测定葡萄糖氧化酶活力的一种简便方法

测定葡萄糖氧化酶活力的一种简便方法

周建芹 , 陈韶华 , 王剑文

( 1. 苏州大学医学部药学院 , 江苏苏州215123; 2. 苏州大学医学部

实验中心 , 江苏苏州215123 )

摘 : 利用靛蓝胭脂红褪色分光光度法测定葡萄糖氧化酶催化葡萄糖溶液产

生的过氧化氢浓度 , 经过标要准曲线转换得到葡萄糖氧化酶的活力。研究

了缓冲液 pH 值、水浴温度、靛蓝胭脂红用量等对葡萄糖氧化酶活力测定的影响。结果表明 : 利用靛蓝胭脂红褪色分光光度法测定葡萄糖氧化酶活力时 , 缓冲液最佳 pH 值为 4、最佳水浴温度为100 ℃、靛蓝胭脂红最佳用量为 1.

3 mL。此方法的重现性较好 , 反应系统较稳定。葡萄糖氧化酶在自然界中普

遍存在 , 在食品、医药和发酵等工业生产及分析检测中用途广泛 , 是高等院校生物化学、酶学和酶工程等相关实验课程中经常选用的一种重要的模式酶。在有氧情况下 , 葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化产生葡萄糖酸和

过氧化氢 : 葡萄糖 + O2 葡萄糖酸 + H2 O2 。测定葡萄糖氧化酶活力

常用的方法有 2 种。一种是滴定法 , 即用碱滴定葡萄糖氧化酶催化葡萄糖

产生的葡萄糖酸 , 这种方法误差比较大 , 灵敏度比较低 , 尤其是葡萄糖含

量比较低时。另一种是利用葡萄糖氧化酶—辣根过氧化物酶—苯胺衍生

物或染料隐性体偶联反应体系测定。过氧化物酶在有氧存在时 , 催化葡萄糖氧化、生成的过氧化氢分解 , 分解出的氧又将苯胺衍生物或染料隐性体

(如邻 - 联二茴香胺 ) 氧化变成红色或棕色物质 , 颜色深浅与葡萄糖氧化酶活性成线性关系。这种方法非常灵敏 , 但也存在显色物质不稳定、在 1 m in内有明显褪色、数据重复性不好等不足 , 而且因为要与辣根过氧化物酶

联用 , 因此这个方法比较昂贵 , 增加了测定成本。葡萄糖氧化酶活力测定的困难限制了其在学生实验及课外科研项目中的应用 , 因此寻找一种廉价、简便并且灵敏度高的活力测定方法很有意义。本研究采用靛蓝胭脂红褪色法测定葡萄糖氧化酶活力。靛蓝胭脂红褪色法测定葡萄糖氧化酶活力的机理

是 : 葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化产生的过氧化氢在一定 pH 值的缓冲溶液中和加热条件下 , 能使靛蓝胭脂红发生褪色反应 , 并且其反应速度在一定范围内和过氧化氢浓度成正比 , 据此测定出产生的过氧化氢的量 , 进而

计算出葡萄糖氧化酶活力。首先利用一系列浓度的过氧化氢标准溶液与靛蓝胭脂红反应 , 在 615 nm 波长处测定吸光度 , 建立标准曲线。然后 , 作葡萄糖氧化酶催化葡萄糖反应 , 取反应液 , 研究温度、 pH 值和靛蓝胭脂红用量等条件对酶活力测定的影响 , 并对本方法的可重复性等进行验证。

关键词 : 葡萄糖氧化酶 ; 活力 ; 褪色中图分类号 : R331 文献标识

码 : B 文章编号 : 1002 2 4956 ( 2008 ) 12 2 0058 2 03

1 实验材料与仪器

材料 : 葡萄糖氧化酶 ( EC 1. 1. 3. 4. , 来源于 A spergillus niger, Worthington ) 、葡萄糖、靛蓝胭脂红、 30%过氧化氢 , 冰乙酸、乙酸钠等试剂为生物纯或分析纯。仪器 : 可见光分光光度计、 JA5003N 电子天平和 JC - SY型数显恒温水浴锅。

图 1 缓冲溶液 pH 值对酶活力测定的影响

从图 1 可以看出 , 在本试验的缓冲溶液 pH 值变化范围内 , 酶活力呈现出典型的钟形曲线 , 且 pH 值为 4 时葡萄糖氧化酶的活力最大 , 即缓冲溶液pH 值为 4 时 , 葡萄糖氧化酶催化产生的过氧化氢使靛蓝胭脂红发生褪色反应的速度最快。因此 , 本方法测定 ( GOD ) 活力时采用 pH值为 4的乙酸

乙酸钠缓冲溶液。

2 实验方法

2. 1 标准曲线的绘制

准确吸取 0、 1、 2、 3、 4、 5、 6 mL 过氧化氢 - 1 标准溶液 ( 12mg ・L ) , 分别置于 25 mL 比色管 - 3 中 , 加入 1. 3mL靛蓝胭脂红溶液 ( 1.

