分解纤维素的菌的分离与提纯.
分解纤维素霉菌的分离,纯化与鉴定
Ｔ ｅｒｓｌ ｈ ｗ ｄｔａ：１ｈ ｗ ｓｔｅｆｓ ｒｔａ ｅｆｔｒｐ ｐ ｒｗ ｓｄｃ ｍｐ ｓｄ ｂ ｎ ｌｃ ｔ ｉ，ｎ ｈ ｌ ｒｐ ｐ ｒ ｓ ｈ ｎ ｅ ｎｏｐｓｅｄ ｒ ｇ ｈ ｅｕｔ ｓｏ ｅ ｈｔ（） ａ ａｔ ｈ ｔｈ ｌ ａ ｅ ａ ｅｏ ｏｅ ｙｏ ｅｂａｋｓ ａｎ ａｄ ｔｅｆｔ ａ ｅ ｃ ａ ｇ ｄｉｔ ａｔ ｕ ｎ ｓ ｈ ｅ ｔ ｉｅ ｒ ｉｅ Ｗａ ｉ ｌ ｓ ｈ ｎｆ ２ｈ（ Ｃ ｎｙ ｅａｔ ｉ ，Ｐ ｎ ａ ｒｌ ｅ ｕ ｓ ｃ ｖ ｙｏ ｔｅ ｔ ｉ ｗ ｒ ｈｇ ｅ ｖ ｔ ｉ ， ａｈ ｄ２ ８ ｍ ／ Ｌ ‘０ｒ ｎ ｅ ａ ｒ１ ． ） Ｍ Ｃ ｅ ｚｍ ｃ ｖ ｙ Ｆ Ａ ａ ｄｎ ｔ ａ ｃｌ ｌ ｅａｔ ｉ ｆ ｈ ｒ ｎ ｅ ｉ ｓ ｉ ｆ ｅｓ ａ ｓｒ ｃ ｅ ． ４ ｆ ｇ ）３ ｉ， ｓｔ ｏ ２ ｉｔ ｕ ｌｏ ｉ ｔ ｓ ａ ｅ ｈ ｔ ｎｉ ｒｎ ｅ ８ ｍ ａ
文 献 标 识 码 ： Ａ
文章 编 号 ：０ ６ ４ １ （ ０ ０ １— １４ ０ １０ — ３ ｌ２ １ ）６０ ４ — ２
０ 引 言
表 １ 葡 萄 糖 标 准 溶 液 光 密 度测 定 结 果
纤 维 素 是 所 有植 物 的主 要 组 分 ，构成 了植 物 干 物 质 的 Ｌ ～ ／， ／２ ３ ３ 项目 空 白 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ 世 界 上 纤 维 素 的 年产 量 估 计 可 达 ４ ｌ １ｔＰｅｒ Ｂ ｇｉｅ １９ ）因 含 糖 总 量 （ ｘ ０ ０（ｉｒ ｅｕｎ ，９ ０ ， ｅ ｍ曲 Ｏ Ｏ２ ． ０４ － ０６ ． ０８ ． １０ ． １ １４ ． ２ ． １６ ． ｍＬ） ０２ ０４ － Ｏ６ ． Ｏ８ ＿ １Ｏ ． １ １４ ． ２ － １ ． ６ 而 ， 维 素是 世 界 上 最 丰 富 而 又 不 断新 生 的资 源 。 纤 有取 之不 尽 ， 之 葡 萄糖 液 （ ０ 用 不 竭 的特 点 。 而 ， 种 资 源 的 大部 分现 在 是 作 为 废 物 而被 抛 弃 掉 。 蒸 馏 水（ ２０ １８ １６ ｌ １ １Ｏ Ｏ８ ０６ ０４ 然 这 ｍＬ） ． ． ４ ＿ ． ２ ． ． ． ． ＮＳ试 剂 （ ｍＬ） １５ ． １ ． ５ １ ． ５ １５ ． １ ． ５ １５ ． １ ． ５ １ ． ５ １ ． ５ 在 自然 界 中 ， 些 “ 物 ” 通 过 纤 维 素 分 解 菌 ， 能 产 生 纤 维 素 酶 Ｄ 这 废 是 即 加 热 沸水浴中加热 ５ ｎ ｍｉ 的 微 生物 将 其 自然 分 解 的 。在 我 国纤 维 素 资 源 极 为丰 富 ， 每年 仅 农 冷 却 立 即用 流 水 冷 却 作 物秸 秆 产 量 就 高 达 ７Ｏ ｌｓ，约相 当于 我 国 北 方 草 原 年 打 草 量 的 ． Ｏｔ ｘ 定容 至 ２ ｍ ５Ｌ ５ Ｏ多 倍 ， 大部 分地 分没 有 得 到 充 分 利 用 。 在 农 村 ， 秆 主 要 用作 蒸馏水定容 绝 秸 Ｏ． Ｏ Ｏ１ ０３ ８ ０５ Ｏ７ ０９ １１ ４ ＿ｌ ．２ ．１ ．２ ．１ １３ １５ －２ ．３ 燃料、 畜禽饮料与积肥 ， 不仅利用率低 ， 还对环境造成 污染… 。因此 ， 光 密 度 （ Ｄ） 合 理 开 发 和 科 学 利 用 农 作 物 秸 秆 这 一 丰 富 的 可 再 生 资 源 是 各 国 政 零 后 ， 定 各 管 光 密度 值 ． 测 以葡 萄 糖 浓 度 为 横 坐 标 ， 密度 值 为 纵 坐 光 府 及 广 大 科 技 工 作 者 十 分 关 注 的 问题 。但 是 纤 维 素 很 难 被 分解 利 标， 得标 准 曲线 （ １ 。 图 ） 用 ， 何 将 纤 维 素 转化 为能 直 接 利 用 的资 源 和 能 源 是 摆 在 人 们 面 前 如 １ ． 纸 分解 度 的观 察 在 试 管 中加 入 酶 液 ８ｍＬ 再 加 入 ｐ ． ２滤 ６ ， Ｈ 的 一 个难 题 。 用 微 生 物 产 生 的 纤维 素酶 将 其 转 化 为人 类 所 需 的 能 利 ４４柠檬酸缓冲液 ２ｍ ， ． Ｌ 摇匀后加入滤纸条（ ｃ ｘ ｃ 和 几滴二甲 １ｍ ６ｍ） 源 、 品 和 化 工 原 料具 有重 要 的 现 实 意 义 。 年来 ， 食 近 对秸 秆 类 纤 维 素 苯 ， 于 ５℃恒 温 水 浴 中静 置 反 应 ２ 稍 加 震 动 ， 察 其 酶 活 力 置 ０ ４ｈ后 观 物 质 的利 用主 要采 用 生 物 法 ， 利 用 微 生 物 将 纤 维 素 、 纤 维 素 降 既 半 的 分解 强 度 ＋滤 纸 边缘 膨 胀 ； ＋滤 纸 整 齐膨 胀 并 下 弯 ｉ ＋ ） 纸 ｆ） （ ） ＋ ＋滤 ｆ ＋ 解 并 转 化 为茵 体 蛋 白 的方 法 。 因 此 ， 离 和 筛 选 高 酶 活 的菌 种 显 得 分 不定形 ； ＋ ＋滤纸全成糊状． 滤纸不到 ２ （ ＋） ＋ 若 ４ｈ全部分解 ， 则记下达 尤为 重 要 。 本研 究 在 广 泛 搜 集 试材 的 基 础 上 ， 分离 筛 选 到 一 株 酶 活 到 全部 被 分解 的 时 间 ． 力 高 的纤 维 素 分解 菌 。 １ ．Ｃ ． ３ ＭＣ酶 活 力 测 定 移 取 酶 液 ０５ｍＬ于 试 管 中 ， 入 含 质 ６ ． 加 １ 材 料 和 方 法 量浓 度 为 ０ ｇｃ ～Ｎ ． Ｍｃ ａ的柠檬 酸 缓 ； ５ 中液 （Ｈ ４４ ００ ｌ ）． ｐ ．、 ． ｍｏＬ１ ５ ／ ５ １１样 品来 源 样 品分别为富含纤 维素分解茵 的玉米地土壤 、 ． ｍ ， 后 在 ５ ￣水 浴 锅准 确 作 用 ３ ｉ ， 即按 Ｄ Ｓ法 测 定糖 。 Ｌ然 ０Ｃ ０ｍ ｎ后 立 Ｎ 牛粪 和 酒 糟 。 １２培养基 ① 分离平板培养基 ； ＿ ②液体培养基 。 １ ． 纸 纤 维 素 的 制 备 将 滤 纸 剪 成 １ｍ 宽 ，ｃ 长 的 滤 纸 条 。 ３滤 ｃ ６ｍ 式 中 ： 萄糖 量 — — 从 标 ； 线 上查 得 的 葡 萄糖 值 （ ｇ 葡 隹曲 ｒ ） ａ １ ． 株 的分 离 、纯 化 采 用 稀 释 涂 布 平 板 法 进 行 菌 种 的分 离 ４菌 １６４滤 纸糖 化 力 测 定 移 取 稀 释 酶 液 ４ｎ ．． ｒ Ｌ于试 管 中 ，加 入 柠
