赖氨酸高产菌株选育论文
ε-聚赖氨酸高产菌株的选育
动员食品等领域。（３）金盏花（ｍａｄ酬ｄ）提取物，生要含有叶黄素（１ｕｔｅｉｎ）。自然界叶黄素存在于绿色蔬菜和人体
的血浆争瑕球孛。它不仅具有和类镄萝卜素攘似鼹撬氧纯活性，薅且对褪睡膜色斑褪化ｇｌ起的视交下降和失明 有明显的保护律蹋。美、欢等国黻奈盏花尧琢辩提取叶黄素，美国Ｋｅｍｉｎ公司推爨了瑷猕猴拣汁为萋耩，潺加咔 黄素的护眼饮料，命名为“超视力饮料”。 ３．美国Ｆ（】ｏｄ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ ＳＤｌｕｔｉｏｎｓ推出ｐ萌萝卜素迷选褡提取物、植物多酚、番茄红素、宴Ｆ膏素（ａｓｔａｘａｎｔＫｎ）。 番茄红素务虾膏素璃震予类蘸梦｝、素，是类谈萝卜素串溃狳鑫蠹墓、魏戴靶活洼最港海瑟赣。番茄红素魏拣裁伍 活性是ｖ。的１００倍，螂青素是ｖＥ的８０倍。高活力清除自内基的抗氯剂，能预防对低密度脂萤自的氧化，预防细 胞的老化。圆内外通常将其应用于开发防衰老和养颜的功能食品。
有机食品是世界食品工业发展的趋势，食 隧防腐裁的天然化成隽这一趋势的必然要求。 图前￡一聚赖氨酸是最具优良性能和巨大商业价 值的生物防腐剂之一【１ Ｊ。它是含有２５～３０个 赣氨酸残基的阳离子聚合多肽，当聚合度低予
（％）：贝特纳培养基＋ＡＥＣ。 （４）甘氨酸抗凝培养基（％）：燹特缡培养 基＋甘氨酸。
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ｐＨ７．０磷酸缓冲液的试管巾，加入１ ｍＬ单
孢子悬浮液，再加入ＤＥＳ溶液，３７℃恒濑水浴 保溢一定时阕。 １．５筛选方法 （１）菌株初筛和第１次复筛方法：璩脂块
赖氨酸高产菌工业育种路线
赖氨酸的理化性质，分子结构，功能 应用等。（略） 以黄色短杆菌为出发菌株，介绍其高 产赖氨酸菌株的获得方法。
（1）诱变方法（甲硫氨酸、高丝氨酸营养缺陷型选育） （2）诱变方法（赖氨酸结构类似物抗性菌株的选育） （3）诱变方法（筛选 （6）协同作用
（3） 诱 变 方 法
细菌的抗药性突变往往涉及到其它性状的改变，可望在 工业上得到广泛的应用。利用细菌对药物的抗性筛选赖氨酸 菌种，一般能迅速收效，抗药性菌株一般对营养要求并不苛 刻， 既有办法防止退化又易于纯化和复壮。 具体方法：平板上涂经诱变后的菌悬液，在培养皿中放 置含有药物的滤纸片（或打孔法）在其抑菌圈内能生长的就 是这种抗生素的抗性菌株。得到的抗性菌株经液体发酵培养， 酸性茚三酮法测定赖氨酸产量，获得赖氨酸高产菌株。
（5） 基 因 工 程 育 种
基因工程方法可以起到定向育种的目的。 如使用基因敲除方法，敲除高丝氨酸脱氢酶的合成基因， 使其不能合成，这样就能起到消除苏氨酸对天冬氨酸激酶的 抑制作用的目的。 通过向培养液中流加少量HSDH保证生长，从而得到能 大量合成赖氨酸的突变株。
（6） 协 同 作 用
就是以上几种方法一起使用， 这里不作介绍了。
（1） 诱 变 方 法
诱变育种的方法同《如何以野生型某菌株构建其的氨基 酸缺陷型菌株》word文件中提到的。我们这里主要是为了解 除反馈抑制作用，而又对天冬氨酸到赖氨酸合成途径没有影 响，所以我们选育高丝氨酸缺陷型菌株，因为它不能合成高 丝氨酸脱氢酶，所以也就不能合成高丝氨酸，继而不能合成 苏氨酸，使得天冬氨酸激酶能够正常的发挥作用，而不受抑 制，大量合成赖氨酸；还可以选择亮氨酸缺陷型菌株。 通过往发酵罐中流加少量加入高丝氨酸或者苏氨酸即可 维持菌体生长需要。
（4） 原 生 质 体 融 合
ε-聚赖氨酸产生菌的筛选、育种及发酵研究
ε-聚赖氨酸产生菌的筛选、育种及发酵研究ε-聚赖氨酸（ε-poly-Lysine，ε-PL）是少数链霉菌将L-赖氨酸单体通过α-COOH与ε-NH<sub>2</sub>脱水缩合而成的一种氨基酸同聚物，聚合度为25-35。
由于其抑菌谱广、效价高、安全无毒，再配合其水溶性好、作用pH广、热稳定强等特点，ε-PL已被广泛用作食品防腐剂。
此外，ε-PL还被用于食疗剂、药物载体、基因芯片、电子材料等领域。
因此，其应用价值及市场前景是非常广阔的。
本论文首先从土壤中筛选获得了五种野生型的ε-PL产生菌；其次利用传统诱变方法及新兴的Genome Shuffling技术对这些野生菌株进行育种改造，以提升其ε-PL发酵水平；然后对获得的高产菌株进行了种间随机的原生质体融合，将其优良性状集中于同一个细胞内，进一步提升了ε-PL的产量；最后对种间融合获得的高产杂合子产ε-PL 进行了强化，包括Genome Shuffling、培养基优化及发酵工艺优化，最终使其ε-PL产量达到了国内领先水平。
具体研究内容如下：（1）从土壤中筛选放线菌时，为了有效抑制杂菌（细菌、霉菌）的生长，在分离培养基中添加了复合抑制剂：重铬酸钾30mg/L、青霉素2mg/L、氟哌酸3mg/L、制霉菌素80mg/L；对ε-PL 产生菌的筛选方法做了改进，利用“双层琼脂法”代替“直接添加美蓝”法，将“菌落生长”与“排斥美蓝显色”分成了两个阶段，能够有效避免美蓝对微生物的毒害，提高了筛选效率；利用该法从土壤中筛选获得了ε-PL产生菌42株，其中至少有白色链霉菌S. albulus、禾粟链霉菌S. graminearus、吸水链霉菌S. hygroscopicus、灰褐链霉菌S. griseofuscus、稠李链霉菌S. padanus等五种菌株，其中后四种菌株在ε-PL产生菌中未见报道。
