MicroRNA(miR)-27b在山羊生长过程中的组织表达谱分析Tissue

基金项目：国家高技术研究发展计划(863)项目(No.2011AA100307)、安徽省技术创新工程试点省专项(No.11Z0101095)和安徽省科技计划项目(No.11010302108)收稿日期：2012-11-02接受日期：2012-11-30Online system:农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology2013,21(6):677~683DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2013.06.006研究报告LetterMicroRNA(miR)-27b 在山羊生长过程中的组织表达谱分析凌英会1，2丁建平1，2张晓东1，2王丽娟1，2向浩1，2张运海1，2张子军1，2*章孝荣1，2*1安徽农业大学动物科技学院，合肥230036；2安徽省地方畜禽遗传资源保护和生物育种重点实验室，合肥230036*通讯作者，zhangzijun@ ；zxr@摘要本研究旨在分析microRNA(miR)-27b 在安徽白山羊(Capra hircus )和波尔山羊生长发育过程中的表达变化，以了解其在山羊肌肉发育中的重要作用。

选用安徽白山羊和波尔山羊不同发育时期(初生，6月龄和12月龄3个时期)背最长肌为材料，利用Real-time quantitative PCR (qRT-PCR)方法检测miR-27b 的表达变化。

同时，分析了miR-27b 在6月龄山羊各组织中(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、腿肌和胸肌)的表达。

并用MEGA3.1分析miR-27b 在不同物种中的保守性。

结果显示，miR-27b 在安徽白山羊和波尔山羊骨骼肌发育过程中差异表达，呈现不同的表达模式。

安徽白山羊12月龄背最长肌miR-27b 表达最高，初生时最低。

在山羊不同组织中，骨骼肌和心脏中miR-27b 表达量较高，肝脏和肾脏中miR-27表达处于中度水平，而在另外4种组织中表达量较低。

实验结果表明，miR-27b 可能参与山羊肌细胞增殖和分化，从而影响山羊骨骼肌生长发育，与山羊肌肉的生长类型有关。

同时序列分析显示，miR-27b 在10个物种中具有较高的保守性。

山羊miR-27b 的表达具有的组织和时序差异性实验结果为进一步研究miR-27b 的功能提供基础资料。

关键词山羊，miR-27b ，生长，表达Tissue Expression Pattern Analysis of MicroRNA(miR)-27b in the Growth Process of Goat (Capra hircus )LING Ying-Hui 1,2DING Jian-Ping 1,2ZHANG Xiao-Dong 1,2WANG Li-Juan 1,2XIANG Hao 1,2ZHANGYun-Hai 1,2ZHANG Zi-Jun 1,2*ZHANG Xiao-Rong 1,2*1College of Animal Science and Technology,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China;2Local Animal Genetic Resources Conser-vation and Biobreeding Laboratory of Anhui Province,Hefei 230036,China *Corresponding authors,zhangzijun@;zxr@Abstract The aim of this study is to detect the expression of microRNA(miR)-27b in skeletal muscle devel-opment in goats(Capra hircus ),and explore the roles of miR-27b in muscle development.Real-time quantita-tive PCR(qRT-PCR)was performed to detect the miR-27b expression in the longissimus dorsi muscle from the skeletal muscle tissues of different stages (neonate,6and 12months)in Anhui White and Boer goats(C.hircus ).Meanwhile,the expression of miR-27b in various tissues of 6months goats was detected.And the con-servation of miR-27b in different varieties was analysed by MEGA3.1.The miR-27b differential expression in农业生物技术学报Journal of Agricultural BiotechnologyMicroRNAs(miRNA)是一类新发现的长度为18~24nt 的非编码小RNA ，miRNA 通过与靶标特异性的碱基互补配对，引起靶mRNA 降解、稳定性下降或者抑制其翻译，从转录后水平调节基因的表达，从而参与动物的生殖、生长、发育、代谢等多种生物学过程(Dang et al.,2011;Baley and Li,2012)。

miRNAs 通过调控一些转录因子及一些信号传导因子来调节肌肉形成过程中细胞增殖、分化，与肌肉发育密切相关(Ge et al.,2011;Huang et al.,2012)。

