磷酸化蛋白的富集
基于纳米结构材料的磷酸化蛋白_多肽富集和分析_程功
第25卷第4期2013年4月化学进展PROGRESS IN CHEMISTRYVol．25No．4Apr．2013收稿：2012年10月，收修改稿：2012年11月*国家自然科学基金项目（No．20871083，21171161）资助＊＊Corresponding authore-mail ：zjl@ciac．jl．cn基于纳米结构材料的磷酸化蛋白/多肽富集和分析*程功1王志刚1刘彦琳1张吉林1＊＊孙德慧3倪嘉缵1，2（1．中国科学院长春应用化学研究所稀土资源利用国家重点实验室长春130022；2．深圳大学生命科学学院深圳518060；3．长春工程学院长春130012）摘要蛋白质磷酸化是最为广泛的翻译后修饰之一。
在生物体液或组织中，许多低丰度的磷酸化蛋白和磷酸化肽是具有高度临床灵敏性和特异性的生物标记物，这些生物分子对许多疾病的检测和病理的阐释可能提供重要的信息。
因为蛋白质磷酸化动态可逆且磷酸化蛋白丰度很低，所以很难直接从复杂的生物样品中直接检测到磷酸化蛋白和磷酸化肽。
纳米结构材料因其大比表面积、丰富的活性亲合位点和特殊结构，在磷酸化肽和磷酸化蛋白的分离和富集方面已经引起了特别的关注，并成为目前磷酸化蛋白质组学富集和鉴定方面的研究热点。
许多介孔、磁性、杂化或化学修饰的亲合材料被研发并用于磷酸化蛋白/多肽的富集与分离；此外，一些多功能纳米结构材料也被研发并用于蛋白质组学中磷酸化蛋白/多肽的快速高效的富集提纯。
在这篇综述中，我们专注于纳米结构材料在磷酸化蛋白/多肽富集和提纯方面的最新进展。
关键词纳米结构亲和材料磷酸化蛋白磷酸化肽生物分离富集中图分类号：O612.6；Q816；R914.3文献标识码：A文章编号：1005-281X （2013）04-0620-13Phosphoprotein /Phosphopeptide Enrichment and AnalysisBased on Nanostructured MaterialsCheng Gong 1Wang Zhigang 1Liu Yanlin 1Zhang Jilin 1＊＊Sun Dehui 3Ni Jiazuan 1，2（1．State Key Laboratory of Rare Earth Resource Utilization ，Changchun Institute of Applied Chemistry ，Chinese Academy of Sciences ，Changchun 130022，China ；2．College of Life Sciences ，Shenzhen University ，Shenzhen 518060，China ；3．Changchun Institute of Technology ，Changchun 130012，China ）AbstractProtein phosphorylation is one of the most ubiquitous post-translational modifications．Many low-abundance endogenous phosphoproteins and phosphopeptides in the body fluids or tissues are biomarkers with higher clinical sensitivity and specificity ，which could provide valuable information for the detection of many diseases and elucidation of pathology．It is still a great challenge to detect the phosphoproteins and phosphopeptides from complex biological samples directly due to reversibility of protein phosphorylation and the extremely low concentrations of phosphoproteins．Nanostructured materials have attracted particular attentions in enrichment ，separation ，and purification of phosphoproteins /phosphopeptides due to their larger surface area ，numerous affinity sites and unique structures．