（2）采用紫外线（UV）与亚硝基胍（NTG）对五种ε-PL产生菌进行诱变。
通过改变代谢途径选育赖氨酸生产菌株
ＮＭｕ 的 稀 释 液 振 荡 １ ｍｉ 、 ２ １ｉ、 ３ １ｉ、 ０ ｎ ０ ｎ ０ ｎ ｎ ｎ
生 成 天 冬 氨 酸 一１一 半 醛 ； 后 分 成 两 路 ， 方 面 酸 和 天 冬氧 酸 一Ｂ一 半 醛 到 高 丝 氨 酸 两 条 代 谢 途 ３ 然 一 微 ＭＰ和 三 羧 酸 循 环 只 能 沿 着 赖氨 在 二 氢吡 啶 二 羧 酸 （ ＤＤＰ） 成 酶 等 一 系列 酶 催 化 径 时 ， 生 物 的 Ｅ 合 下 生成 赖 氨 酸 ， 一 方 面在 高丝 氨 酸 脱 氢酶 催 化 下 酸代 谢 方 向合 成 ，但 当细 胞 内的 赖氨 酸 量过 多时 ， 另
．ｇ ．ｇ， 乙酸 铵 （９ ） ｇ， 生物 素 ２ ｇ ． （ ， ） 选 到 一 个 细胞 渗 漏 型 的 营 养缺 陷 型 ， 赖 氨 酸 有 效 ４０ ，玉 米 浆 ２５ 让
长 曲 线进 行 测 定 如 图 ２从 图 ２以看 出， １的 对 数 生 ． Ｂ
长期 为 ３ ７ ．选 用培 养 ６ ～ｈ ｈ的 菌体 制成 悬 浮液 进 行
０前言 Βιβλιοθήκη 生成 高丝 氨 酸 ；据 对赖 氨 酸 生物 合 成 途 径 的研 究 ，
圜 杆羧酸循萄 经氧产酸是糖 氨途成三酮生 固 菌进羧酸Ｏ 定 生酮酸， 酵化赖途经 酸径丙， 葡 棒脱氨径 Ｃ 和１ … ！ 解Ｂ 丙 成 入 环
基 金 项 目： 西教 育厅 科 研 项 目（ 目编 号 ： （ ５９ １ ） 广 项 ２（ ０ ２６ １ １
ε-聚赖氨酸高产菌株的诱变选育
８一聚赖 氨酸 （ ｅ—Ｐ ） 是一 种微 生 物 源胞 外 Ｌ 线性 多聚 物 ，仅 由 ２ ３ ５— ５个 Ｌ—ｌｓ ｅ残 基 通 过 ｙｉ ｎ
收稿 日期 ：２ １ ０ ０ １— ７—１ ４
一Байду номын сангаас
羧基和 ８ 氨基连接而成。１７ 一 ９７年 ，Ｓｉａ ｈ 和 ｍ
Ｓｋｉ ａａ首次在 Ｓ ｅｔ ｙｅ．ｌ ｌ Ｂ Ｃ１１７ ｔｐｏ ｃｓａ ｕ ｓ Ｒ ４４ 菌 ｒ ｍ ｂ ｕＮ
ｃ ａ ａ ｔ ｒ ｔ ｓ ｗ ｒ ｅｙ ｓａ ｌ ． ｈ ｒ ｃｅ ｓｉ ｅ ｅ ｖ ｒ ｔｂ ｅ ｉ ｃ
Ｋｅ ｒ ｓ ｙ ｗｏ ｄ ：８一ｐ ｌ ｏｙ—Ｌ —ｌ ｓ ｅ ａ ｐ ｒｏ ｉ ａ ｅ ｒ ｓｓ ｎ ； Ｓ ｒ ｔｍｙ ｅ ｉｓ ｔｃ ｒ ｍｏ ｅ ｅ ｙ ｉ ； ｓ ａ ｔ ｋｎ ｓ ； ｅ ｉｔ ｔ ｔ ｐ ｏ ｃ ｓｄ ａ ｔ ｏ ｈ ｏ ｇ ｎ ｓ ｎ ａ ｅ ａ
基金项 目：国家 ９ ３ 目 （ ０ ７ Ｂ １３ ５ ７项 ２０ Ｇ ７ ４ ０ ）资助。 作者简介：贾 士儒 （９ ４ ，男 ，教授 ，研究方 向为生物 防腐剂 。 １５ 一）
株 的发酵 清液 中发现 这种 氨基 酸多 聚物 ￡一Ｐ 。 Ｌ 这种 多 聚物水 溶 性好 ，生物 可 降 解 ，对 人 体安 全 无 毒 ，并 具有 广 谱 抑菌 性 。 目前 ，￡一Ｐ Ｌ及 其 衍 生物应 用 范 围较 广 ，除 可用 于食 品 防腐 外 ，还 可 以作 为抗肥 胖 剂 、药 物 和基 因载 体 、持水 性 材
ｐ ｏ ｎ ｌｙ ｕ ａ ｅ ｃ ｒ ｏ ｙ ｉ ａ ｅ ｉ ｆｅ ｂ ｃ ｈ ｅ ｏｐ ｒ ｖ ｔ ａｂ ｘ ｋ ｎ ｓ ｓ ｅ ｄ ａ ｋ—ｒ ｇ ｌｔ ｄ ｂ ｈ —ａ ｐ ｒａｅ Ｉ ｒ ｅ ｏ ｒ ｍｏ ｅ ｔ ｅ ｅ ｆｅ ｂ ｃ ｎ ｉ ｉ ｅ ａｅ ｙｔｅＬ ｕ ｓ ａｔｔ ． ｎ ｏ ｄ ｒｔ ｅ ｖ ｈ ｓ ｅ ｄ ａ ｋ ｉ ｈ ｂ－
赖氨酸高产短小芽孢杆菌诱变选育及关键酶基因的分析
文章 编号 ： １ Ｏ Ｏ Ｏ 一９ ９ ７ ３ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ２ －０ ０ ２ ６ 一Ｏ ４
Ｂｒ ｅｅ ｄｉ ｎ ｇ ｏ ｆ Ｈｉ ｇｈ Ｙｉ ｅｌ ｄ Ｌ ｙ ｓ ｉ ｎ ｅ Ｍｕ ｔ ａ ｎ ｔ Ｓｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｉ ｎ Ｂａ ｃｉ ｌ ｌ ｕ ｓ
１ ｏ ｇ ｕ ｅ ｓ ＡＥ Ｃ ｏ ｆ ６ ． ０ ｍｇ ／ ｍＬ ｆ ｏ ｒ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎ ｃ ｅ ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｉ ｎ ｇ ａ ｎ ｄ ＨＰ Ｌ Ｃ ａ ｍｉ ｎ ｏ ａ ｃ ｉ ｄ ｓ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｉ ｎ ｇ ．Ｔ ｈ ｅ ｍｕ ｔ ａ ｎ ｔ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ Ｎ９ ｉ ｓ ｓ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｆ ｏ ｒ ｉ ｔ ｓ ｈ ｉ ｇ ｈ ｌ ｙ ｓ ｉ ｎ ｅ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ５ ０ ． ８ ３ ｍｇ ／ ｍＬ， ｗｈ ｉ ｃ ｈ ｉ ｓ ４ ６ ． １ １ ｈ ｉ ｇ ｈ ｅ ｒ