对山羊肌肉组织miRNA 表达谱和特征研究对于进一步揭示其在山羊肌肉细胞增殖、分化等生长发育过程中的作用及机理具有重要意义。

近年来研究表明，许多miRNAs 参与了骨骼肌的增殖与分化调控过程(Chen et al.,2011;Yan et al.,2012)。

miR-27b 是近年来新发现的，在细胞增殖和分化过程中起调控作用的一种新的miRNA (Urbich et al.,2011;林先滋等,2012)。

在对过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR γ)转录后调控研究时发现，miR-27b 对其具有重要的调节作用，说明miR-27b 可能参与细胞脂向分化调控(肖金刚等,2009)。

对小鼠心脏发育过程中miRNAs 的表达研究发现，在心脏发育过程中miR-27b 却呈现一个明显的表达差异过程(Chinchilla et al.,2011)。

目前在miRBase 数据库中，还没有山羊miRNA 的收录。

本研究组前期利用高通量测序技术(So-lexa)，已获得安徽白山羊骨骼肌特异性表达的大量小RNA ，鉴定了包括miR-27b 在内的山羊骨骼肌特异性miRNAs 。

但是，关于miR-27b 在山羊不同的组织器官、不同发育阶段以及不同品种间表达情况和miR-27b 基因保守性研究尚未有相关的报道。

波尔山羊生长发育快，产肉性能好，是被人们公认的世界上著名肉用山羊品种之一，被誉为“世界肉用山羊之父”。

安徽白山羊为地方品种，属肉皮兼用型，以性早熟、繁殖力高、板皮质量好而著称，但其个体小、生长速度慢，故作为肉羊生产，尚需提高其肉用性能。

本实验以miR-27b 为研究靶标，选择在肌肉生长发育差异较大的两个山羊品种(波尔山羊和安徽白山羊)间进行比较研究，通过反转录Real-time quantitative PCR (qRT-PCR)方法(Mishina et al.,2007)，分析波尔山羊和安徽白山羊骨骼肌不同生长发育时期及其他组织中miR-27b 的表达谱情况，为进一步研究miR-27b 参与山羊生长发育调控功能提供基础资料。

1结果与分析1.1山羊miR -27b 克隆利用紫外分光光度计检测所提取山羊肌肉及其他组织的的RNA ，结果显示各样本的OD 260/OD 280均在1.8~2.0范围内，经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测可见清晰的18S 和28S 条带，且没有明显降解现象(图1)。

将山羊骨骼肌特异性靶基因反转录产物作为模板，用qRT-PCR 引物进行扩增，并通过4%琼脂糖凝胶电泳回收所需要的目的条带。

并将其克隆到T 载体上，并进行测序，结果显示其为miR-27b 成熟序列。

miR-27b 成熟序列为5′-UUCACAGUG-skeletal muscle development exhibited different expression patterns between Anhui White and Boer goats.The expression level in longissimus dorsi muscle from 12months goats was the highest,while,the expression level in neonate was the lowest.In 6months goats,miR-27b was abundantly expressed in longissimus dorsi muscle and heart,moderately in liver and kidney,and weakly in other collected tissues.The results indicated that miR-27b may be involved in myofibril proliferation and differentiation and further contribute to skeletal muscle development and muscle phenotype with different genotypes,and the miR-27b was conservative in 10different species.The expression of miR-27b has tissue and time specific,and the present result provides the theory base for study of miR-27b function.Keywords Goat,miR-27b,Growth,Expression1234567818S 28S5S图1山羊组织总RNA 凝胶电泳结果Figure 1Total RNA gel electrophoresis results of goat tissue 1~8：心脏，肝脏，脾脏，肺，肾脏，背肌，腿肌和胸肌1~8:Heart,liver,spleen,lung,kidney,longissimus dorsi,crura muscle and pectoral mucsle,respectively 678GCUAAGUUCUGC-3′。