磷酸化蛋白的富集

TiO2法磷酸化富集

试验：pH值对TiO2富集磷酸化蛋白的影响

共5个样品，各400ug蛋白（酶解之前），每个样品用1mg TiO2，共用5mg。流程：

1.TiO2 Beads 活化

①向10mg TiO2 Beads中加入1000 ul Elute buffer 2，震荡20min，8200×g，2min，离心，弃上清；

②更换wash buffer 1 1000ul，第一遍摇晃两次，弃上清；第二遍，震荡20min，弃上清；

③更换Loading buffer 1000ul，2遍震荡30min，最后TiO2 Beads保存在Loading buffer中。

2.酶解后的肽段溶液中加入TFA酸化，使TFA终浓度为0.1%—0.5%，离心浓缩抽干，之后重新用Loading buffer溶解（体积控制在400ul左右）。

3.每400ug蛋白用1mg TiO2 Beads 富集，将1mg TiO2 加入到一个样品中，室温旋转30min，转速1100转/分。

4.将孵育好的肽段溶液加入脱盐柱中，8200×g，2min，收集为Flow Through。

5.再向脱盐柱中加入200ul wash buffer 1，8200×g，2min，，重复3次，收集600ul。

6.再向脱盐柱中加入200ul wash buffer 2，8200×g，2min，，重复3次，收集600ul。

4、5、6合并到一起，为Flow Through。

7.再向脱盐柱中加入200ul Elute buffer 1，8200×g，2min，，重复2次，收集400ul，为elute1；再加入200ul Elute buffer 2，8200×g，2min，收集200ul，为elute 2；合并elute 1和elute 2，总共600ul磷酸化多肽。

8.离心浓缩干，复溶于0.1% FA中，上样。

试剂准备：

Loading buffer：35%乙醇酸溶液/65%ACN/2%TFA

—3.5mL饱和谷氨酸溶液/乙醇酸

—6.5mL ACN

—0.2mL TFA

wash buffer 1：65% ACN/0.5% TFA

wash buffer 2: 65% ACN/0.5% TFA

Elute buffer 1：300mM氨水/50% ACN

—H2O 19.1mL

—ACN 20mL

—浓氨水（25%）0.9mL

Elute buffer 2：500mM氨水/60% ACN

—H2O 14.4mL

—ACN 24mL

—浓氨水（25%） 1.6mL