补肾益智汤对老年痴呆模型大鼠治疗作用的实验研究

补肾益智汤对老年痴呆模型大鼠治疗作用的实验研究（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的观察补肾益智汤对老年痴呆模型大鼠学习记忆和超氧化物歧化酶(SOD) 、丙二醛（ MDA）的影响。

方法颈背部皮下注射D-半乳糖及侧脑室注射Aβ25-35制作老年痴呆大鼠模型, 以低5［g/（kg·d）］、中10［g/（kg·d）］、高20［g/（kg·d）］3个剂量的补肾益智汤灌胃治疗，通过八臂迷宫测试各组大鼠的学习记忆能力，采用比色法测定大鼠血清中SOD活力,MDA含量。

结果高剂量补肾益智汤能显著减少大鼠参考记忆错误（RME）（P＜0.05），对工作记忆错误（WME）有降低趋势，但无显著性差异；高剂量补肾益智汤能显著提高大鼠血清中SOD活力 (P0.01); 中、高剂量补肾益智汤能显著降低大鼠血清中MDA含量 (P0.01)。

结论通过降低自由基水平可能是补肾益智汤治疗老年痴呆模型大鼠的机理之一。

【关键词】补肾益智汤老年痴呆模型超氧化物歧化酶丙二醛学习记忆大鼠Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of BushenYizhi decoction on learning memory,superoxide dismutase（SOD）and maleic dialdehyde（MDA） in Alzheimer’s disease rats. MethodsThe AD model of mice was established by the injection of Aβ25-35 into the lateral cerebral ventricle and was given D—galactose, sc . low, middle, high(5,10,20g/kg·d) doses of BushenYizhi decoction were orally administered.The learning and memory ability of the AD model rats were detected by 8-arm radial maze test. The activity of SOD and the MDA in serum were examined by colorimetric method.ResultsHigh dose of BushenYizhi decoction could decrease reference memory error(RME) in AD rats ( P＜0.05）,reduce working memory error(WME),and improve the activity of SOD (P0.01). Middle and high doses of BushenYizhi decoction could decrease the content of MDA(P0.01).ConclusionBy reducing the level of free radicals may be the mechanisms in treating Alzheimer’s rats with Bushenyizhi decoction.Key words：BushenYizhi decoction； Alzheimer’; sdisease model； SOD；MDA； Learning and memory； Rats老年痴呆即“阿尔茨海默病”(Alzheimer’s Disease ，AD) 是一种进行性神经退行性疾病,伴有认知及行为障碍,多发生在中、老年人群中。

随着人口老龄化的加剧,AD 的发病率不断升高,给社会和患者家庭带来沉重负担。

因此,如何防治AD 日益成为研究热点。

由于AD 的病因病机尚未明确,所以目前对该病尚无特效药物。

中医学具有悠久的历史,其丰富的药物种类为AD 治疗药物筛选提供了一个庞大的资源库。

补肾益智汤主要由熟地、生龟板、人参、山药、黄精、牛脊髓、山茱萸、云苓、丹皮、泽泻组成，该方具有滋补而不留邪、降泻而不伤正，以补为主，泄中寓补的特点，体现了通过调节机体整体生理机能的平衡而发挥治疗作用的科学指导思想。

组方以补肾阴为基础使肾精脑髓有源,据《素问·阴阳应象大论》：“形不足者,温之以气;精不足者,补之以味”,“阳为气,阴为味”,故而该方主要以补肾阴为主。

又因“人始生,先成精,精成而脑髓生”,可知脑为阴津物质所成,所以补肾填精,肾精充盛,脑髓得养,才能使智有生。

该方已运用临床多年,疗效显著。

本次实验通过观察补肾益智汤对老年痴呆模型大鼠学习记忆、血清中超氧化物歧化酶、丙二醛的影响，以对补肾益智汤用于AD药效学作用作出科学评价。

1 材料1.1 动物Wistar大鼠，购自中国医学科学院实验动物研究所繁育场，许可证编号为SCXK（京）0089322，2004-0001。

雌雄各半共72只，体质量200～250 g。

1.2 药物和试剂补肾益智汤（熟地、生龟版、人参、山药、黄精、牛脊髓、山茱萸、云苓、丹皮、泽泻）以上药物除牛脊髓（购自食品店）外均购自山西省中医药研究院，在山西省中医药研究院中心实验室制成含生药2 g/ml的水溶液，4℃冰箱保存。

D-半乳糖：北京化工厂，批号070404，用时以无菌生理盐水配成5%溶液；尼莫地平：天津市中央药业有限公司，生产批号：070911，用时以蒸馏水配成0.075%混悬液；注射用青霉素钠；华北制药股份有限公司，批号：F0712102；Aβ25-35：美国Sigma公司，027k4797，临用前将Aβ25-35溶于无菌生理盐水中，终浓度为2 g/L，密封后置于37℃培养箱中144 h；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20081121；丙二醛（MDA）试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20080825。