The research subject has become one of research hotspots in phosphoproteomics presently．Various multifunctional nanostructured materials such as core-shell particles with mesoporous affinity shell and magnetic core ，hybrids of multiple components and composite affinity materials have been synthesized for selective enrichment and fast purification of phosphoproteins /phosphopeptides．In this review ，we are focusing on第4期程功等基于纳米结构材料的磷酸化蛋白/多肽富集和分析·621·recent advancements of nanostructured materials for phosphoprotein/phosphopeptide enrichment and purification prior to MS analysis．Definition，structure characteristic，unique physicochemical properties and potential in bio-separation of the nanostructured materials are first introduced．Subsequently，the related research background on phosphoproteomic studies in proteomics using mass spectrometric strategies in combination with phosphospecific enrichment techniques is briefly presented．After that，two types of affinity enrichment mechanisms to phosphoproteins/phosphopeptides are compactly discussed．Next，mesoporous，hybrid，and composite nanostructured materials for enrichment of phosphoproteins/phosphopeptides as well as application of multifunctional nanostructured materials in phosphoproteomics are summarized in detail．Finally，some unsolved problems and a brief perspective and outlook on phosphopeptide enrichment are proposed．Key words nanostructure；affinity materials；phosphoproteins；phosphopeptides；bioseparation；enrichmentContents1Introduction2Protein phosphorylation and enrichment detection of phosphoproteins/phosphopeptides2.1Protein phosphorylation2.2Enrichment detection of phosphoproteins/phosphopeptides3Mechanism of affinity enrichment of phosphoproteins/phosphopeptides4Mesoporous nanostructured materials for enrichment of phosphoproteins/phosphopeptides4.1Mesoporous SiO2nanostructured materials with immobilized affinity material4.2Mesoporous nanostructured materials doped withaffinity material4.3Mesoporous metal oxide nanostructured materials 5Composite nanostructured materials for enrichment of