2.3 分解纤维素的微生物的分离
③实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年 积累的枯枝败叶等。
④讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋 在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认 为滤纸应该埋在土壤中多深？ 将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对 集中，实际上是人工设臵纤维素分解菌生存的 适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的 土壤中。
纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质， 植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%60%能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用， 不会大量积累。 在草食性动物等的消化道内，也共生有 分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维 素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的 能力。
人类可应用分解纤维素的微生物将秸 秆等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理 服装面料等。
二、实 验 设 计
请你根据实验流程图和提供的三个资料以及“操作 提示”，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的 实验方案。
土壤取样
选择培养
梯度稀释
将样品涂布在鉴别纤 维素分解菌的培养基上
筛选产生透 明圈的菌落
操作步骤
1、土壤取样：
①分布环境 富含纤维素的环境中 ②原因 生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素 的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从 这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环 境。
5g
NaNO3 1g
KCl 0.5g KH2PO4 0.9g Na2HPO4· 7H2O MgSO4 · 7H2O 0.5g 0.5g 1.2g 0.5g
氮源、无机盐
无机盐 生长因子、碳源、氮源 氮素、生长因子 水
酵母膏 水解酵素
溶解后，蒸馏水定容至1000mL
A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？ 是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂） B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有， 是如何进行选择的？ 有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能 分解纤维素的微生物可以大量繁殖。 C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用 提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择 培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤 维素改为葡萄糖。
分解纤维素的微生物的分离
说明：分析“纤维素分解菌的选择培养基
配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少 量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中 生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，
因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量
繁殖。
为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生 物？
在选择培养的条件下，可以使那些能够适
应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那
鉴别纤维素分解菌的培养基
培养基组成 CMC-Na 5~10g
(水溶性羧甲基纤维素钠)
提供的主要营养物质
碳源 碳源、氮源、生长因子 无机盐 碳源、生长因子 凝固剂
酵母膏 KH2PO4 土豆汁 琼脂
1g 0.25g 100mL 15g
上述物质溶解后，加蒸 馏水定容至1000mL
氢元素、氧元素
5.刚果红染色法 挑选产生透明圈的菌落，一般即为分 解纤维素的菌落。 方法一：先 培养微生物，再加入刚果红进 行颜色反应。 方法二：在 倒平板 时就加入刚果红。
NaNO3 1g KCl 0.5g KH2PO4 0.9g Na2HPO4· 7H2O MgSO4 · 7H2O
酵母膏 水解酵素
0.5g 0.5g
生长因子、碳源、氮源 氮素、生长因子
溶解后，蒸馏水定容至1000mL
