage ），噬粒载体（phagemid）及酵母人工染色体（YAC）等。
克隆载体的名词解释
克隆载体的名词解释克隆载体是分子生物学实验中常用的工具，用于携带并负载外源DNA片段，以实现基因克隆和基因工程。
克隆载体可由天然或人工合成的DNA构建而成，广泛用于基础研究、基因表达、基因治疗等领域。
本文将从克隆载体的定义、组成结构、常见类型以及应用等方面对其进行解释。
一、克隆载体的定义克隆载体是指用于将目标外源DNA导入到宿主细胞或有机体中，并在其中进行自主复制、表达和传递的DNA分子。
克隆载体具有一系列特定的序列和功能元件，包括起始子、终止子、选择标记、荧光蛋白等，以确保成功实现目标DNA的克隆和表达。
二、克隆载体的组成结构克隆载体通常由一个或多个元件组成，包括DNA序列、选择标记、表达载体以及复制起源，具体结构如下：1. DNA序列：克隆载体内含有目标外源DNA的序列，其大小和类型因实验需求而异。
DNA序列通常具有特定的限制性内切酶切位点，以便于将外源DNA片段定向插入到载体中的特定位置。
2. 选择标记：为了筛选成功克隆和转入宿主细胞的载体，克隆载体通常携带有选择标记基因，如抗生素抗性基因或荧光蛋白基因。
这些标记基因在宿主细胞中可以提供对抗生素的耐药性或特定荧光表达，从而方便筛选出含有目标外源DNA的成功克隆载体。
3. 表达载体：对于需要进行表达的克隆载体，其内部还包含有启动子、终止子以及表达宿主基因的相关元件。
这些元件协同作用，使得克隆载体能够在宿主细胞中进行基因的转录和翻译，从而实现目标基因的表达。
4. 复制起源：为了保证克隆载体能够在宿主细胞中独立复制，克隆载体通常还含有复制起源序列。
复制起源序列可以与宿主细胞的复制系统相互配合，使得克隆载体能够被复制并遗传到下一代细胞中。
三、克隆载体的常见类型克隆载体具有多种类型，根据其应用和特性的不同，常见的克隆载体包括质粒、噬菌体、合成DNA以及病毒载体等。
1. 质粒（Plasmid）：质粒是环状的双链DNA分子，常见于细菌和真核生物中。
质粒通常具有小分子大小（约1-10 kb），较容易复制和操纵。
基因克隆基本过程
基因克隆基本过程
基因克隆是指将一个特定的基因从一个生物体中复制并转移到另一个生物体中的过程。
下面是基因克隆的基本过程：
1. 提取DNA：首先，从源生物体中提取包含目标基因的DNA。
这可以通过细胞裂解和提取等方法进行。
2. 载体选取：选择适合携带目标基因的载体（常用的是质粒）。
载体是一种能够自主复制和传递基因的DNA分子，通常由一段可自由输入和输出DNA的DNA序列组成。
3. 切割DNA：酶切目标基因和载体的DNA。
使用限制性内切酶来选择性切割DNA链，创建具有互补粘性末端的DNA片段。
4. 连接DNA：将目标基因的DNA片段和载体的DNA片段通过DNA 连接酶连接起来，形成重组DNA分子。
连接方法可以通过配对末端（使用DNA连接酶）或通过DNA配对（使用DNA重组酶）进行。
5. 转化或转染：将重组的DNA分子导入到宿主细胞中，可以使用多
种方法进行转化或转染，如电穿孔、热激冲击、电转化或化学转染等。
6. 选择与筛选：利用适当的筛选方法，例如选择性培养基、标签或报告基因等，筛选出已经成功转化的宿主细胞，具有目标基因的细胞。
7. 扩增与表达：通过培养已经筛选出的拥有目标基因的宿主细胞，使其大量繁殖，从而扩大目标基因的数量。
此后，宿主细胞可以在特定条件下进行表达，产生所需的蛋白质或表型。
这个过程是基本的基因克隆步骤，可以根据特定的需求和实验目的进行一些具体的修饰或优化。
基因克隆技术是生物科学研究和生物工程领域中广泛应用的重要工具，它使得科学家能够研究和利用特定基因的功能以及相关的生物过程。
分子克隆名词解释
分子克隆名词解释分子克隆是指利用重组DNA技术，将一个生物体的遗传物质（DNA）复制并传递给另一个生物体的过程。
在分子克隆中，一个主要的步骤是将要克隆的DNA片段插入到载体DNA上，形成重组DNA，然后将其传递给宿主细胞进行复制和表达。
分子克隆有许多不同的应用领域，其中最著名的是基因工程和医学研究。
在基因工程中，分子克隆可以用于生产重组蛋白、生产转基因生物和制造药物。
在医学研究中，分子克隆可以用于研究疾病的发病机制、开发新型疗法和筛选药物靶点。