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｔｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ｉ ｓ ｃ ｏ ｎ ｄ ｕ ｃ ｔ ｅ ｄ ｔ ｏ ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｈ ｉ ｇ ｈ ｙ ｉ ｅ ｌ ｄ ｌ ｙ ｓ ｉ ｎ ｅ ｍｕ ｔ ａ ｎ ｔ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｐ ｕ ｍｉ ｌ ｕ ｓ ｏ ｆ
大提 高的 突变株 Ｎ９ ， 其发 酵液 中， 赖氨 酸含 量达到 ５ ０ ． ８ ３ ｍｇ ／ ｍＬ， 比原始 茵株提 高了 ４ ６ ． １ １ 。通过 克
隆测 序对 其赖氨 酸合 成途径 中的 关键 酶 天冬氨酸激 酶进行 生物信 息学分析 ， 发现 第 ７ ８ ３ ￣８ ２ ６位碱 基 的
L-赖氨酸高产菌的选育及发酵培养基的优化
ｓｕｒｆａｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＳＭ）
万方数据
２００９年１９（４）
生物技术
３７
Ｌ一赖氨酸又名ａ，￡一二氨基己酸或２，６一二氨基己酸，分
子式为ＱＨ。。Ｎ２Ｑ，结构式为ＮＩ－１２一（ＣＨ２）。一ＣＨ（ｍ）一
ＣＯＯＨ，分子量为１４６。赖氨酸是柱状晶体，溶于水，熔点为２２４ —２２５。Ｃ，有右旋光性。
［１３］夏凡，琚争艳．微生物碱性蛋白酶在食品工业２．
Ｌ一赖氨酸高产菌的选育及发酵培养基的优化
陈银芳，张伟国。
（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡２１４１２２）
摘要：目的：获得Ｌ一赖氨酸高产菌及得到最优的发酵培养基。方法：以黄色短杆菌（Ｂｒｅｂｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＸＱ一８为出发菌
ＭｇＳ０４·７Ｈ：０ ０．１、ＭｎＳ０４·４Ｈ，Ｏ ０．０１、ＦｅＳ０４‘７Ｈ２０ ０．０１、ＶＨ
３０ｔ，．ｇ、ＶＢ，１００／．Ｌｇ、Ｌ—ｍ０．４、尿素１．５，琼脂２０。
（２）完全培养基（ｇ／Ｌ） 葡萄糖５、牛肉膏１０、蛋白胨１０、ＮａＣｌ ５、琼脂２０。
（３）种子培养基（ｇ／Ｌ） 葡萄糖２５、玉米浆２５—３０、（Ｎ心）２Ｓ０４ ５、ＫＨ２Ｐ０４ １、Ｍｇｓｏ，，·
Ｆｏｌｉｎ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ［Ｊ Ｊ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｍａｌ
（１）：２６５—２７５．
、
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［８］华雪铭，周洪琪，邱小琮，等．饲料中添加芽孢杆菌和硒酵母对异
_聚赖氨酸生产菌株的筛选和鉴定
技术与方法ε2聚赖氨酸生产菌株的筛选和鉴定3朱宏阳 徐 虹33 吴 群 陈玮玮(南京工业大学制药与生命科学学院 南京 210009)摘要:建立了一种灵敏的ε2P L产生菌高通量的筛选方法。
在分离培养基中加入150mg/LK2Cr2O7,以有利于放线菌的富集分离;并添加美蓝染料,利用产碱菌株碱性分泌物和美蓝之间的静电作用而形成独特的透明圈,从而灵敏地筛选得到产碱菌株;利用D ragendorff试剂与生物碱特有的颜色反应从产碱菌株中检出得到46株生物碱产生株;最后对产生物碱的菌株的发酵液进行ε2P L含量分析,确定4株ε2P L产生菌株。
对其中一株ε2P L高产菌P L623菌株进行形态、生理生化和16S r DNA分析,结果表明P L623为北里孢菌属(Kita2satospora)。
关键词:菌株筛选,鉴定,ε2聚赖氨酸,北里孢菌,16S r DNA中图分类号:Q93 文献标识码:A 文章编号:025322654(2005)0520127204Screen i ng and I den ti f i ca tion ofε2PL Produc i ng Stra i n3ZHU Hong2Yang XU Hong33 WU Qun CHEN W ei2W ei(College of L ife Science and Phar m aceutical Engineering,N anjing U niversity of Technology,N anjing210009)Abstract:A si m p le and sensitive method was devel oped t o screenε2P L p r oduced strains fr om s oils1150mg/LK2Cr2O7was added t o the s olid medium for actinomycetes enriching1A