水
A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？ 是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂） B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有， 是如何进行选择的？ 有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能 分解纤维素的微生物可以大量繁殖。 C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用 提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择 培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤 维素改为葡萄糖。
纤维素分解菌的分离和鉴定
纤维素降解菌类的分离与鉴定系列实验一、实验背景纤维素是植物细胞壁主要成分，属于多糖类物质，是地球上数量最大的可再生资源。
如能利用微生物将其转化为生物产品或生物能源，即可缓解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。
由于在自然界中存在着大量产纤维素酶的细菌和真菌，因而纤维素的生物降解主要依赖于微生物的作用。
从20世纪40-50年代起，针对产纤维素酶的微生物的分离筛选就进行了大量的工作，并逐步建立起一套较完整的分离筛选方法。
迄今为止有关纤维素降解菌分离筛选的研究报导已有很多，如细菌中的生孢噬纤维菌属、噬纤维菌属及纤维单胞菌属等；放线菌由于能形成芽孢，与真菌相比较耐高温和各种酸碱度，故在高温阶段放线菌对分解木质素和纤维素起着重要的作用。
主要有诺卡氏菌属、链霉菌属、芽孢杆菌属及小单胞菌属等；真菌中研究较多的是青霉属、根霉属、曲霉属等，其中以木霉属的菌株纤维素酶活较高。
以羧甲基纤维素钠和添加少量葡萄糖作为碳源，培养纤维素酶产生菌株，培养一定时间后，经刚果红染色和稀碱液固定，在菌落周围形成透明水解圈，根据透明圈的大小，快速定性鉴定纤维素酶产生菌酶活大小。
与传统纤维素酶活检测方法比较，本方法菌丝生长快，两天后菌落经染色，透明圈边缘清晰，直观性强，与酶活力成一定线性关系。
纤维素是世界上所有植物的组成部分，是地球上最为丰富且可再生的资源。
随着世界能源形势趋于恶化，环境问题日益加剧，利用纤维素生产有高附加值资源的以维持人类可持续发展的研究方向近年来逐步成为科学研究的热点方向。
利用微生物将纤维素、半纤维素降解转化为生物产品或生物能源即可缓解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。
因此分离和筛选高酶活性的菌株是有效利用纤维素物质的关键。
二、实验目的从目标试样中分离筛选出具有降解纤维素能力的菌株。
三、实验材料：1、样品的采集1）风干土样E4-1、E2-6、E2-6试样。
2）潮湿土样E4-1、E2-6、E2-6试样。
3）牛粪样品2份以上实验材料全部取自三教微生物实验室冰箱中；2、培养基1）CMC培养基2）LB培养基3）高氏1号培养基4）PDA培养基3、其他物品天平，称量纸，药匙，试管架，涂布器、摇床、烘箱、灭菌锅、瓶子、45ml无菌水（带玻璃珠），含9ml无菌水的试管，无菌培养皿，1ml及0.08ml移液管。
高中生物23分解纤维素的微生物的分离ppt课件
5.通过分离分解纤维素的微生物实验,对分解纤维素的微生物进行了初 步的筛选,这只是分离提纯的第一步。对分离的菌种作进一步鉴定还需 要进行( )。 A.发酵产纤维素酶的实验 B.提取纤维二糖的实验 C.浓缩纤维素分解菌的实验 D.提取葡萄糖的实验 解析:对纤维素分解菌的鉴定,常用的方法是对分离的菌种进行发酵产 纤维素酶的实验。 答案:A
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3.将滤纸埋在土壤中有什么作用?你认为滤纸应该埋进土壤多深? 提示:将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集,实际上是人 工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约 10 cm 的 腐殖土壤中。 4.阅读教材第 29 页旁栏中的纤维素分解菌选择培养基的成分回答 下列问题。 (1)旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基?为什么? 提示:是液体培养基,因为配方中无凝固剂。 (2)这个培养基对微生物是否具有选择作用?如果有,是如何进行选 择的? 提示:有选择作用,本配方中的唯一碳源是纤维素粉,所以只有能分 解纤维素的微生物才可以大量繁殖。
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(2)自然界中的纤维素是如何被利用的? 提示:自然界中的纤维素主要被土壤中的微生物分解利用。其余的 一部分被草食动物取食利用(实质上也离不开微生物的分解作用),一部 分作为能源被人类燃烧利用。
二、实验设计
1.实验流程:土壤取样→选择培养(来自步可省略)→梯度稀释→将样 品涂布到鉴别纤维素分解菌的选择培养基上→挑选产生透明圈的菌落。
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2.在加入刚果红的纤维素分解菌培养基中会出现透明圈,产生的透明圈 是( )。 A.刚果红与纤维素形成的复合物 B.刚果红与纤维二糖形成的复合物 C.纤维素分解后形成的葡萄糖导致的 D.以纤维素分解菌为中心形成的 解析:当纤维素被纤维素酶分解后,刚果红—纤维素复合物就无法形成, 培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。 答案:D