phosphoproteins/phosphopeptides5.1Magnetic core-shell nanostructured materials5.2Mesoporous magnetic nanostructured materials 5.3Hybrid composite nanostructured materials6Application of multifunctional nanostructured materials in phosphoproteomics6.1Multifunctional nanostructured materials for fastproteolysis and phosphopeptide enrichment6.2Multifunctional nanostructured materials forenrichment and identification of phosphopeptides 6.3Multifunctional nanostructured materials forenrichment of various biomolecules6.4Nanostructured materials modified target plate foron-plate enrichment and analysis ofphosphopeptides 7Conclusions and outlook1引言纳米结构材料一般认为是由纳米尺度的物质单元所构筑的纳米结构体系。
磷酸化蛋白质组学常用分析和定量方法
蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。
蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。
目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。
在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。
磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。
鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。
用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。
在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来.1.1 免疫亲和色谱富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。
目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。
这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。
Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。
由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。
磷酸化定量蛋白质组学
百泰派克生物科技
磷酸化定量蛋白质组学
质谱可以用于磷酸化蛋白质组的定性，也可以用于磷酸化蛋白质组的定量研究。
百泰派克生物科技提供基于质谱的磷酸化定量蛋白组学研究服务。
磷酸化定量蛋白质组学
磷酸化定量蛋白质组学指在组学水平上对磷酸化蛋白质进行定量分析。
磷酸化蛋白质是由蛋白激酶将ATP或GTP分子上的磷酸基团转移到底物蛋白特定的氨基酸侧链上形成的。
蛋白质磷酸化是一种可逆的蛋白质翻译后修饰。
在哺乳动物的细胞生命周期中，至少有三分之一的蛋白质发生磷酸化修饰。
磷酸化修饰参与许多信号转导途径和细胞代谢过程，且许多已知的疾病也与蛋白质的异常磷酸化有关。
因此，对磷酸化蛋白质组进行定量研究，寻找差异表达的磷酸化蛋白质，有助于发现疾病的生物标志物和寻找新的具有治疗潜力的药物靶标。
磷酸化定量蛋白质组学。
蛋白质组磷酸化定量分析方法
由于磷酸化蛋白质在生物样本中含量低、动态范围广，利用定量蛋白组学分析手段对磷酸化蛋白质样品进行定量分析前，需要先对磷酸化蛋白质进行富集从而提高其丰度。
常用的磷酸化蛋白质/肽段的富集方法包括免疫亲和色谱、金属亲和色谱（IMAC）以及TiO2色谱。
在质谱定量磷酸蛋白组学分析中，除了多一步富集步骤之外，其他步骤与一般定量蛋白质组学的步骤类似。
磷酸化蛋白质组研究中的富集策略
