非综合征型耳聋患者mtDNA A1555G异质性突变比例与临床表型的关系

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中华耳科学杂志 2 0 0 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 年第 6 卷第 4 期
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� 遗 传 性 耳 聋 专 辑�
非综合征型耳聋患者
D N A A 1 555G 异 质 性 突 变
杨滨 江凌 欧 启水
35 0 0 0 5 )
比例与临床表型的关系
程 祖建
福建医科大学附属第一医院检验科 福建医科大学基因诊断研究室 福建医科大学检验系 (福州
� � � � � � � � � � � � � 摘要 � � 目的 � � 定量检测非综合征型耳聋患者线粒体 D N A ( D NA, D N A ) 1 5 55 突变型 /野生型 的拷贝数 , 探讨突变型/野生型比例与临床表型之间的关 系 . 方法 建立实 时定量 P C R 技术和扩增阻滞 突变系统 � � � � � � � � � � � � � � � � � � ( R � PC R 和 A , R T -A R M S- P C R 系统) 对含突变型和野生型 D N A 1 5 55 位点的拷贝数进行定量检测并计算比例 . 共检测散发组 1 2 例 , 家系组 7 例异质性突变患者 , 结合耳 聋患者的临床资料 , 分析突变型与野生型的比例与耳聋严重程度的关系 . 结果 散发组 D N A A 1 55 5G 异质性突 � � � 变的患者中 , � 突变型 D N A 所占的比例与耳聋轻重程度相关 � � ( = 0. 7 71 , P = 0 . 0 0 3 ) 家系组患者中 , 突变型 D � N A 所占 的比例亦与耳聋轻重程度相关 � � � � ( = 0. 850 , P = 0 . 0 1 5 ) . 结论 突变 型 D N A 占所有 D N A 的比例与耳 聋的严重程度密切相关 , 是非综合征型耳聋临床表型多样性的分子基础 . � � � 关 键词 非 综合征 型耳 聋 线粒 体 D N A 突变 PC R ) 系统 拷贝数 临床表型 76 4. 4 , 3 94 . 1 12, 596 �文献标识码 � A � 文章编号 � 16 7 2 -2922 �200 � �0�-0381-04 � 中图分类号 � 实 时定 量 P C R 技术 和扩 增阻 滞突 变 (R T -A R M S-
关键词非综合征型耳聋线粒体突变实时定量pc系统拷贝数临床表型94112596文章编号16chenjiangnaa1555g突变与氨基糖甙类药物naa1555g是导致nsh常见的突变形式其突变性质有同质性和异质性两种naa1555g突变的耳聋患者其耳聋的严重程度各不相同有的听力完全正常而有的却表现出轻度到重度程度不等的听力下降近年来随着研究的深入dna的拷贝数被认为与线粒体的功能和生物学性状密切相关与细胞的功能和氧化磷酸化活性有关提示dna的质和量的改变可能是线粒体耳聋临床表型多样性的分子生物学和遗传学基础dna的比例与nshl患者耳聋严重程度之间的关系pcrrt技术建立rtarmpcr系统定量检测突变型和野生型dna的比例并结合耳聋患者的临床资料进行分析现报道如下研究对象散发组为福建省某聋哑学校学生及本院门诊患均无亲缘关系其中男性148女性197遗传性耳聋家系对所有患者进行调查采集病包括耳聋的发病年龄诱因进展情况用药史及家属史等经本院测听室纯音听阈测试障碍残疾和残废的国际分类1980的听力损失分级标准判定耳聋程度根据文献的方法筛选出散发组12例家系组7例异质性突变患者部分患者的酶切图和测序图见图dna提取取待检者静脉血edta乙二胺四乙酸提取dna按使用说明操作引物根据arm的基本原理结合荧光定量pcr的特点应用e条为共同引物p11另2条分别为对应野生型和突变型的引物p22p23为了增加反应的特异性在p22和p23的引物3端增加2个错配碱基加下划线序列如下p11标准品的制备pcr扩增含野生型和突变型的片段扩增产物与gem体连接后转入大肠杆菌dh5碱裂解法大量制备质粒dna在分光光度计上进行dna精确定量对质粒dna进行10dna的实时定量pcrpcr反应体系和条件20ixudg公司10样品dna06l引物p11p22p23在abi7000荧光定量pcr616040个循环并按仪器设置从60开始进行融解曲线分析突变型模板dna的百分比依据野生型和突变型模板dna的量计算突变型模板的百分比统计学分析结合非综合征型耳聋患者的临床资料和贝数与耳聋严重程度的关系采用spss100统计软件包的spcr产物的限制性内切酶异质性突变pcr产物片段测序的结果图中箭头所示和野生型a两个峰混合