生物选修笔记-分解纤维素的微生物的分离汇总
生物笔记分解纤维素的微生物的分离一、纤维素酶纤维素酶是一种复合酶，至少3种组分，即G酶，Ｃx酶和葡萄糖苷酶，在三种酶的共同作用下，纤维素最终被分解成葡萄糖。
二．纤维素分解的筛选在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红——纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
湿地被誉为地球的“肾脏”受精的标志：在卵黄膜与透明带之间有2个极体的出现受精完成的标志：雌雄原核的融合DNA是遗传物质的载体。
染色体是基因的主要载体。
细胞膜的流动镶嵌模型由桑格和尼克森提出。
糖被（糖蛋白）作用：消化道和呼吸道上皮细胞表面的糖蛋白有保护和润滑作用，与细胞表面的识别有密切关系。
酶本质的探索法国巴斯德提出酿酒中的发酵是由于酵母细胞的存在。
德国李比希认为引起发酵的是酵母细胞中的某些物质，但这些物质只有在酵母细胞死亡并裂解后才能发挥作用。
德国毕希纳将酵母细胞中引起发酵的物质成为酿酶。
美国萨姆纳证明脲酶是蛋白质。
唾液pH为⒍2～⒎4 胃液的pH为0.9～1.5 小肠液pH为7.6动物体内的酶pH为6.5～8.0 植物pH为4.5～6.5植物组织培养的应用：1.快速繁殖花卉和蔬菜等作物。
2.拯救珍惜濒危物种。
3.结合基因工程培养作物新类型。
由碱基转录翻译成氨基酸，一般不考虑终止密码子。
克里克是第一个用实验证明遗传密码中3个碱基编码1个氨基酸的科学家。
基因突变在光学显微镜下是无法直接观察到的，而染色体变异却可以。
达尔文的自然选择学说揭示了生命现象的统一性是由于所有生物都有共同的祖先，生物的多样性是进化的结果。
河流：物理沉降、化学分解和微生物的分解。
人工建造“生态屏障”、“三北防护林”有效地防风阻沙。
恢复生态学主要利用的是生物群落演替理论。
植物激素：“激素杠杆”受精过程：精子穿越放射冠和透明带，进入卵黄膜，原核形成和配子结合。
分解纤维素的微生物的分离
分解纤维素的微生物的分离【导学诱思】1．纤维素是类物质，是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。
2．纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即、和，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成。
正是在这三种酶的协同作用下，纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养，同样，也可以为人类所利用。
3．在做纤维素酶分解纤维素的实验过程中，如果没有摇床，可以采用何种方法代替？4．筛选纤维素分解菌可以用法，这种方法能够通过直接对微生物进行筛选。
在土壤中取样的方法有：①；②。
5．刚果红是一种，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
6．分离分解纤维素的微生物的实验流程图如下：→→梯度稀释→→。
【课后练习】1．下面是弗来明对青霉素的早期研究过程：发现问题：在培养细菌的器具中发现一种青霉菌，在这种青霉菌的周围有没有其它细菌生存?为什么会产生这种现象?提出假设：设计实验：在液体中培养青霉菌后，考察这种液体对细菌增殖的影响。
实验结果：培养液使细菌的增殖停止。
结论：下面几项最适合作为该实验假设的是A．青霉菌与细菌之间是共生关系 B．青霉菌污染了细菌生存的环境C．青霉菌产生了对人体有益的物质D．青霉菌能产生抑制细菌增殖的物质2．培养流感病毒时，应选用A．固体培养基 B．含有多种无机盐的培养液C．活的鸡胚 D．无菌的牛肉汤4．可以使微生物细胞内蛋白质、核酸发生不可逆破坏的环境因素是A．高温 B.营养成分的变化 C.氧含量 D.温度、pH、氧的共同作用5．微生物（除病毒外）需要从外界吸收营养物质并通过代谢来维持正常的生长和繁殖。
下列有关微生物营养的说法正确的是A．乳酸菌与硝化细菌所利用的碳源物质是相同的B．微生物生长中不可缺少的一些微量的无机物称为生长因子C．培养基中的营养物质浓度越高对微生物的增殖越有利D．生长因子一般是酶或核酸的组成成分，微生物本身合成这些生长因子的能力往往不足7．菌落形成的根本原因是A．细菌有鞭毛 B．细菌能运动 C．培养基有琼脂D．子细胞成为群体8．在接种操作的过程中，不正确的是A．要将接种环灼烧灭菌 B．取下棉塞后要将试管口灼烧灭菌C．将接种环伸入试管内，先接触长菌多的部位 D．接种后还要将管口灭菌加塞9．高压蒸气灭菌的原理是A．高压使细菌DNA变性B．高压使细菌蛋白质凝固变性C．高温烫死细菌 D．高温使细菌DNA变性10．某种细菌每30分钟分裂一次，开始接种时为3个细胞，在对数生长期培养5个小时后，问此时有多少细胞？A．15 B．48 C．1024 D．307211．（10分）某同学在做微生物实验时，不小心把圆褐固氮菌和酵菌混在一起。
分解纤维素的微生物的分离
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试 设置对照的主要目的是排除实验组中非测试 因素对实验结果的影响
A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。 同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。 一是由于土样不同， 一是由于土样不同，二是由于培养基污染或培养基混有 其它氮源。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。 其它氮源。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实 验方案有两种。一种方案是可以接种其它菌种， 验方案有两种。一种方案是可以接种其它菌种，看是否 有菌落的出现，验证培养基是否混有其它氮源。 有菌落的出现，验证培养基是否混有其它氮源。另一种 方案是将A 方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培 作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。 养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。 所以，在实验中一般都应设置对照组， 所以，在实验中一般都应设置对照组，使实验更有 说服力。 说服力。