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ｅ ｐ ｎ ｅ ｏ ｈ ｓ ｈ ｐ ｐ ｉ ｉ ｌ．Ｔ ｔ ｄ ｃ ｒｅ ｔ ａ ａｌ ｅ ｆ ｒ ｔ ｅ ｒ ｈ ｎ ｔａｅ ｉ ｓ ｎ ｌ ｄ ｎ ｓｎ ｉ ｄ ｒ ｓ ｏ ｓ ｆ ｐ ｏ ｐ ｏ ｅ ｔ ｅ ｓｇ ａ ｓ ｈ ｅ ｍｅ ｏ ｓ ｕ ｒ ｎ ｌ ｖ ｉ ｌ ｏ ｅ ｎ ｃ ｍｅ ｔ ｓｒ ｔｇｅ ，ｉ ｃ ｕ ｉｇ ｕ ｉ ｇ ａ ｔ ｏ — ｄ ｎ ｈ ｙ ｂ ａ ｈ ｉ ｎ ｂ ｉｓ ｉ ｅ ， ｍｍｏ ｉ ｚ ｄ ｍｅａ ｆｉ ｉ ｈ ｍａｏ ｒ ｐ ｙ ａ ｄ ｍｅ ａ ｘ ｄ ／ ｙ ｒ ｘ ｄ ｆｉｉ ｈ ｍａｏ ｒ ｐ ｙ ｗｅ ｅ ｕ ｂｌ ｅ ｔ ｌ ａ ｎ ｔ ｃ ｒ ｉ ｙ ｏ ｔｇ ａ ｈ ｎ ｔｌ ｏ ｉ ｅ ｈ ｄ ｉ ｅ ａ ｎ ｔ ｃ ｒ ｏ ｙ ｏ ｔｇ ａ ｈ ｒ ｓ ｍｍａ ｚ ｄ ｉ ｈ ｓ ｉ ｒ ｅ ｎ ｔｉ
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(完整word版)生物质谱分析蛋白质磷酸化位点
磷酸化蛋白的高效富集在线酶解与快速鉴定项目申请人：袁敏婷黄懿指导教师：杨芃原摘要：蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于阐明蛋白质磷酸化的机制与功能。
生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一，但由于蛋白质磷酸化的丰度低以及磷酸化的肽段离子化效率低，在质谱分析前，依然需要结合富集或分离的步骤。
本作品旨在利用四氧化三铁磁性纳米材料对磷酸化肽或蛋白快速高效的特异性吸附，结合在线酶解技术的快速，高序列覆盖度特性构建一个快速，高效鉴定分析磷酸化蛋白的新技术。
关键词：蛋白质磷酸化；Fe3O4磁性材料富集；在线酶解1.引言蛋白质的翻译后修饰（PTMs）是目前蛋白质组研究中的一个重要课题。
蛋白质磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式，它几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。
了解蛋白质磷酸化对功能的影响可深入理解生命系统如何在分子水平进行调控。
据统计，在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，而脊椎动物基因组中有5%的基因编码蛋白激酶或磷酸酯酶。
对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。
蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质组学研究更为复杂。
真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，其比例大概为1800∶200∶1。
大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。
因此,一种蛋白可能有多种磷酸化形式。
对单一蛋白质进行研究的传统方法远不能满足分析这一层面上蛋白质的多样性和复杂性的需要，用蛋白质组技术和生物信息学高通量地研究翻译后蛋白质的修饰已成为必然趋势。
虽然对磷酸化蛋白质组学分析已有很大进步，但依然存在多个难点亟待解决包括磷酸化蛋白和肽段的富集，可逆性磷酸化位点的鉴定以及磷酸化位点的定量等。
在过去几十年中已有多种分离和鉴定蛋白质磷酸化的技术发展起来，包括放射性同位素标记、免疫沉淀反应、化学修饰、固定金属离子亲合色谱法等，而生物质谱技术已经成为磷酸化蛋白鉴定的主要工具，串联质谱更是可以高通量，快速的给出详细的磷酸化位点。
磷酸化组学分析技术
百泰派克生物科技磷酸化组学分析技术磷酸化蛋白质组（Phosphoproteome）就是蛋白质组中全部的磷酸化蛋白质，而磷酸化蛋白质组学（Phosphoproteomics）就是针对磷酸化蛋白质的全面分析，包括对磷酸化的定性、定位和定量。
磷酸化蛋白质组学分析技术主要与质谱技术相结合进行分析，分析流程包括样品中提取蛋并酶解成肽段，之后利用固定金属离子亲和色谱法（IMAC）、二氧化钛亲和色谱法（TiO2）等方法富集磷酸化肽段，最后联合质谱检测技术进行分析。
常用的质谱定量磷酸化蛋白质组学分析技术主要包括TMT（Tandem Mass Tag），LFQ（Label Free Quantitation）和DIA（Data Independent Acquisition）技术。
TMT定量：TMT是添加同位素标记的一种定量技术，TMT除了可以应用在全蛋白质组的鉴定以外，也可以用于磷酸化蛋白质组学分析。
目前经过后期改进，TMT技术最多能同时对16个样品进行标记分析，消除多批次标记不平行问题，进一步减少定量数据丢失，准确性高。