basic dye,methylene blue,incor poratedin the agar p late t o detect alkali p r oducers,because dye reacted with the secreted basic poly mers by electr ostaticinteracti on with the secreted basic pdy mers and f or med s pecial z oon1And then dragendorff regent was used t o de2tect alkal oid p r oducers1Fourε2P L p r oducerswere obtained by T LC analysis1Meanwhile,phyl ogenetic analysis ofP L623strain,including mor phol ogy,physi ol ogical and bi oche m ical characters and chemotaxomy were perfor medand phyl ogenetic tree was constructed based on the16S r DNA sequences1And the results indicated that P L623strain is a me mber of Kitasatospora1Key words:Screening,I dentificati on,ε2polylysine,Kitasatospora,16S r DNAε2聚赖氨酸(ε2poly2L2lysine,ε2P L)是由微生物合成的L2赖氨酸同聚物,由ε2氨基与α2羧基通过肽键连接而成,其聚合度一般为25～35[1,2]。
赖氨酸菌种选育
诱变处理
取菌悬液5mL 加入至15mm×150mm 的无菌试管中，加入0.5NTG+0.5%NMU 的 稀释液振荡10min 、20min、30min、40min、 50min、60 min ，作致死曲线，由致死曲线 可以看出当处理时间在40min 时，致死率达 80%，因此，正式试验选用40min 诱变处理
测量结果
从上表摇瓶发酵结果看B10 产酸率最高，该突 变菌株由于使用了选择性平板培养基筛选而得，具 有确定的遗传标记
THANK YOU!
赖氨酸菌种选育
赖氨酸
赖氨酸作为人体和动物所必需的氨基酸之一， 被广泛用于饲料、添加剂、食品强化剂和医药产 品等方面。随着赖氨酸的需求量急剧增加，赖氨 酸的生产开发需要进一步的研究，而选育出优良 菌种是其技术的关键。
赖氨酸生物合成途径
葡萄糖经酵解途径生成丙 酮酸，丙酮酸经CO2固定和氧 化脱羧进入三羧酸循环，生成 草酰乙酸，再经氧基化反应生 成天冬氧酸；天冬氨酸在天冬 氨酸激酶和天冬氨酸- β- 半醛 催化下生成天冬氨酸- β- 半醛； 然后分成两方面，一方面在二 氢吡啶二羧酸（DDP）合成酶 等一系列酶催化下生成赖氨酸， 另一方面在高丝氨酸脱氢酶催 化下生成高丝氨酸。
筛选结果
由平板筛选能在甘油+ 丙氨酸+ 高丝氨 酸+基本培养基上，选择培养基上生长菌株 有16 株，再经5 次传代试验仅有5 株能稳定 传代
产酸率的测量
赖氨酸测定：采用酸性茚三酮比色法测定， 发酵液经3000rpm 离心15min ，取上清液 0.1 ml 稀释至50ml，再吸取1ml 稀释液加入 盛有4ml 茚三酮试剂的试管中，于沸水浴加 热20min，冷却后用721型分光光度计在 478nm 处比色，查标准曲线确定该发酵液中 的L- 赖氨酸，用蒸馏水作空白对照
“高产赖氨酸芽孢杆菌研制及其在养殖业中的应用”通过鉴定
夹（ Ｂ － ｈ ａ ｉ ｒ ｐ ｉ ｎ ） 抗 微 生 物 肽 的结 构 相 似 性 ， 研 究 人
员 工程 化 了 Ｎ ａ ｖ ｉ ｄ ｅ ｆ ｅ ｎ ｓ ｉ ｎ ２ — ２的 ｂ ｅ ｔ ａ 一 折 叠 片层 区
域。 通过 单点 突变 （ Ｇ ｌ ｙ ４ Ｃ ｙ ｓ ） 引入 一个 半胱 氨酸 重
专 家 组 一致 认 为 ， 该 技术 成 果 总体 达 到 国际
（ Ｄ Ｏ Ｉ ：１ ０ ． １ ０ ２ １ ／
动物所基于昆虫防御素的 新分子设计取得新进展
最 早 起 源 于欧 洲 的蛆 虫 疗 法 （ Ｍａ ｇ ｇ ｏ ｔ ｔ ｈ ｅ ｒ ａ ． Ｐ Ｙ ） 是 一 种 自然 的生 物 疗 法 ，用 于 治 疗传 统 抗 生
（ 来源 ： 中 国科学 院 网 ）
建 两对 新 的二硫 键 ，将 昆虫 防御 素 羧基 端 ｂ ｅ ｔ ａ 一
折叠片层结构改造成典型 的 ｂ ｅ ｔ ａ 一 发夹 肽结构 。
能 够 明显 提 高 动物 的免疫 机 能 ， 减少 赖 氨 酸 的添
加 比例 和 抗 生 素 的使 用 量 ， 应 用 效 果 良好 ， 取 得 了显 著的 经济效 益 、 社会 效益 和生 态效 益 。
江 西 饲 料
合成 机 制在 内质 网 降解 途径 中发挥 着 重 要 作用 ，
从 而 系 统 地 揭 示 了生 物 体 内 Ｕ ｂ ｅ ２ ｇ ２催 化 ｌ ｙ ｓ ４ ８ 连 接 的泛 素链形 成 的分子 机 制 。
ＥＭＢ Ｏ Ｊ ． 。
２ ０ １ ４ 年第１ 期