（4）细菌的计数 选取菌落数在30～300的平板进行计数。 选取菌落数在30～300的平板进行计数。在 30 的平板进行计数 同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数， 同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数， 然后求出平均值， 然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度 计算出样品中细菌的数目。 计算出样品中细菌的数目。
四、课题延伸
本课题对分解纤维素的微生物进行了 初步的筛选。但是， 初步的筛选。但是，这只是分离纯化的第 一步。为确定得到的是纤维素分解菌， 一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还 需要进行发酵产纤维素酶的实验。 需要进行发酵产纤维素酶的实验。
五、结果分析与评价
1.培养物中是否有杂菌污染以及选择 1.培养物中是否有杂菌污染以及选择 培养基是否筛选出菌落 对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长， 对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长， 说明培养基没有被杂菌污染。 说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的 菌落数目明显大于选择培养基的数目， 菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选 择培养基已筛选出一些菌落。 择培养基已筛选出一些菌落。
最新高中生物-分解纤维素的微生物的分离001 精品
课题3 分解纤维素的微生物的分离教材内容解读要点1 纤维素与纤维素酶（1）棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。
（2）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、C X酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。
要点2 纤维素分解菌的筛选（1）筛选方法刚果红染色法。
能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。
（2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。
当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
要点3 分离分解纤维素的微生物的实验流程土壤取样→选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落（1）土壤采集选择富含纤维素的环境。
（2）刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤倒平板操作、制备菌悬液、涂布平板（3）刚果红染色法种类一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。
要点4 分离分解纤维素的微生物的实验案例土壤中纤维素分解菌的分离实验的具体操作步骤如下。
1.土样采集土样采集的方法与本专题课题2类似。
土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。
如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。
2.选择培养选择培养需要的仪器有：250mL锥形瓶、无菌称量瓶、药匙、1mL和10mL的移液管、天平、摇床、温度计等。
高中生物课件23分解纤维素的微生物的分离
Part Three 纤维素分解菌的生理生
化特性
生长曲线测定
目的：了解纤维素分解菌的生长规律 方法：采用连续培养法，测定菌体生长曲线 结果：菌体生长曲线呈S型，分为迟缓期、对数生长期、稳定期和衰亡期 应用：根据生长曲线，可以预测菌体的生长趋势，为发酵生产提供指导
酶活测定
酶活测定方法：酶活测定是测定酶活性的重要方法，常用的有分光光度法、荧光法等。 酶活测定条件：酶活测定需要在一定的温度、pH值、底物浓度等条件下进行。 酶活测定结果：酶活测定的结果可以反映酶的活性，从而判断微生物的分解纤维素的能力。 酶活测定的应用：酶活测定在微生物学、生物化学、生物技术等领域有着广泛的应用。
培养基：选择 含有纤维素的
培养基
接种量：适当 增加接种量可 以提高产酶量
培养时间：适 当延长培养时 间可以提高产
酶量
搅拌速度：适 当提高搅拌速 度可以提高产
酶量
Part Four 纤维素分解菌的基因组
学研究
全基因组测序
目的：了解纤维素 分解菌的基因组结 构和功能
方法：采用二代测 序技术，如 Illumina、PacBio 等
制作啤酒：纤维素分 解菌可以分解麦芽中 的纤维素，提高啤酒 的口感和香气
制作酸奶：纤维素分 解菌可以分解牛奶中 的纤维素，提高酸奶 的口感和营养价值
制作果酒：纤维素分 解菌可以分解水果中 的纤维素，提高果酒 的口感和香气
在环境保护方面的应用