LFQ非标记定量：LFQ磷酸化蛋白质组学，其利用基于质谱的非标记定量技术研究磷酸化蛋白质组，可实现磷酸化蛋白质组的定性和定量鉴定。
LFQ和TMT标记定量相比，非标记定量操作简单，样品损失小，单次实验可定量到的蛋白数目更多。
但由于非标记定量依据一级谱图的峰强度或者峰面积，所以数据质量是关键，严重依赖于质谱仪的稳定性。
DIA：DIA数据非依赖采集模式，是一种质谱分析中使用的数据采集模式，由于DIA 数据采集窗口更宽，谱图更为复杂，想要在混合的谱图中正确定位磷酸化位点并且正确处理磷酸肽位置异构体，对谱图处理能力需要达到更高的要求。
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台，Orbitrap Fusion质谱平台，Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，推出磷酸化定量蛋白组分析服务技术包裹。
磷酸化肽段富集方法
磷酸化肽段富集方法
磷酸化是一种重要的蛋白质修饰方式，在细胞信号传导、基因转录调控、细胞凋亡等生物学过程中都发挥着重要作用。
因此，研究磷酸化蛋白质及其在生物学过程中的功能十分重要。
磷酸化肽段富集方法是一种常用的技术，可以使得磷酸化肽段的比例提高，从而更方便地进行质谱分析和生物学功能研究。
磷酸化肽段富集方法的原理是基于亲和吸附，将磷酸化肽段与非磷酸化肽段进行分离。
常见的富集方法包括IMAC（金属离子亲和层析）、TiO2（钛离子亲和层析）、MOAC（磷酸酯酶结合富集）等。
其中，IMAC是最常用的富集方法之一，它利用金属离子与磷酸基团之间的亲和力使得磷酸化肽段与非磷酸化肽段分离。
TiO2富集方法则利用钛离子与磷酸基团之间的亲和力分离磷酸化肽段。
MOAC则利用磷酸酯酶结合具有磷酸化基团的肽段，从而分离磷酸化肽段。
磷酸化肽段富集方法可以用于分离磷酸化肽段，并用质谱等方法鉴定磷酸化位点，进而深入探究磷酸化修饰在生物学过程中的作用机制，为研究磷酸化蛋白质及其生物学功能提供了有力的工具。
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磷酸化蛋白表达
磷酸化蛋白表达
磷酸化蛋白是指蛋白质上发生磷酸化修饰的蛋白质分子。
磷酸化是一种生物化学过程，通过这个过程，磷酸基团被添加到蛋白质上，从而改变其结构和功能。
磷酸化可以调节蛋白质的结构、功能和相互作用，进而影响细胞的生理和病理过程。
磷酸化蛋白在细胞信号传导、细胞增殖、细胞凋亡等过程中起着重要的调控作用。
磷酸化蛋白表达谱分析是通过高通量技术来分析细胞中磷酸化蛋白的表达水平和位置。
常用的方法包括质谱分析、免疫沉淀、蛋白芯片等。
质谱分析可以鉴定和定量磷酸化蛋白，免疫沉淀可以富集磷酸化蛋白，蛋白芯片则可以快速筛选和分析磷酸化蛋白。
例如，cAMP反应元件结合蛋白（CREB）作为核转录因子家族中的一员，在神经系统应激性损伤（如缺氧、紫外线、高渗透压等）中，活化（磷酸化）的CREB可直接或间接激活相关基因的转录，进而表达某些蛋白分子（如c-Fos、Jun-B、bcl-2等）和某些神经营养因子（如神经生长因子和脑源性
神经营养因子等）。
这些基因产物调节着神经元在应激性损伤后再生、存活及修复等，从而为神经元提供保护作用。
磷酸化蛋白组学流程
磷酸化蛋白组学流程磷酸化是一种重要的蛋白质修饰形式，广泛参与细胞信号传导、细胞周期调控、代谢调节等生命过程。
磷酸化蛋白组学流程是分析全细胞或其中一类蛋白质的磷酸化修饰，并研究其在生物学过程中的功能和作用机制。
本文将介绍磷酸化蛋白组学的流程，包括样品准备、蛋白质提取、磷酸化蛋白质富集、质谱分析和数据分析等步骤。
1.样品准备2.蛋白质提取蛋白质提取是磷酸化蛋白组学的关键步骤之一、常用的提取方法包括裂解法和沉淀法。
裂解法是将细胞或组织破碎，释放蛋白质，并包括蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂以防止蛋白质降解和磷酸化的丧失。
沉淀法是通过高速离心将细胞或组织碎片沉淀下来，得到富含蛋白质的沉淀物。
在蛋白质提取过程中，需要注意使用适当的提取缓冲液和提取条件，以确保蛋白质磷酸化修饰的完整性。
3.磷酸化蛋白质富集磷酸化蛋白质富集是磷酸化蛋白组学的核心步骤。
由于磷酸化修饰只占蛋白质总量的一小部分，需要进行富集来提高磷酸化蛋白质的检测灵敏度。
常用的富集方法包括免疫沉淀法、亲和层析法和磷酸酸化蛋白质富集法。
免疫沉淀法是利用抗体与目标蛋白质结合，然后通过蛋白A或蛋白G纯化复合物，最后将目标蛋白质从抗体上解离。
亲和层析法是利用特定结合结构域与磷酸酸化蛋白质结合，然后通过洗脱来收集磷酸化蛋白质。
磷酸酸化蛋白质富集法是利用金属离子亲和层析来富集磷酸酸化蛋白质，常用的金属离子包括铁、锰和钛等。