在分子克隆的过程中，有几个重要的术语需要理解。
首先是重组DNA。
重组DNA是将要克隆的DNA片段与载体DNA连接而形成的复合物。
载体DNA通常是质粒，可以在宿主细胞中自主复制和表达。
其次是限制性内切酶。
限制性内切酶是一类酶，可以识别DNA的特定序列，并在该序列上切割DNA。
这些酶在分子克隆中起到“剪刀”的作用，将DNA切割成特定的片段，用于进行重组。
另外一个重要概念是DNA合成。
DNA合成是通过化学合成方法制备DNA片段的过程。
这些合成的DNA片段可以与其他DNA片段连接，形成重组DNA。
在分子克隆的过程中，有几个关键的步骤。
首先是选择合适的限制性内切酶。
限制性内切酶的选择根据克隆的目的和需要选择不同的酶切位点。
然后是DNA切割和连接。
通过酶切和连接反应，将要克隆的DNA片段与载体DNA连接，并形成重组DNA。
接下来是转化过程。
将重组DNA导入宿主细胞，并使其进行自主复制和表达。
最后是筛选或鉴定过程。
通过筛选或鉴定宿主细胞中的重组DNA，筛选出目标克隆。
总之，分子克隆是一种利用重组DNA技术，将一个生物体的遗传物质复制并传递给另一个生物体的过程。
通过克隆可以研究基因功能、生产重组蛋白和制造药物。
分子克隆的关键步骤包括选择限制性内切酶、DNA切割和连接、转化和筛选或鉴定。
分子克隆在生物科学和医学研究中具有广泛的应用前景。
基因克隆的方法
基因克隆的方法基因克隆是一种将特定的DNA片段从一个组织或生物体中复制并插入到另一个生物体中的技术。
这种技术已经帮助我们研究和理解生命过程的许多方面，包括遗传学、发育生物学和分子生物学等领域。
基因克隆的方法通常包括以下几个步骤：1. DNA片段的提取首先，需要从源组织或生物体中提取出含有目标基因的DNA片段。
这可以通过使用化学物质或机械方法来破坏细胞壁和细胞膜来完成。
然后，可以使用酶切（酶切），即将DNA 分子切割为多个部分，以获取需要的DNA片段。
接下来，需要将目标基因片段插入到载体DNA中，这种DNA通常来自细菌或病毒。
这些载体通常被称为质粒，由于它们可以独立地复制和转移到不同的生物体中，因此它们是进行基因克隆的理想选择。
这个过程的关键是要使用酶切和酶连反应将基因片段和质粒DNA连成一体。
3. 转化完成DNA插入之后，需要将质粒DNA插入到目标生物体中。
这个过程通常被称为转化。
质粒DNA可以通过添加化学物质，电击或热冲击等方法，使其进入目标细胞中。
如果转化成功，则目标细胞将含有与原细胞相同的基因，并且可以将该基因传递给其细胞后代。
4. 克隆筛选最后，需要进行克隆筛选，以确定哪些细胞包含所需的质粒和基因。
可以通过对转化沿用枝接派系进行筛选，这些派系通常包含一些荧光标记或抗生素耐受基因。
这样，只要细胞包含标记，就可以通过添加抗生素来杀死不含标记的细胞，从而将所需的基因克隆出来。
在生物技术的发展中，基因克隆的方法已经得到了广泛应用。
它可以用来生产抗生素、激素和其他药物，也可以用来改变植物和动物的遗传特征，以增加其产量或提高其抗病能力。
基因克隆还可以用来研究基因功能，发现新的基因或揭示遗传疾病的机制。
但是，由于基因克隆涉及到对生命体系进行干预和修改，因此我们必须注意其潜在的风险和不良后果，并确保其在道德和法律方面的合规性和可行性。
DNA克隆技术及其应用
DNA克隆技术及其应用人的基因密度非常高，拥有数以亿计碱基对。
在庞大的DNA序列中寻找特定的基因或序列是一项困难的任务。
为了更好地了解生物基因组信息、功能和机制，我们需要开发一种方法来释析基因的表达方式。
DNA克隆技术的应用为生物基因组学领域提供了重要工具。
DNA克隆和腺病毒、普通病毒、质粒、噬菌体和一些自然的成核病毒等相关核酸分子的短片段是有关联的。
它允许研究者将特定区域的DNA片段独立地克隆成为另外一个载体，在不同的环境中有效地表达和研究这些片段。
然而，对于使用DNA克隆技术的科学家和研究者来说，最大的挑战是限制切割酶酶切位点的选择和目标基因序列的完整性。
为了避免这些问题，人们使用了大量的分子生物学技术和方法来帮助解决这些技术中存在的难点。
例如，使用PCR 技术放大DNA片段，或者基于RNA假装，诱导基因在外源正常神经-神经肌肉节上进行表达，以推动研究。