生物降解：纤维素分解菌可以降解纤维素，减少环境污染 生物能源：纤维素分解菌可以转化为生物能源，减少化石能源的消耗 生物修复：纤维素分解菌可以修复被污染的土壤和水体 生物农药：纤维素分解菌可以生产生物农药，减少化学农药的使用
结果：获得纤维素 分解菌的全基因组 序列
分解纤维素的微生物的分离(1)
透明圈 为中心的________，可以通过是否产生透明圈 ___________________________ 来筛选纤维素分解菌。
可根据是否 产生透明圈 来筛选纤维 素分解菌
练一练：
1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是 A. 纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种
B. 纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖 C. 纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁
一、基础知识
2.纤维素酶
纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包 括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和 葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二 糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
纤维素
C1酶、Cx酶 纤维二糖 葡萄糖苷酶 葡萄糖
在2支20mL的试管中，分别放入1×6cm 的滤纸条，再分别加入pH为4.8、物质的量 浓度为0.1mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液10mL、 11mL。在加入10mL缓冲液的试管中加入 1mL纤维素酶（70~80U/mL）。将二支试管 固定在50mL的锥形瓶中，在摇床上以 140r/min的转速振荡反应1h，观察结果。
维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤
维素所产生的________ 含量进行定量测定。 葡萄糖
课堂总结
分解 纤维 素的 微生 物的 分离 纤维素酶
筛选原理 实 验 设 计
种类、作用、催化 前置染色法 刚果红染色 后置染色法
富含纤维素土壤 增大分解菌含量 染色鉴别
土壤取样 选择培养 纯化培养
涂布培养
碳源（能源）
NaNO3
KCl Na2HPO4· 2O 7H KH2PO4 MgSO4 · 2O 7H 酵母膏
1g
0.5g 1.2g 0.9g 0.5g 0.5g
分解纤维素的微生物分离
选择培养
比较 项目
选 择 培 养 原理 培养基类 型 目的
分解尿素的细菌
纤维素分解菌
原 鉴理 定 培 养 现 观察菌落周围是否有着色的 观察菌落周围是否出现 基 象 环带出现来鉴定尿素分解菌 透明圈来筛选纤维素分解菌 方 刚果红染色法 脲酶检测法 法
在细菌分解尿素的化学反应 中，细菌合成的脲酶将尿素 分解成了氨，氨会使培养基 的碱性增强，pH升高。在培 养基中加入酚红指示剂，如 果pH升高指示剂会变红
甲
乙
讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是 什么？
实验分析：P27的小实验是如何构成对照的？
提示： 本实验的自变量是纤维素酶的有无， 自变量的操纵方法是：在一支试管中添加 适量（1mL）的纤维素酶溶液，在另一支 试管不添加纤维素酶，但需加入等量的缓 冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液 的pH。
3、你能否设计一个对照实验，说明选 择培养基的作用. 提示：自变量为培养基的种类，即普 通培养基和选择培养基。可用牛肉膏 蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素 改为葡萄糖。
操作：
将土样加入装有30ml选择培养基 的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上， 在一定温度下震荡培养1～2天，直至 培养液变浑浊。也可重复选择培养。
分解纤维素的微生物界中纤维素 含量最高的 天然产物；
纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植 物每年产生的纤维素超过70亿吨；分布植物的 根、茎、叶中；
一、基础知识
1.纤维素
纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高 分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。
土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把 纤维素分解为葡萄糖，然后再利用。
2、选择培养 目的：
增加纤维素分解菌的浓度，以确 保能够从样品中分离所需要的微生物。
课件12：2.3 分解纤维素的微生物的分离
【课题延伸】 本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，这只是分离纯化的 第一步。如何进一步确定得到的微生物是纤维素分解菌呢？ 通过进一步发酵培养检测其能否产生纤维素酶。 固体发酵或液体发酵 如何测定发酵产物里是否含有纤维素酶以及酶活性的高低呢？ 通过对滤纸等纤维素的分解产物进行定量的测定。 如果筛选出了纤维素分解菌，但是纤维素酶产量很低，怎么办？
培__养__基__乙__中_没__有__纤__维__素__粉__,不__会__形__成_C__R_-_纤__维_素__红__色__复__合__物__,即__使__出__现_单__菌__落__也__ 不__能__确__定__其_为__纤__维__素__分__解__菌_菌__落___。