4.质谱分析质谱分析是磷酸化蛋白组学的核心技术之一、常用的质谱技术包括液相色谱质谱联用（LC-MS/MS）和质谱成像。
液相色谱质谱联用是将富集的磷酸化蛋白质通过分离柱进行分离，并通过质谱仪分析其质量和结构信息。
质谱成像是将组织切片放在质谱仪上，通过激光扫描和质谱分析来获取组织中磷酸化蛋白质的空间分布信息。
5.数据分析数据分析是磷酸化蛋白组学流程的最后一步。
主要包括分析蛋白质鉴定和定量结果、磷酸化位点的鉴定和定量、差异蛋白质和差异磷酸化位点的统计学分析等。
磷酸化蛋白质组如何鉴定
磷酸化蛋白质组如何鉴定磷酸化蛋白质（Phosphorylated protein）是指在特定氨基酸残基上附加了一个磷酸基团（PO4）的蛋白质。
磷酸化是一种重要的蛋白质修饰方式，可以调节蛋白质的结构、功能和相互作用，进而控制细胞的信号转导、代谢和增殖等生物学过程。
因此，鉴定磷酸化蛋白质组对于理解蛋白质调控网络具有重要意义。
本文将介绍几种常用的磷酸化蛋白质组鉴定方法。
一、质谱法质谱法是目前最常用的鉴定磷酸化蛋白质组的方法之一，主要分为两种：质谱分析前磷酸化富集和质谱分析后磷酸化识别。
1.质谱分析前磷酸化富集质谱分析前磷酸化富集主要包括亲和富集、非亲和富集和凝胶富集等。
亲和富集是利用特定亲和剂与磷酸化蛋白质结合，然后用洗脱剂将磷酸化蛋白质洗脱出来进行质谱分析。
常用的亲和剂有磷酸化特异性抗体、磷酸化结合结构域和亲和岛等。
非亲和富集是利用质谱分析前的蛋白质化学改变，如巯基化、新生代谢标记等来增加磷酸化蛋白质的质谱分析信号，进而富集磷酸化蛋白质。
凝胶富集是将细胞提取物先进行电泳分离，然后使用聚焦法将不同等电点区域的蛋白质提取，再进行质谱分析。
2.质谱分析后磷酸化识别质谱分析后磷酸化识别主要通过质谱数据分析软件来鉴定磷酸化位点。
质谱分析常用的方法包括肽段质谱法、质谱配对法和磷酸化肽酶法等。
其中，肽段质谱法是将蛋白质经酶切分解成肽段后进行质谱分析，通过质谱数据分析鉴定磷酸化位点；质谱配对法是对酶切后的肽段进行残基识别和质谱数据匹配，进而确定磷酸化位点；磷酸化肽酶法是酶切肽段后通过特定的肽酶去除非磷酸化肽段，进而富集磷酸化肽段进行质谱分析。
二、免疫化学检测法免疫化学检测法是利用抗体与磷酸化蛋白质特异性结合，并使用标记物进行检测的方法。
常用的免疫化学检测方法有免疫印迹、免疫荧光和免疫组化等。
1.免疫印迹免疫印迹是利用抗体与磷酸化蛋白质特异性结合，然后使用辅助抗体与标记物结合，通过酶学反应或化学发光的方式检测磷酸化蛋白质的存在。
磷酸化蛋白操作流程
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磷酸化蛋白组的差异统计方法
磷酸化蛋白组的差异统计方法
磷酸化蛋白组的差异统计方法主要包括以下步骤：
1. 磷酸化肽段鉴定及统计：通过搜库、校正、筛选、磷酸化肽段统计、磷酸化蛋白统计和磷酸化位点统计等步骤，从样品中提取磷酸化蛋白，酶解成肽段，再富集出有磷酸化修饰的肽段，以肽段为单位进行分析。
2. 磷酸化蛋白的差异分析：对于两个组学的数据，通常有两种关联方式。
一是用全蛋白质丰度校正磷酸化肽段丰度，即用磷酸化肽段的丰度除以对应蛋白质的丰度，再进行差异磷酸化的分析，对二者均鉴定的差异蛋白数量进行统计，找出重叠的蛋白。
二是二者分别做差异分析，用中位数分别校正丰度，再将整体的差异倍数进行比较，差异倍数更大的才是丰度变化的主因。
3. 磷酸化蛋白的功能分析：统计这些差异蛋白富集结果，进一步分析这些蛋白的磷酸化的变化影响了哪些分子通路的改变，进而分析在实验处理下，分子机制的改变。
以上信息仅供参考，建议咨询专业人士获取更准确的信息。
tca中底物水平磷酸化的步骤
tca中底物水平磷酸化的步骤
TCA（三氯乙酸）沉淀法是一种用于蛋白质沉淀和富集的常用方法。
在进行TCA沉淀的过程中，蛋白质会被沉淀下来，而底物的水平磷酸化则可以通过以下步骤实现：
1. 细胞裂解，首先需要将含有底物的细胞或组织进行裂解，以释放细胞内的蛋白质和其他生物分子。
2. 底物富集，接下来，可以使用特定的抗体或亲和层析柱等手段来富集含有磷酸化底物的蛋白质。
这一步骤可以帮助我们将感兴趣的磷酸化蛋白质从混合物中分离出来。
3. TCA沉淀，将富集后的蛋白质溶液加入三氯乙酸（TCA），通过TCA的沉淀作用，蛋白质会沉淀下来，而底物的磷酸化状态也会得到保留。
4. 洗涤，沉淀后的蛋白质需要进行洗涤，以去除多余的TCA和其他杂质。
5. 蛋白质溶解，最后，沉淀的蛋白质可以通过加入适当的蛋白
质溶解液来溶解，以便进行后续的分析，如免疫印迹、质谱分析等。
需要注意的是，TCA沉淀法虽然可以用于蛋白质的富集和分离，但在进行实验时需要注意操作细节，以确保底物的磷酸化状态不受
到影响。
另外，实验中还需要使用一些辅助试剂和设备，如磷酸化