1.3 仪器电热恒温水温箱：HH–W21，上海医用恒温设备厂；旋涡混合器：FZQ—2，江苏泰县医疗器械厂制造；离心机: KDC–1044，科大创新股份有限公司中佳分公司；721分光光度计:上海第三分析仪器厂；脑立体定位仪:国营西北光学仪器厂；生化培养箱: LRH–150B，广东省医疗器械厂；电子天平: BP-310S，德国塞多利斯；八臂迷宫分析测试仪：RM–200，成都泰盟科技有限公司。

2 方法2.1 老年痴呆模型制备大鼠颈背部皮下注射D-半乳糖50 mg/(kg.d) ［1］,连续6周,第7周侧脑室注射Aβ25-35［2］。

大鼠戊巴比妥钠（45 mg/kg）麻醉后，固定于脑立体定位仪上，头顶部正中切口，暴露前囟，参照大鼠脑立体定位图谱［3］，以前囟为参照点，在前囟点后1.3 mm,旁开2 mm将用5 ml注射针头钻一小孔，垂直插入10 μl微量注射器，深度4.0 mm（达侧脑室），缓慢注射5 μl 聚集态的Aβ25-35,注射时间持续10 min,留针5 min,注射完毕后，局部撒复方新诺明药粉防止感染，缝合头皮，术后肌肉注射青霉素每只5万单位，连续4 d。

对照组颈背部皮下注射等量生理盐水，第7周侧脑室注射无菌生理盐水，操作同前。

侧脑室注射后，对照组存活11只大鼠，侧脑室注射Aβ25-35后大鼠共存活56只。

2.2 动物分组及给药侧脑室注射后，除对照组外，造模动物随机分为痴呆模型对照组（以下简称模型对照组）、尼莫地平片阳性对照组（以下简称尼莫地平组，15 mg/kg）、补肾益智汤低剂量组（5 g/kg）、补肾益智汤中剂量组（10 g/kg）、补肾益智汤高剂量组（20 g/kg）。

术后第2天开始灌胃，按20 ml/kg灌胃量计算，1次/d，对照组和模型组给予等量蒸馏水，连续6周。

2.3 八臂迷宫行为学测定灌胃第6周开始八臂迷宫训练［4］，放射状八臂（四臂放食物）是一种经典的测定动物空间记忆的方法，它可以同时检测动物的参考记忆和工作记忆。

迷宫中央区直径30cm,向四周以等角度和等长度延伸八条臂。

训练前大鼠先在迷宫中适应1 d，适应时3至4只大鼠同时置于迷宫中，自由活动和摄取食物10 min。

适应后进行每1次的训练。

每次训练时，八臂中只有四臂放置了食物（分别为3，5，6和8臂），整个实验过程均维持此顺序。

大鼠放在迷宫中央区，此时中央区四周用门关住15 s将门打开，大鼠可选择进入任意一臂，以摄取食物。

大鼠进入有食物的臂且摄取了食物为1次正确选择，否则为错误选择。

记录参数为错误选择的次数。

重新进入放食物臂称为工作记忆错误（working memory error,WME）,进入不放食物臂称为参考记忆错误(reference memory error,RME)。

连续5次训练，第6次正式检测。

2.4 大鼠血清中SOD活力、MDA含量检测八臂迷宫检测后，停食12 h，乌拉坦（0.8 g/kg）腹腔注射麻醉，背位固定，沿腹正中线切开，下腔静脉取血，分离血清，按SOD试剂盒说明书测定血清超氧化物歧化酶；按MDA试剂盒说明书测定血清丙二醛。

2.5 统计分析数据用±s表示,组间比较采用t检验，P＜0.05有统计学意义。

3 结果3.1 行为学(八臂迷宫试验) 测定模型对照组大鼠参考记忆错误（RME）与对照组比较显著升高（P＜0.05），工作记忆错误（WME）与对照组比较有升高趋势，但无显著性差异。

高剂量补肾益智汤显著减少痴呆模型大鼠参考记忆错误（RME）（P＜0.05），对工作记忆错误（WME）有降低趋势，但无显著性差异，（见表1）。

结果表明补肾益智汤对老年痴呆模型大鼠学习记忆障碍有明显改善作用，能提高学习记忆力。

表1 补肾益智汤对AD大鼠学习记忆的影响（略）3.2 补肾益智汤对老年痴呆模型大鼠血清中SOD、MDA的影响模型对照组大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）活力与对照组比较有降低趋势，血清丙二醛（MDA）与对照组比较含量升高（P0.05）。

低、中剂量补肾益智汤有升高模型鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）活力的趋势，高剂量补肾益智汤显著升高模型鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）活力（P＜0.01）；低剂量补肾益智汤有降低模型鼠血清MDA 含量的趋势，中、高剂量补肾益智汤显著降低模型鼠血清MDA含量（P ＜0.01），（见表2）。

结果表明补肾益智汤能提高老年痴呆模型大鼠血清中超氧化物歧化酶活力，从而增强机体清除氧自由基的能力，减少丙二醛（MDA）的生成。

表2 补肾益智汤对AD大鼠血清中MDA、SOD 的影响（略）4 讨论研究证实D–半乳糖衰老模型具有与人类自然衰老相似的生化改变、免疫功能低下、基因表达与调控异常、细胞生长繁殖能力下降、细胞退行性改变及认知障碍［5］等表现。