DNA克隆技术是一项复杂的工程，利用了分子生物学原理。
它首先涉及到DNA序列的分离和提纯，然后通过DNA限制酶对目标基因序列进行，并将其插入到含有不同选择性标记的载体向量中。
接下来，在游离的核糖核酸分子（RNA）的帮助下，利用DNA重组技术用酶来将目标基因序列进行拼接。
这种技术对于人工制备DNA样本、DNA病毒和某些腺病毒的克隆，都具有广泛的应用。
DNA克隆技术对现代医学领域有着重要的应用。
例如，一些激素、抗体、疫苗、药物和基因疗法的开发都依赖于DNA克隆。
基因治疗的目的在于通过将正常DNA插入没有功能的细胞中，能够代替细胞中有缺陷或错误的DNA，从而实现治疗。
此外，DNA克隆技术还可以应用于农业和环境研究领域。
在农业生产中，科学家们利用这种方法克隆出有效的抗抗性基因，从而增加作物对病原体的抵抗力。
在环境研究中，对细菌、植物、动物和微生物的分析需要大量的DNA克隆技术，以便对它们的基因组成和特征进行研究。
总之，DNA克隆技术及其应用是现代生物科学和医学的重要组成部分。
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人类基因组计划的主要内容：1、阐明人类基因组序列，发现所有人类基因并搞清其在染色体上的位置。
2、破译人类全部遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面地认识自我。
3、解码生命、了解生命的起源和生命体生长发育规律。
4、认识种属之间和个体之间存在差异的起因、认识疾病产生的机制以及长寿与衰老等生命现象，为疾病的诊治提供科学依据。
引物设计的原则：1、引物的长度以15-30bp为宜。
2、（G+C）的含量45-55%，引物的Tm值可用共识计算：﹛Tm=4（G+C）+2（A+T）﹜。
3、避免两引物间的互补，以免形成引物二聚体。
4、引物一定要与模版DNA配对。
5、引物必须经GenBank查询后，证实没有与其他非目的DNA有高度互补，才能使用。
蛋白质一、二、三、四级结构及其相应功能：1、一级结构：多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置称为蛋白质的一级结构(primary structure)。
这是蛋白质最基本的结构，它内寓着决定蛋白质高级结构和生物功能的信息。
2、二级结构：指肽链主链不同区段通过自身的相互作用，形成氢键，沿某一主轴盘旋折叠而形成的局部空间结构，是蛋白质结构的构象单元。
主要有以下类型：（1）α－螺旋（2）β－折叠（3）β－转角（4）无规则卷曲。
3、三级结构：多肽键在二级结构的基础上，通过侧链基团的相互作用进一步卷曲折叠，借助次级键维系使α－螺旋、β－折叠片、β－转角等二级结构相互配置而形成特定的构象。
三级结构的形成使肽链中所有的原子都达到空间上的重新排布。
4、四级结构：指由相同或不同的称作亚基（subunit）的亚单位按照一定排布方式聚合而成的蛋白质结构，维持四级结构稳定的作用力是疏水键、离子键、氢键、范得华力。
亚基本身都具有球状三级结构，一般只包含一条多肽链，也有的由二条或二条以上由二硫键连接的肽链组成。
琼脂糖凝胶电泳的原理：在一定PH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内他们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。
在当低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭(EB)染色，在紫外光下至少可以检出1-10mg的DNA条带，从而可以确定DNA 片段在凝胶中的位置。
（特点：电泳支持介质：琼脂糖；琼脂糖凝胶电泳分离DNA 片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA 片段，其分辨率比聚丙烯酰胺凝胶低，但制备容易，分离范围广，尤其适当分离大片段DNA。
）转录的机制：1、起始，RNA聚合酶是负责转录的酶，它结合到被称为启动子的特定DNA序列上以起始RNA的合成。
这些序列位于蛋白质编码区的上游(5'端)，含有一些短而保守的DNA序列，在不同启动子中这些序列是相同的。