特异性抗体、低温离心机等，以确保实验的准确性和可靠性。
磷酸化组学 dia
磷酸化组学 dia
磷酸化组学（phosphoproteomics）是一种研究蛋白质磷酸化的方法，它能够帮助科学家更好地理解细胞信号传导网络和蛋白质功能调控。
磷酸化是一种重要的蛋白质修饰形式，能够调控蛋白质的活性、稳定性、亚细胞定位以及相互作用等多种生物学功能。
磷酸化组学通过大规模分析蛋白质中的磷酸化位点，可以揭示细胞信号传导网络的复杂性，有助于揭示疾病发生发展的分子机制，以及发现新的生物标志物和药物靶点。
磷酸化组学技术通常包括蛋白质的分离和富集、质谱分析、数据处理和生物信息学分析等步骤。
在蛋白质的分离和富集过程中，常用的方法包括免疫沉淀、亲和层析、磷酸化肽的富集等。
质谱分析是磷酸化组学的关键步骤，常用的质谱技术包括液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）和磷酸化肽质谱法（phosphopeptide mapping）。
数据处理和生物信息学分析则涉及到对大量质谱数据的处理、磷酸化位点的鉴定和定量分析，以及与蛋白质相互作用网络的构建等内容。
磷酸化组学在癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等多种疾病的研究中发挥着重要作用。
通过磷酸化组学的技术手段，科学家们
可以发现与疾病相关的磷酸化位点，从而深入理解疾病发生发展的分子机制，并寻找新的治疗靶点。
此外，磷酸化组学还可以帮助研究者理解细胞信号传导网络的复杂性，揭示蛋白质相互作用网络，为生物学研究提供重要的信息。
总之，磷酸化组学是一种重要的蛋白质组学方法，通过全面分析蛋白质中的磷酸化位点，可以深入理解细胞信号传导网络和蛋白质功能调控的机制，为疾病研究和药物开发提供重要的帮助。
蛋白磷酸化实验方法
蛋白磷酸化实验方法蛋白磷酸化实验方法主要包括以下几种：1. Western blot：这是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法，利用SDS-PAGE分离生物样品，随后转移到膜上(通常是PVDF或尼龙膜)，之后利用磷酸化特异的抗体来鉴定目的蛋白。
2. 放射性标记法：先用32P标记ATP，通过细胞代谢标记到磷酸化蛋白质上，再经一维或二维凝胶电泳或色谱法进行分离，最后通过放射自显影进行检测。
3. 免疫印迹法：基于抗体特异性结合抗原的原理，利用抗磷酸化氨基酸抗体与电泳分离得到的磷酸化蛋白质进行免疫印迹反应来检测磷酸化蛋白质。
在实验中，通常将免疫印迹与免疫沉淀结合使用，因为磷酸化蛋白质的含量较低，先利用免疫沉淀法对磷酸化蛋白质进行富集，可以降低非磷酸化蛋白质的干扰。
4. 荧光染色法：利用荧光染料直接对凝胶中结合在酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基上的磷酸进行选择性染色，再通过荧光扫描仪检测就能直接鉴别出磷酸化的蛋白质。
5. 质谱法：首先将含磷酸化修饰的蛋白样品进行酶切，然后对酸化肽段进行富集，再将富集得到的磷酸化肽段进行串联质谱分析，最后利用质谱数据结合生物信息学分析对磷酸化蛋白质进行鉴定。
6. ELISA：ELISA已逐渐成为测定蛋白磷酸化的一种有力方法。
这种微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特异的捕获抗体，与磷酸化状态无关。
随后让目的蛋白结合在抗体包被的分析板中，目的蛋白可以是纯的，也可以是复杂的异质样品(如细胞裂解液)中的一个组分。
加入待分析的磷酸化位点特异的检测抗体。
这些分析通常设计为显色或荧光检测。
产生的信号强度与最初样品中存在的磷酸化蛋白的浓度成正比。
与更为传统的免疫印迹相比，磷酸化特异的ELISA技术具有一些优点。
首先，利用经过校准的标准品，可轻松定量结果。
其次，以三明治形式使用目的蛋白特异的两个抗体，带来了高的特异性。
第三，ELISA的灵敏度更高允许使用更少量样品，检测低丰度的蛋白。
最后，微孔板形式的通量比传统的Western blotting要高得多。
磷酸化蛋白组学流程
磷酸化蛋白组学流程磷酸化蛋白组学是一种用于研究蛋白质磷酸化修饰的技术，它可以帮助我们了解蛋白质的功能和调节机制。
本文将介绍磷酸化蛋白组学的流程，从样品准备到数据分析，逐步展示这一技术的应用过程。
一、样品准备磷酸化蛋白组学的第一步是样品准备。
通常，我们需要从细胞或组织中提取蛋白质，并通过蛋白质定量测量蛋白质的浓度。
接下来，我们将样品进行降解，以释放出蛋白质中的磷酸化肽段。
这可以通过酶切或酸性水解等方法来实现。
二、富集磷酸化肽在样品准备之后，我们需要富集磷酸化肽，使其占据样品中的主要比例。
这可以通过亲和层析、离子交换层析或亲水性交换层析等技术来实现。