成分
酵母膏
无机盐
淀粉
滤纸中含有大量纤维素，将滤纸埋在土壤中是人工创造了适合 纤维素分解菌生活的环境。
• 关于滤纸埋放的深度你有什么建议？ 约10cm的腐殖土壤中。
【实验设计】实验流程
• 选择培养的目的是什么？为什么需要振荡培养？
增加纤维素分解菌的浓度；让反应更加充分以及增加O2 • 选择培养是必须的吗？
不是，视样品中纤维素分解菌的浓度而定，必要时可以重复选择 培养。 • 旁栏给出的培养基配方是液体还是固体培养基？为什么？ 液体，不含琼脂。 • 这个培养基对微生物是否有选择作用？如何选择？ 有，以纤维素为最主要的碳源提供纤维素分解菌适宜生长的环境， 不能分解纤维素的微生物生长相对不易。
【实验设计】实验流程
土壤取样 选择富含纤维素的环境采集土样
选择培养
利用选择培养基增加纤维素分解菌的浓度
梯度稀释 以便获得单个的菌落
涂布平板 将样品涂布到纤维素分解菌的鉴别培养基上
挑选菌落
分解纤维素的分解菌的分离与提纯
感谢邓振山老师耐心和细致的指导
感谢大三学长、学姐给予的宝贵 意见与建议 同时感谢同学们的支持和帮助
实验方法与流程
样品采集
取文汇山落叶覆盖下 的腐殖土、延河河泥 取土壤悬浮液10ml于选 择培养基中，置摇床中 150r/min,50*C，振荡培 养6天
取已初筛培养的菌液10ml转 接到新鲜的选择培养基中按 照之前的条件继续培养2—3 天 将复筛的菌液通过划线接种到刚 果红鉴别培养基上37*C下培养2— 3天，观察透明圈
分解纤维素分解菌的分离 与提纯
指导老师： 邓振山 班 级： 11级生物科学 组 员： 陈静 李佳 刘治林 马绥斌 汪志强 冉孟成
目的意义 实验用品 实验方法与流程
实验结果
实验前景、分析与讨论 致谢
实验用品
培养基：
选择培养基：KH2PO4 1.0g; MgSO4 0.3g; NaCI 0.1g; NaNO3 2.5g; GaCI2 *6H2O0.1g; FeCI30.01g; 无菌滤纸；pH7.0 鉴别培养基：刚果红培养基（复筛培养基）： CMC-Na 3.0g (NH4)2SO4 2.0g K2HPO41.0g MgSO4﹒7H2O 0.5g 胰蛋白 胨 1.0g 琼脂 20g 刚果红 0.0692g 水 1000ml PH 7.0 --7.5 主要仪器：摇床
初筛
转接与复筛
分离与纯化
实验结果 经过ຫໍສະໝຸດ 次分离纯化，分离；接种到刚果红培养基上筛选得如下菌：(主要：细菌、放线菌）
实验前景
酶活力测定：
原理
纤维素降解为葡萄糖，通过检测葡萄 糖的量间接测定
分析与讨论
本次试验由于时间等方面条件限制，没有具
体鉴定菌株的类型，我们很清楚纤维素分解 菌是一种复合杂菌，自然状态下,纤维素的彻 底降解是在微生物体系中多种微生物长时间 相互作用的结果，微生物种群间存在着协同 作用。所以降解纤维素菌株混合优化培养是 个需要深入研究的课题。 同时纤维素降解菌 酶活的测定也是我们最为关注的研究内容。
纤维素分解细菌的分离和鉴定
纤维素分解细菌的分离和鉴定一．实验目的：1.研究低温环境下纤维素降解细菌的分离与鉴定．2.采用低温培养的方法从秸秆堆肥中筛选出3株分解纤维素的细茵。
3.通过PCR克隆这3株茵的16s rDNA并与相似菌株做比对．进一步构建分子进化树．来研究其分类情况。
4.综合其个体形态、茵落形态、生理生化特征、16S rDNA发育树构建结果等分类依据。
二．实验原理：细菌进行化能异养、短杆状、无出芽分裂、好氧、革兰氏染色阴性．无芽孢、无丝状菌体、有细胞壁且能独立生存。
应为其第二部分滑动细菌或第七部分的假单胞菌类。
由于滑动细菌能在“固体表面和汽一水交界面缓慢滑动”，故其固体菌落边缘应不整齐，且其一般形成亮色肉眼可见的子实体。
将灭菌的滤纸蘸取无菌生理盐水后贴在已凝固的平板上，用接种环蘸取土样，点样在平板滤纸上，15℃下培养10 d。
用接种环从有滤纸水解透明圈的单菌落处刮取细菌，在贴有滤纸的初筛平板上划线，计数并且观察。
三、实验仪器：1、材料试验材料为背阴处长时间堆放的秸秆堆肥表层；2、培养基：初筛培养基。
浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基”。
：啦嘞1．00 g，MgS04·7H20 0．30 g，NaCl 0．10 g，F'eCl3O．0l g，NaN03 2．50 g，CaCi2 0．10 g，琼脂18．00 g，蒸馏水l000lnl，pH值7．0～7．2．121℃灭菌20min。
无淀粉滤纸(浙江富阳纸厂)用浓度l％的醋酸浸泡一夜后用浓度2％的Na-2C03水溶液洗至中性，晾干备用。
把上述处理过的滤纸剪成直径约为8 ca的圆形滤纸片．放在干净的平皿中，用报纸包好．采用湿热的方法灭菌；3、复筛培养基。
浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基：啦P04 1．009，m．庐04‘7H200．309。
NaO 0．109．FeCl30．01g，NaN03 2．50 g．CaCl20．10g，羧甲基纤维素钠lO．00 g，琼脂18．00g，蒸馏水10130ml，pH值7．0—7．2，121℃灭菌20 min。
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主要仪器：
紫外分光光度计 高速离心机 UV-2550型 HC-2518型
主要试剂：
3,5-二硝基水杨酸 羧甲基纤维素钠
实验方法与流程 样品采集 初筛 复筛
取文汇山落叶覆盖下的腐殖土、延河河泥 将土样按浓度梯度配置成菌悬液，取1ml涂布到以羧 甲基纤维素钠为唯一碳源的平板上，与培养箱中培养， 多次平板划线分离纯化得到纯菌株 。 将初筛得到的菌株点样于刚果红培养基上进行 复筛，,培养2d。采用十字交叉取平均值法，测 量降解圈及菌落直径R1，R2。根据R1/R2的值， 筛选出比值最大的几株菌。
酶活力测定
还原糖测定为DNS试剂法540nm处有最大吸 光值，在一定范围内还原糖的量与反应液的 颜色强弱成比例关系。根据产生葡萄糖的量 间接作为酶活力衡量标准。