细菌 （ 包 括 一些 耐 甲氧 西林 的金 黄色 葡 萄球 菌 临 床 分离 株 ） 的生长 。作 用 机制 研究 表 明 。 Ｎ ｖ Ｂ Ｈ能 够 有效 破 坏 敏感 细 菌 的细 胞膜 结 构 ， 导 致 细菌 死
L-赖氨酸高产菌发酵的研究
２ １ ２ 初 糖 浓 度 对 产 酸 及 糖 酸 转 化 率 的 影 响 Ｌ ．． 一
１３ １ 斜 面 、 ．． 平板 培 养方 法
℃ ， 养 ２ 。 培 ４ｈ
点 实验 室 ， 苏 无锡 ２４２ ） 江 １ １ ２
摘 要 ： 在摇 瓶 条件 下对赖 氨酸发 酵 的供氧 、 糖 浓度 等 进 行 了研 究 ， 对 氮 源硫 酸铵 、 养 因素 初 并 营
玉 米浆和 Ｌ 苏氨 酸进行 了响 应 面分 析 试验 ， 到 最优 的 摇 瓶发 酵条 件 。在 此 基 础 上 ， 行 了 ７Ｉ 一 得 进 自控 发酵罐 赖氨 酸发 酵试验 。研 究结果表 明 ， ７Ｉ发 酵罐 中发 酵 ６ 在 ４ｈ左右 ， 累赖氨 酸 盐 酸 盐 积
由 日本 味之 素 、 国希 杰 、 国 ＡＤ 等 厂 家 ， 内 韩 美 Ｍ 国
主要 生产 厂家有 吉 林 大成 、 徽 丰 原 等 。尽 管我 国 安 赖氨 酸产量 已稳 居 世界 第 一 ， 蛋 白质 的利 用 率 ， 可 促进 禽 畜 生
Ｌ 赖 氨 酸 高 产 菌 ｘ ９（ Ｃ Ｓ ｃ ｈ — 一 Ｑ． ＡＥ ｕ Ｔ ｒ
Ｓ ｈ） ３， Ｇ ［３ 由黄 色短 杆 菌 （ ｒｂ ｉａ ｔｒｕ ｆ ａ ｕ １ Ｂ ｅ ｖｂ ｃ ｉｍ ｌｖ ｍ） ｅ
羧化 反应 提 供 。充 分 供 氧 ， 使 菌 体 呼 吸 充 足 ， 可 可
文 章 编 号 ： ６ ３ １ ８ （ ０ １ ０ ９ ４０ １ ７ ６ ９ ２ １ ） ６０ ２ — ５
Ｌ赖氨酸高产菌发酵的研 究 一
赖氨酸产生菌的筛选与分离
赖氨酸产生菌筛选和分离学生姓名专业生物工程学院食品工程学院2012年 4 月4日赖氨酸产生菌的筛选与分离一、目的筛选出高产的优良菌株，以提高糖的转化率和发酵液中赖氨酸的累积浓度，缩短发酵时间，提高生产效率从而减少生产成本。
二、意义赖氨酸(Lysine)的化学名称为2，6一二氨基己酸，有L一型(左旋)、D一型(右旋)和DL型(消旋)三种旋光学异构体。
人类和动物可吸收利用的只有L-型。
L-型赖氨酸是人和动物营养的八种必需氨基酸之一，它对调节体内代谢平衡、提高体内对谷类蛋白质的吸收、改善人类膳食营养和动物营养、促进生长发育均有重要作用。
由于其不能在人体内由还原氨基化作用或转氨基作用生成，必须由食物中摄取，因此赖氨酸有“特殊必须氨基酸”之称。
此外，赖氨酸在食品、医药以及生物饲料方面也占有极其重要的地位。
近几年来，它的经济价值和社会效益日趋引起人们的重视，随着发酵科学的不断发展，提高赖氨酸发酵产酸收率的研究，成为迫切需要解决的问题之一。
三、国内外研究概况及现状L-赖氨酸最初是从蛋白质水解物中分离得到的，蛋白质水解法一般以动物血粉为原料，此法特点是工艺简单，但原料来源有限，仅适合小规模生产。
后又出现了化学合成法、酶法，使用的合成法主要有荷兰的DMS(Dutch State Mijinen)法和日本的东丽法，此法最大缺点是使用剧毒原料光气，可能残留催化剂，产品安全性差，存在严重的环保问题。
1960年，日木首先采用微生物发酵法生产。
微生物发酵生产氨基酸是人为地解除氨基酸生物合成的代谢控制机制，使其积累大量所需氨基酸。
氨基酸的L-型立体专一性决定了发酵法生产氨基酸较化学合成的工艺更简单、快捷。
我国于20世纪60年代中期开始进行赖氨酸菌株选育和发酵的研究，但因产量较低难以工业化。
直到70年代末80年代初世界赖氨酸实现工业化后我国研究才取得突破。
我国上海工业微生物研究所采用山芋淀粉为原料选育出的AU1 12菌种产酸率8％一10％。
赖氨酸生产菌育种途径的研究进展
赖氨酸生产菌育种途径的研究进展摘要：赖氨酸是人和动物营养的9 种必需氨基酸中的第一必需氨基酸，发酵法是目前生产赖氨酸最主要的方法。
其生产菌的选育传统多以人工诱变为主，现在科学研究则多注重基因工程技术在育种中的应用。
本文综合介绍了传统和现代的育种方法，并对赖氨酸的生产做一展望。
关键词：赖氨酸、育种、诱变、基因工程赖氨酸（Lysine）的化学名称为2，6-二氨基己酸，有L-型（左旋）、D-型（右旋）两种旋学异构体。
人类和动物可吸收利用的只有L-型。
赖氨酸是人和动物自身不能合成的一种氨基酸，必须从外界摄取，而植物中所含的各种赖氨酸很少，被称为植物中第一限制性氨基酸。
赖氨酸具有广泛的用途，在食品方面可用作食品营养强化剂和食品除臭剂；在医药方面可用作许多药物的辅助剂，对于提升药物作用效果显著；在饲料方面可以用于提高禽畜蛋白质质量。
现代工业上主要以发酵法生产赖氨酸。
本文从赖氨酸的生产现状、传统方法育种与基因工程育种的进展等方面做一综述。
1 赖氨酸生产现状L-赖氨酸生产方法主要有抽提法、化学合成法、酶法和发酵法。
20世纪60年代以前，由于赖氨酸生物合成途径没有充分被阐明，赖氨酸的生产大多采用抽提法、化学合成法和酶法生产。
Gilvarg等于上世纪50年代首先报道了肠杆菌属的一株代表菌株结肠芽孢杆菌生物合成赖氨酸途经。
1957年日本开始采用野生菌株发酵法生产谷氨酸，1960年日本的本下祝郎等用紫外线照射谷氨酸棒杆菌得到一株营养缺陷性变异株，从此开始了发酵法工业生产商品赖氨酸[1]。