0 × 10 mol ・ - 1 L ) 和 3. 0 mL 乙酸 - 乙酸钠缓冲液 , 再加入蒸馏水稀释至 25 mL , 于沸水浴中加热 13 m in后 , 用流水冷却比色管 5 m in; 用 1 cm 比色皿 , 以蒸馏水作参比 , 在波长 615 nm 处测定其吸光

度 A。以 lg (A 0 /A )对过氧化氢浓度作图 , 得标准曲线。标准曲线线性回归方程为 lg (A0 /A ) = 0. 0053CH2O2 + 0.0039, 相关系数为 0. 99, 根据此回归方程 , 可由 lg (A 0 /A )求出相应的过氧化氢的浓度。

2. 2 试验方法及步骤

取 1 mL 的 1 mg /mL 葡萄糖氧化酶和 4 mL 的 0. 2 mol/L 葡萄糖溶液于试管中 , 于37 ℃ 条件下反应 10 m in, 终止反应 , 得酶促反应液。在 25 mL 具塞比色管中 , 分别加入一定 pH 值的乙酸 - 乙酸钠缓冲溶液 3. 0 mL 和一定体积的靛红溶液 , 再加入 1 mL 的上述反应液 , 稀释至刻度 , 于一定温度水浴中加热 13 m in 后 , 取出用流水冷却 5 m in, 终止反应 ; 用 1 cm 比色皿 , 在波长 615 nm 处 , 以蒸馏水作参比 , 测定其吸光度 A。酶活力单位规定为: 37 ℃ 条件下 , 1 m in 内催化葡萄糖反应产生 1

μg 过氧化氢所需的酶量为 1U。

3 实验结果与讨论

3. 1 缓冲溶液 pH 值对酶活力测定的影响

水浴温度100 ℃、靛蓝胭脂红用量 1. 3 mL 等条件保持不变 , 缓冲溶液 pH 值在 3. 5 ～5. 6 之间变化 , 研究缓冲溶液 pH 值对葡萄糖氧

化酶 ( GOD ) 活力测定的影响 , 结果如图 1 所示。

3. 2

水浴温度对酶活力测定的影响采用 pH 值为 4 的缓冲溶液 , 靛蓝胭脂红用量1. 3 mL 保持不变 , 水浴温度在 70 ～100 ℃ 之间变化 , 研究水浴温度对( GOD ) 活力测定的影响 , 结果如图 2 所示。

图 2 水浴温度对酶活力测定的影响

从图 2 可以看出 , 在低温下 , 反应难以进行 , 加热能启动过氧化氢与靛蓝

胭脂红发生褪色反应 , 在100 ℃ 时葡萄糖氧化酶表现出的活力最大。所以

本方法测定 GOD 活力的最佳水浴温度为100 ℃。

3. 3 靛蓝胭脂红用量对酶活力测定的影响

水浴温度100 ℃、缓冲溶液 pH 值为 4 等条件保持不变 , 靛蓝胭脂红用量

在 1. 1 ～1. 6 mL 之间变化 , 研究靛蓝胭脂红用量对 GOD 活力测定的影

响 , 结果如图 3 所示。

从图 4 可以看出 , 靛蓝胭脂红的褪色反应通过流水冷却终止后 , 随放置时间延长 , 酶活力小幅度 ( 2% ) 缓慢增加 , 说明褪色反应仍在缓慢进行 , 所以流水冷却终止反应后 , 应尽量在短时间内完成测定比较好。

表 1 平行实验

试管编号酶活力

/ (U ・mL - 1 ) 29. 78 29. 41 29. 32 29. 77 26. 03 26. 30 1 2 3 4 5 6

图 3

从图 3 可以看出 , 在 1. 1 ～1. 6 mL 范围内 , 随着靛蓝胭脂红用量的增

加 , 葡萄糖氧化酶活力呈现先上升再下降的趋势 , 且在靛蓝胭脂红用量为 1.

3 mL 时 GOD 活力最大 , 所以最佳的靛蓝胭脂红用量为 1. 3 mL。

3. 4 冷却后放置时间对酶活力测定的影响

在 1 支比色管中加入 1 mL 反应液、 1. 3 mL 靛蓝胭脂红溶液和 pH 值为4. 0 的 HAc - NaAc 缓冲液 3 mL , 加蒸馏水稀释至 25 mL 刻度 , 于沸水

浴中加热 13 m in, 终止褪色反应后 , 每隔 5 m in, 在615 nm 处测定其吸

光度 A , 进行稳定性实验 , 结果