酶活力测定具体步骤:
标准曲线的绘制 粗酶液的提取
取10mL试管，加入 6mL1.0%羧甲基纤维 素钠溶液，再加入不 同菌株提取的粗酶液， 50℃水浴中酶解 30min，加2.0mLDNS 溶液，沸水浴8min， 取出于冷水中冷却至 室温，定容10.0mL， 在540nm下测吸光值
实验结果
经过多次分离纯化，共分离出9株菌；接种到刚果红培养基上筛选 十字交叉 法测得菌 落及降解 圈的直径 如下表：
名称 降解圈直径R1(cm) 菌落直径R2 (cm) R1/R2 ML-1 1.6 0.35 4.57 SX-2 1.2 0.4 3.00 WZ-3 1.45 0.36 4.03 WX-4 1.5 0.35 4.27 WD-5 2.1 0.3 7.00 LT-6 1.35 0.32 4.22 LH-7 1.35 0.32 4.22 BF-8 1.65 0.32 5.16 ZP-9 1.55 0.42 3.69
感谢xxx老师耐心和细致的指导
感谢xxx老师
感谢大三、大四学长、学姐给予的宝 贵意见和建议
感谢同学们的帮助和支持 感谢全体组员辛勤的劳动与付出
分析与讨论：
由酶活力曲线可以看出,每天测一次酶活力,实验时间较 长,对酶活力的精确测定有影响,以后测酶活可将时间间隔定 位12小时或更短时间,把酶活力测得更为精确，这也是我们 操作技术有待进一步提高，实验思想需要改进的地方。 目前，处理农作物秸秆的方式还只是简单作为牲畜饲料、 燃料等初步利用的阶段。利用微生物降解纤维素的方法还 未推广开来，这样就造成了很大的资源浪费及环境污染。 因此寻求高效能纤维素降解菌，必将成为今后很长一段时 间内需要研究的方向。
1.4
1.6
1.4
1.6
糖量/mg 蒸馏水/ml
2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4
DNS试剂/ml
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
混匀后，放入沸水中，准确沸水浴8分钟，取出 冷却至室温，加入21.5ml蒸馏水，以0号为对照 在540nm下测定其OD值，绘制葡萄糖标准曲线
降解纤维素菌株的筛选 及降解能力的比较
指导老师：xxx 班 组 组 级：xxx 长：xxx 员：xxx xxx
• 目的意义 • 实验用品 • 实验方法与流程 • 实验结果
• 分析与讨论
• 致谢
目的意义
能源危机、环境污染日益严重，在迈入21世 纪今天，已成为人类面临的两大难题。寻找新 能源，减少环境污染，越来越显得重要。纤维 素是植物光合作用的主要产物，利用微生物可 将纤维材料转化为能源、饲料、化工等原料。 筛选出降解纤维素的菌株有助于投入生产，在 能源、工业生产等作为理论参考。
分析与讨论：
本次试验由于时间等方面条件限制，只做了单一株 菌的酶活力测定，但我们很清楚纤维素酶是一种复合 酶系，自然状态下,纤维素的彻底降解是在微生物体系 中多种微生物长时间相互作用的结果，微生物种群间 存在着协同作用。所以降解纤维素菌株混合优化培养 是个需要深入研究的课题。 通常认为产生较大透明圈的菌株,降解纤维素能力也 较高,但本试验结果表明溶解圈大小不能完全代表菌株 的纤维素酶活力,ML-1菌种降解圈不是最大，但是其酶 活力却是最高的。这也说明仅以溶解圈大小作为纤维 素酶活力大小的定量指标是不太可靠的,其原因可能是 多方面的,如固体和液体培养条件不同;同一发酵时间和 酶作用温度不一定是每一株菌的最佳产酶时间和最适 作用温度,不同菌株具有不同的纤维素酶系等。
MR实验 吲哚实验 产酸 产气 淀粉实验
+ + +
+
+ + +
+ + +
葡萄糖标准曲线如下图：
酶活力测定结果：
0.160 0.140 0.120 0.100 0.080 0.060 0.040 0.020 0.000 1 2 3 4 t/d 5 6 7
ML-1 WD-5 BF-8
由图可知ML-1菌株在第五天时，酶活力最强，为0.20099；WD-5 菌株在第二天时酶活力最强，为0.1860；BF-8菌株在第四天时酶活 力最强，为0.1935。据此分析WD-5酶活下降较快，ML-5菌株酶活 力最强
由表中数据，挑选出ML-1，WD-5,BF-8R1/R2比值最大的三株菌
对所筛出的三株菌进行镜检得到图片如下：
ML-1
WD-5
BF-8
ML-1 革兰氏染色结果 细菌形态 阴性（红色) 杆状
WD-5 阳性(蓝紫色) 杆状
BF-8 阴性(红色) 杆状
生理生化实验结果
ML-1 WD-5 BF-8
VP实验
配置1mg/mL的葡萄糖标准液，取9只具塞试 管，分别编号0、1、2、3、4、5、6、7、8， 按下表加量：
0 1 2 3 4 5 6 7 8
项目 用接种环从试管里取一环活化后 的菌株，加入到产酶发酵培养基 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 葡萄糖标准 上培养，每隔一天取一定培养液， 液/ml 离心（8000r/min,10min）取上 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 清液，即为粗酶液。 相当于葡萄
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
实验用品
培养基：
羧甲基纤维素钠培养基（初筛培养基） ： CMC-Na 3.0g (NH4)2SO4 2.0g K2HPO4 1.0g MgSO4﹒7H2O 0.5g 胰蛋白胨 1.0g 琼脂 20g 刚果红培养基（复筛培养基）：CMC-Na 3.0g (NH4)2SO4 2.0g K2HPO41.0g MgSO4﹒7H2O 0.5g 胰蛋白胨 1.0g 琼脂 20g 刚 果红 0.0692g 水 1000ml PH 7.0 发酵产酶培养基：CMC-Na 10.0g (NH4)2SO4 4.0g KH2PO4 2.0 MgSO4.7H2O 0.5g H2O 1000ml PH 6.0