现在，工业上主要采用发酵法生产赖氨酸。
用于工业上发酵生产赖氨酸的菌株主要是棒状杆菌和短杆菌等的变异株，棒状杆菌具有极高的经济价值，其中谷氨酸棒状杆菌应用最为广泛。
此外，赖氨酸生产还有应用大肠杆菌、黄色短杆菌、酿酒酵母、乳酸发酵短杆菌、假丝酵母等的报道。
我国自20 世纪70 年代末就开始用国内自己诱变的菌种生产赖氨酸，但只生产少量的食品添加剂。
赖氨酸论文
赖氨酸论文南京科技职业学院毕业设计（论文）题目赖氨酸的生产工艺概况姓名顾宇天学号220228所在系部化工系专业班级精细1322指导教师陈腊梅2016 年 4 月摘要赖氨酸是构成蛋白质的基本单位，是组成人体蛋白质的20种氨基酸之一，组成蛋白质分子的氨基酸都是L-氨基酸，但近年内证实了它们可以异构为D-氨基酸，该文章介绍了赖氨酸的发展历史和应用前景，系统介绍了赖氨酸的发展起步，国内外市场的概况。
介绍了赖氨酸的生产工艺，并详细介绍了赖氨酸发酵法的工艺关键词:发酵工艺，发展历史，市场概况目录1赖氨酸的概况 (1)1.1赖氨酸的简介 (1)1.2赖氨酸的性质 (1)1.3赖氨酸的营养功能 (2)1.4赖氨酸的分类 (2)1.5赖氨酸的国外市场发展概况 (3)1.5赖氨酸的国内市场发展概况 (4)1.6 未来几年中国需求量预测 (5)2赖氨酸的生产工艺 (6)2.1 赖氨酸的生产原料及菌种 (6)2.2赖氨酸发酵工艺控制 (6)2.3发酵法 (7)2.4赖氨酸合成途径的调节机制 (8)2.5赖氨酸生产菌的育种 (8)2.6培养基 (9)2.7菌种培养 (9)2.8发酵工艺条件以及影响因素 (10)3微生物发酵工艺原理概述 (11)3.1微生物工业发酵的历史 (11)3.2微生物发酵工业用菌种 (11)3.3发酵机制与代谢机制 (12)参考文献 (13)致谢 (14)1赖氨酸的概况1.1赖氨酸的简介赖氨酸是构成蛋白质的基本单位，是组成人体蛋白质的20种氨基酸之一。
L—赖氨酸是人体必需氨基酸，能促进人体生长发育、增强免疫力和免疫功能，并有显著提高中枢神经组织功能的作用。
而且还是是人体内不能合成的八种氨基酸 (色氨酸、苯、丙氨酸、赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸等。
这八种氨基酸称营养必需氨基酸)之一缺少时会产生蛋白质代谢障碍和机能障碍。
而且在人们的主食大米和面粉蛋白质中赖氨酸含量极少。
如缺乏则引起蛋白质代谢障碍及功能障碍，导致生长障碍。
赖氨酸生产菌某些特性及发酵试验的研究
ZL-9601赖氨酸生产菌某些特性及发酵试验的研究2006-1-5 14:52:38 新闻来源：农业生物技术学报李秀锦仲飞刘绍军常学东孙树杰赵彦波冀振华(河北农业技术师范学院，昌黎066600)摘要：本研究对ZL-9601赖氨酸生产菌菌株的形态、培养特性和生理生化特性进行了初步鉴定和分析，并以糖蜜为主要原料，初步确定了该菌的产酸能力。
结果表明，该菌为短杆菌(0.8～1.0×1.0～2.5μm), 需氧, 发酵最适温度30℃, 最适pH7.0～7.2, 最适碳源为葡萄糖, 最适氮源为硫酸铵; 该菌不分解赖氨酸, 可耐15%的赖氨酸, 耐30%的葡萄糖。
以糖蜜为主要原料, 在最适温度和pH的条件下, 产酸可达6%以上。
关键词: ZL-9601菌种；赖氨酸；发酵；菌种特征赖氨酸是人和多种动物的必需氨基酸。
在谷类食品和饲料中添加适量赖氨酸可提高这类食品或饲料中蛋白质的营养价值。
目前, 在国内外市场上, 赖氨酸的需求量日益增加, 培育赖氨酸高产菌株和研究最佳发酵工艺条件便受到人们的普遍重视［1～4 ］, 许多高产菌株陆续被选育出来［5～8］。
如国内选育的TL-1菌株产酸量为4.5% 。
为进一步提高赖氨酸的产量, 人们又在这些菌种的基础上通过各种选育过程得到更高产的菌株［9］。
如ZL-9601赖氨酸生产菌株就是由谷氨酸棒杆菌AS1.563通过进一步诱变处理选育出的高产菌株。
本研究主要就ZL-9601菌株的形态、培养特性和生理生化特性进行了初步鉴定和分析，并以糖蜜为主要原料进行发酵试验, 旨在为实际生产确定最佳发酵条件提供科学依据。
1材料与方法1.1菌种ZL9601菌株由河北农业技术师范学院食品生化实验室选育。
该菌为谷氨酸棒杆菌AS 1.563 (中科院微生物所提供)的诱变株，遗传标记为AECr, Hom-。
1.2主要培养基1.2.1斜面种子培养基牛肉膏1.1%, 蛋白胨1.0%, 葡萄糖0.5%, NaCl 0.5%, 琼脂0.2%, pH7.0, 在0.14mpa压力下灭菌20min, 后置于37 ℃培养箱培养24h, 备用。
ε-聚赖氨酸高产菌株选育及分批发酵的研究
ε-聚赖氨酸高产菌株选育及分批发酵的研究
陈玮玮;朱宏阳;徐虹
【期刊名称】《工业微生物》
【年(卷),期】2007(37)2
【摘要】以北里孢菌(Kitasatospora sp.)PL6-3为出发菌株,经硫酸二乙酯诱变,获得遗传性能稳定的AECr突变株MY5-36.MY5-36摇瓶发酵产ε-聚赖氨酸达1.17 g/L,是出发株PL6-3的3倍;5 L发酵罐批式发酵产酸达7.72 g/L,较出发菌株提高了7倍以上.与PL6-3相比,MY5-36菌株形态发生了很大变化,菌丝和孢子颜色都发生了改变.