RNA聚合酶结合到双链DNA的启动子序列上，引起DNA局部解旋。
合成第一个RNA碱基的位置称为起始位点，其位置称为+1。
2、延伸.RNA聚合酶沿着DNA链移动，顺次合成RNA链。
DNA在移动的聚合酶抵达之前解旋，在其经过之后又恢复成双螺旋。
3、终止，RNA聚合酶识别终止子，导致不再有新的核苷酸插入，该序列通常是发夹结构。
蛋白质翻译机制：1、起始①30S亚基与mRNA的结合:在一定Mg2+的生理条件下,核糖体亚基很容易缔合,所以70S核糖体在IF3作用下解离,然后再形成30S-IF3复合物,接着与mRNA结合.②30S-IF3-mRNA与起始tRNA结合:在IF1和IF2的作用下和GTP的参与下,30S-IF3-mRNA与起始fMet-tRNAf结合,形成30S起始复合物30S-mRNA-fMet-tRNAf-GTP-IF1-IF2,并释放出IF3.③70S起始复合物的形成:50S的加入和GTP的水解,形成70S起始复合物70S-mRNA-fMet-tRNAf,释放出IF1和IF2.fMet-tRNAf位于核糖体的P位上.2、延伸①aa-tRNA与核糖体结合:在氨酰tRNA合成酶催化下,氨基酸被专一的tRNA所携带,生成aa-tRNA在EF-Tu 和GTP作用下强烈促进aa-tRNA与核糖体A位结合.②肽键形成:aa-tRNA结合于核糖体A位后,在肽基转移酶催化下,将P位tRNA上的肽基通过其羧基与A位tRNA上氨基酸的α-氨基连接,形成肽键.③移位:肽键形成后,核糖体处在前移位状态,这时占领P位的是去酰化tRNA,A位为肽基tRNA,然后进行移位,核糖体与mRNA相对移动一个密码子距离,肽基tRNA从A位移至P位,去酰化tRNA离开P位,移位被EF-G催化,随之GTP水解,并导致EF-G释放.3、终止：肽链延伸过程中,当终止密码子UAA,UGA,UAG出现在核糖体的A位时,没有相应的aa-tRNA 可以与之结合,而释放因子在GTP存在下,却能识别这些密码子并与之结合,激活肽基转移酶,把P位上的肽基转移至水分子,即水解P位上多肽与tRNA之间的键,接着新生的肽链和tRNA从核糖体上释放,完成多肽链的合成.释放因子RF具有GTPase的活力,它催化GTP水解,使肽链与核糖体脱离.一、病毒DNA的提取1.CTAB法提取。
2.采用UNIQ-10柱式病毒DNA抽提试剂盒：具体方法按照试剂盒上所示操作进行。
二、RT-PCR：以细胞内总RNA或mRNA为模板，采用特异性引物、olig-dT或随机引物，在逆转录酶的作用下反转录成cDNA。
反应体系：RNA，5×AMV Buffer，10 mmol each dNTPs，R:O，AMV Rnae 三、PCR扩增：反转录的cRNA进行PBR扩增，PCR扩增的原理为：变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA 。
退火：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。
延伸：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）及Mg2+存在条件下，5’→3’的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。
目标产物延伸长度为1700bp.其反应体系：10×PCR buffer ，dNTP mix ，上游引物，下游引物2，DNA模板，Taq 酶，用量以不同需要和试剂的不同而不同。
四、电泳鉴定看是否扩增出阳性产物五、PCR产物的回收纯化：乙二醇法纯化或直接用商品化纯化试剂六、连接：PMD18-T载体质粒的制备，利用相应的限制性内切酶切除粘性末端用T4DNA连接酶将目的基因和载体连接新的DNA分子其原理为T4DNA可以修复双链DNA骨架的断裂，催化限制酶酶解反应的逆反应，使退火的互补黏性末端共价连接在一起，形成新的DNA分子。
反应体系：Sloution I，PCR回收产物，pMD18-T混匀后瞬时离心，16℃连接2-6 h，连接产物直接转化或-20℃保存备用七、感受态细胞制备和转化：质粒通过转入具有特定遗传性状的大肠杆菌菌株而被克隆。