【总页数】3页(P28-30)
【作者】陈玮玮;朱宏阳;徐虹
【作者单位】南京工业大学制药与生命科学学院,南京,210009;南京工业大学制药与生命科学学院,南京,210009;南京工业大学制药与生命科学学院,南京,210009【正文语种】中文
【中图分类】TS2
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赖氨酸高产菌株的选育[摘要]：赖氨酸作为一种重要的饲料用氨基酸，需求量一直在不断增长。
传统的赖氨酸生产菌株都是多年来是经过多轮随机突变和筛选得到，而近年来随着基因重组技术的发展及对生物代谢过程的了解，人们已经能够通过基因重组技术，改变代谢途径，提高赖氨酸产量。
目前有不少成功将野生菌株改造为高产菌株的案例，他们都可以作为合理设计代谢途径并结合各种组学进行微生物代谢途径改造的基础。
本文主要描述通过代谢途径改造并结合高通量筛选技术，快速得到赖氨酸高产菌株的方法。
[关键词]：赖氨酸菌种选育基因改造高通量筛选中图分类号：x-1 文献标识码：x 文章编号：1009-914x （2012）12- 0052 -03l-赖氨酸作为人体和动物所必需的氨基酸之一，被广泛用于饲料、添加剂、食品强化剂和医药产品等方面。
随着l-赖氨酸的需求量急剧增加，l-赖氨酸的生产开发需要进一步的研究，而选育出优良菌种是其技术的关键。
在正常生理条件下，微生物依靠其代谢调节系统，趋向于快速生长和繁殖。
但发酵工业需要培养微生物使其积累大量赖氨酸。
所以要采取种种措施打破微生物的正常代谢，积累更多的赖氨酸。
菌种选育的目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求。
一个合适的赖氨酸高产菌株应该具备以下几点：能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，生成的目的产物产量高、易于回收；生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；培养条件易于控制；抗噬菌体及杂菌污染的能力强；菌种不易变异退化；对放大设备的适应性强；菌种不是病原菌，不产生有害的生物活性物质和毒素。
在菌种选育中，若采用传统的诱变育种或杂交育种[1，2]，微生物可遗传的特性发生变化称变异，是微生物产生变种的根源，也是育种的基础。
自然突变是指在自然条件下出现的基因变化。
但自发突变的频率较低，往往不能符合工业生产的要求。
因此要利用诱变剂提高菌种的突变频率。
虽然人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，速度快，方法简便，但是由于基因突变为随机突变，必须与大规模的筛选工作相配合，因此会消耗大量的人力物力进行筛选；原生质体融合技术可以使一些未发现有转化、转导和结合等现象的原核生物之间，以及微生物不同种、属、科甚至更远缘的微生物细胞进行融合，得到新物种。
但是原生质体融合难度较大，并非每次都能够成功[3]。
目前菌种选择的总趋势是由自然选育向代谢控制育种，诱发基因突变向基因重组的定向育种转变。
基因工程育种包括所有的利用dna重组技术将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得某些优良性状或利用后者作为表达场所来生产目的产物。
由于大肠杆菌是单细胞，结构简单，生长速度快，培养简单，遗传背景清楚等优点，所以比较容易进行基因工程改造。
1、菌种改造由于细胞内的代谢不是一个孤立的过程，而是一个相互联系的网络，网络之间会相互制约，因此目前在对菌株进行基因改造时，往往不是仅仅对某个基因进行单独的改造，而是对目的产物形成过程中一系列相关基因进行改造。
如赖氨酸合成相关基因的过量表达、提高表达产物的活性、降低支路代谢基因拷贝数、降低基因表达产物的活性等等措施。
增加细胞膜的通透性、增强目的产物向胞外的运输、降低支路代谢的代谢流、弱化关键酶对终产物反馈抑制的敏感度等都有助于目的产物的积累。
因此为了提高赖氨酸产量，增加工程菌菌株的稳定性，一般要做到以下几点中的一点或几点。
1.1过量表达赖氨酸合成相关基因菌株细胞内过量表达赖氨酸合成相关酶基因，可以增加赖氨酸合成代谢流，直接增加赖氨酸的积累。
菌株过量表达的基因：dapa 基因（二氢吡啶二羧酸合酶基因）、dapb基因（二氢吡啶二羧酸还原酶基因）、dape基因（琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰化酶基因）、lysc基因（天冬氨酸激酶基因）、lyse基因（赖氨酸输送蛋白基因）、pyc基因（丙酮酸羧化酶基因）、gap基因（甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因）基因中的一个或多个。
通过增加pyc基因和lyse基因的拷贝数和改变dapa基因的启动子来实现基因的超量表达[4-7]。
同时资料还显示：对于给定的pyc基因，dapa、dapb及lysc基因同时也过量表达对赖氨酸生产格外有利[4]。
1.2降低支路代谢流过量表达赖氨酸合成途径中的关键基因会增加赖氨酸的表达量。
同时资料还显示：降低支路代谢相关酶的表达量或活性或敲除支路代谢相关基因构建营养缺陷性同样会增加赖氨酸的表达量[7，8]。
降低糖异生代谢途径流量，利用一个弱的启动子或编码相应的具有低活性的酶的基因或等位基因来实现pck基因（磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶）、pgi基因（葡萄糖-6-磷酸异构酶）的弱化[7]。