用Ca2+处理大肠杆菌细胞，可使之成为易接受质粒DNA的感受态细胞。
在感受态细胞中加入L连接产物，混匀后于冰浴中作用30 min。
42 ℃热冲击90 s，迅速转入冰浴中维持3-5 min。
在LB液体培养基进行振荡培养一小时左右，离心取余下的培养基重悬菌泥。
将重悬菌液均匀涂布于含Amp+及X-Gal和IPTG的平板上，待吸收完全后将平板倒置，于37℃培养过夜。
将这样的细胞涂布于琼脂平板，会长出单克隆或多个克隆。
此步骤目的是让目的基因整合到载体细胞中并大量培养筛选。
筛选方法：抗性筛选，α-互补现象筛选再挑菌培养：用高压过的牙签挑取平板上生长良好的单个菌落放入培养液中。
选取一部分菌液进行菌液PCR，进一步筛选鉴定阳性菌落。
将阳性菌进行扩大培养或保存。
七质粒的抽取和酶切鉴定：将扩大培养的阳性菌抽提质粒携有目的质粒的大肠杆菌菌株在液体培养基（LB）增殖至稳定期(过夜培养)后离心取菌体沉淀。
利用碱裂解法进行提取。
将提好的质粒进行酶切鉴定。
八、鉴定阳性的克隆产物送生物公司测序亚克隆：是克隆实验中最简单的一种，即将已克隆的DNA片段从一载体向另一载体的转移。
密码子：mRNA上每3个相邻的核苷酸编码蛋白质多肽链中的一个氨基酸，这三个核苷酸就称为一个密码子或三联体密码子。
内含子：断裂基因中外显子的间插序列，可参与前体RNA的转录，但其转录的RNA序列于转录后的加工中被切除，不包括于成熟的RNA分子中。
同尾酶：有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产生相同的粘性末端，这类限制酶称为同尾酶。
星号活性：在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。
氨基酸等电点：当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点。
基因：DNA分子中有特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的功能单位，是合成有功能的蛋白质多肽必需的全部核酸序列。
DNA克隆：通过生物体基因组DNA片段作为自主复制载体的一部分进行独立复制的方式，使对该片段的分离及操作简单化。
基因组：就是一个物种中所有基因的整体组成，或者是一种生物所有染色体上的遗传物质。
C值：通常是一种生物单倍体基因组DNA的总量。
基因文库：是来自某生物的不同DNA序列的总集，这些DNA都被克隆进了载体，以便于纯化、贮存和分析。
DNA文库：由基因组或cDNA的一套随即克隆片段构成，其中每个片段连在一个单独的载体分子上。
基因组文库：存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA集合。
cDNA文库：用细胞总mRNA制备全套双链cDNA后建立的基因文库。
微体：溶酶体、过氧化物酶体和乙醛酸循环体合成微体。
同裂酶：有些来源不同的限制酶却识别和切割相同的序列，这类限制酶称为同裂酶。
单位酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在20ul反应液中反应1小时，使1ul DNA 完全消化所需的酶量。
黏末端：具有突出末端的限制性酶解反应的产物的末端称为黏末端。
YAC（酵母人工染色体）：是将酵母染色体中为复制与分离所需序列与大片段目的DNA连接而构成的，可克隆外源片段的长度可大于1Mb。
BAC（细菌人工染色体）：在大肠杆菌F银子的基础上发展起来的，能容纳长达100-360kb的插入序列。
其优点是：遗传稳定、嵌合及重组现象少；以大肠杆菌为宿主，转化率高；在大肠杆菌宿主中生长迅速；可用标准质粒小量制备技术纯化。
质粒：是位于细胞质中的一类独立于染色体的可自主复制的遗传成分，可赋予宿主细胞一定的生物性状。
核酸分子杂交：不同来源的DNA单链或单链DNA与RNA之间的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核酸分子杂交。
黏粒：一类由人工构建的含有入DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。