降低由天冬氨酸半醛生成高丝氨酸的量，继而蛋氨酸、苏氨酸的合成量也会降低，生成的thr的量不足以与lys共同对天冬氨酸激酶（ak）起协同反馈抑制作用[8]（在分支代谢途径中，几种末端产物同时都过量，才对途径中的第一个酶具有抑制作用，若某一末端产物单独过量则对途径中的第一个酶无抑制作用。
l-赖氨酸和l-苏氨酸对天冬氨酸激酶有协同反馈抑制作用）都有助于赖氨酸的积累。
1.3解除抑制作用lysc基因和dapa基因分别编码天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合酶，分别催化天冬氨酸转变为天冬氨酰磷酸、天冬氨酸半醛转变为二氢吡啶二羧酸。
在大肠杆菌中天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合酶都受到赖氨酸的反馈抑制作用，而在谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌中天冬氨酸激酶受到赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制，但二氢吡啶二羧酸合酶不受赖氨酸的反馈调节作用。
为了解除赖氨酸和/或苏氨酸对dapa基因和lysc基因的反馈抑制作用，在将dapa基因和lysc基因导入菌株之前，需要对基因序列进行定点突变，改变基因的编码序列，使其编码的蛋白性质改变，从而对赖氨酸的反馈抑制作用脱敏[6，9-11]。
在生产中得到证实并应用的突变体有很多如：棒状杆菌lysc基因编码反馈抗性形式的天冬氨酸激酶[10]，蛋白突变位点为a279t，a279v，s301f，t308i，s301y，g345d，r320g，t311i，s381f中的一个或多个。
大肠杆菌lysc基因ⅲ（天冬氨酸激酶基因ⅲ）对l-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变体[6]，其突变位点：d323g，d323g/d408g，c34r/d323g，f325l，i318m， i318m/m349v，l345s，m347v，i352t，i352t/f369s，k164e，i417m/y419c。
来自大肠杆菌的dapa基因（二氢吡啶二羧酸合酶基因）突变体[6，11]，使二氢吡啶二羧酸合酶对l-赖氨酸的反馈抑制脱敏：v81a，y118h，v81a/y118h。
1.4改善细胞膜的通透性改善细胞膜的透过机能，如在细胞内过量表达lyse基因（赖氨酸输送蛋白基因）有助于微生物胞内合成的赖氨酸向胞外运输，降低胞内赖氨酸含量[6]，进一步减弱l-赖氨酸和l-苏氨酸对赖氨酸合成的协同反馈抑制作用，增加赖氨酸的产量，同时有利于产品的后续加工。
1.5整合基因通过附加型质粒扩增特定微生物中某些生物合成基因，其缺点为发酵期间所述质粒可能会丧失，同时需要添加外源的抗生素来维持选择压力。
若将赖氨酸合成相关基因整合到大肠杆菌基因组中，使大肠杆菌中除天然位点含有编码l-赖氨酸合成相关蛋白的基因至少一个拷贝外，还在其他任选位点含有整合进染色体的这种开放阅读框、基因或等位基因的第二个、第三个或第四个拷贝。
这样外源基因就不会在大肠杆菌的复制过程中丢失，同时也不需要添加外源的抗生素来维持选择压力[12]。
2、菌种筛选在上述的不管是对菌株进行基因工程的改造，还是通过紫外线、化学诱变剂进行诱变育种，还是对新菌株进行培养基优化都无法绕开大量繁琐的筛选工作，他们都需要进行大量的摇瓶实验。
但是摇瓶实验筛选工作量大，周期长和成本高，难以达到工业化生产的要求，因此应寻找一种能够开展多参数的、与发酵工艺过程相结合的高通量菌种筛选技术和方法。
目前高通量筛选能够实现多参数在线检测功能，可同时测量ph 值、do、pco2、od等重要参数；在一台微反应器上集成的微发酵罐数可达6、1224、4896个不等，能够实现高通量分析功能；同时整个筛选的体积小，其体积一般小于100 ml，有的甚至小至5 μl。
此外，还有造价低、减少昂贵原材料消耗、降低劳动强度等优势[13]。
目前高通量筛选技术依然在改进，同时也越来越多的应用于高产菌株的筛选过程中，多篇报道也验证了高通量筛选在高产菌株筛选中的可行性[14-17]，建立了各种高产菌株高通量筛选方法，取得了一定的成果，为高产菌株的筛选节省了大量的人力物力财力，一步一步向工业化生产的要求靠近。
3、结语虽然采用合适的筛选方法，诱变育种可以获得高产菌株，但是微生物的自发突变和诱发突变都是随机的，因此不能达到定向育种的目的。
随着现代生物技术尤其是的dna重组技术的发展，使人们能够在分子水平上，根据需要，用人工方法取得供体dna上的基因，在体外重组于载体dna上，再转移入受体细胞，使其复制、转录和翻译，表达出供体基因原有的遗传性状，达到定向改良菌种的目的。
随着时间的推移，在对微生物进行基因改造时，越来越多的是从微生物的整体代谢来考虑，而不是仅仅去增强或减弱某一个基因，这主要是因为细胞的生化反应是一个网络整体，不是独立的，不应孤立地来考虑。
目前主要是利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰和改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，用以实现构建新的代谢途径，生产特定目的产物。
目前日本味之素、德国德古萨等公司已经将分子育种运用到生产中，并表现出明显的优势。
定向的菌种改良结合高通量的菌种筛选方法，极大的改变了传统的菌种选育方式，节约了人力物力，缩短了筛选周期，使菌种选育变得更加高效便捷。
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