富集后的磷酸化肽可以通过质谱仪进行分析。
三、质谱分析质谱分析是磷酸化蛋白组学的核心环节。
在这一步骤中，我们使用质谱仪来检测磷酸化肽的存在和定量。
质谱仪可以将磷酸化肽分离并进行鉴定，常用的方法包括液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和飞行时间质谱（TOF-MS）等。
四、数据分析质谱分析完成后，我们需要对得到的数据进行处理和分析。
首先，我们需要对质谱数据进行预处理，包括峰提取、去噪和校正等。
然后，通过数据库比对，将质谱数据与已知的蛋白质序列进行匹配，以鉴定磷酸化蛋白。
最后，我们可以利用生物信息学工具对数据进行功能注释和通路分析，以揭示磷酸化蛋白的生物学意义和调控机制。
磷酸化蛋白组学流程的实施需要高度的技术和专业知识。
在整个流程中，我们需要严格控制实验条件，以确保结果的准确性和可重复性。
此外，我们还需要不断更新和改进分析方法，以适应不同研究需求和科学发展的要求。
磷酸化蛋白组学是一种重要的研究技术，它可以帮助我们深入了解蛋白质的磷酸化修饰及其在生物学过程中的功能和调控机制。
通过样品准备、富集磷酸化肽、质谱分析和数据分析等步骤，我们可以获取有关磷酸化蛋白的全面信息，为生命科学研究和药物开发提供重要的支持和指导。
无标记的定量磷酸化蛋白质组学
无标记的定量磷酸化蛋白质组学引言蛋白质磷酸化是一种常见的细胞信号传导过程，能够调控细胞的生理和病理过程。
传统的蛋白质磷酸化分析方法主要依赖于特定抗体的免疫沉淀和检测，这种方法只能针对已知的磷酸化位点进行分析，并且需要大量标记试剂和专业设备。
然而，近年来，无标记的定量磷酸化蛋白质组学技术的发展为全面了解细胞中蛋白质磷酸化事件提供了新的机会。
无标记的定量磷酸化蛋白质组学技术概述无标记的定量磷酸化蛋白质组学技术是一种通过质谱分析来实现对全细胞或全蛋白组中磷酸化位点进行定量分析的方法。
与传统方法相比，无标记的定量磷酸化蛋白质组学技术具有以下优势：1.高通量: 无标记的定量磷酸化蛋白质组学技术可以同时分析数千个磷酸化位点，实现高通量的磷酸化蛋白质组学研究。
2.全面性: 该技术不依赖于特定抗体，可以对全蛋白组进行分析，能够发现新的磷酸化位点和未知的信号通路。
3.定量性: 通过质谱分析，可以对不同样本中的磷酸化位点进行定量比较，揭示细胞信号转导网络的动态变化。
4.高灵敏度: 无标记的定量磷酸化蛋白质组学技术能够检测到低丰度的磷酸化位点，提高了对细胞中低丰度信号分子的发现能力。
无标记的定量磷酸化蛋白质组学技术流程无标记的定量磷酸化蛋白质组学技术主要包括样品制备、质谱分析和数据分析三个主要步骤。
样品制备样品制备是无标记的定量磷酸化蛋白质组学技术的关键步骤，良好的样品制备可以提高分析的准确性和可靠性。
常用的样品制备方法包括以下几个步骤：1.细胞裂解：将细胞裂解并获得总蛋白。
2.蛋白消化：使用适当的酶（例如胰蛋白酶）对总蛋白进行消化，将蛋白消化为肽段。
3.磷酸化富集：使用磷酸化富集材料（例如钛柱、铁柱等）对磷酸化肽段进行富集。
4.肽段纯化：通过逆相高效液相色谱（RP-HPLC）等方法对富集的肽段进行纯化。
质谱分析质谱分析是无标记的定量磷酸化蛋白质组学技术的核心步骤，通过质谱仪对样品进行分析，获取磷酸化位点的定量信息。
磷酸化蛋白组学流程
磷酸化蛋白组学流程引言：蛋白质是细胞中的重要组成部分，它们参与调控细胞的生理过程和信号传导。
磷酸化是一种常见的蛋白质修饰方式，通过磷酸化可以改变蛋白质的结构和功能，从而影响细胞内的信号传导网络。
磷酸化蛋白组学是研究细胞中磷酸化蛋白质的全面分析方法，本文将为您介绍磷酸化蛋白组学的流程。
1. 样品制备：磷酸化蛋白组学的第一步是样品制备。
样品可以是细胞培养物、组织切片或体液等。
首先，将样品裂解，释放蛋白质。
然后，通过离心等方法去除细胞碎片和其他杂质，得到纯净的蛋白质提取物。
为了保持蛋白质的活性和磷酸化状态，需在低温和无酶条件下进行样品制备。
2. 蛋白质消化：蛋白质提取物中含有大量的蛋白质，为了更好地分析磷酸化蛋白质，需要将蛋白质进行消化。
常用的消化酶是胰蛋白酶，它可以将蛋白质水解为短肽段。
消化酶的选择和消化时间需要根据样品特性和实验要求进行优化。
3. 磷酸化肽的富集：为了富集磷酸化肽，可以使用磷酸化特异性抗体、亲和层析柱或磷酸化肽诱捕剂等方法。
这些方法可以选择性地富集磷酸化肽，减少非磷酸化肽的干扰。
富集后的磷酸化肽可以通过洗脱等步骤得到。
4. 质谱分析：富集后的磷酸化肽需要进行质谱分析。
质谱分析是磷酸化蛋白组学的核心技术，可以用于鉴定和定量磷酸化肽。
常用的质谱技术包括液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）、质子转移反应质谱（PTR-MS）等。
通过质谱分析，可以获得磷酸化肽的质量和序列信息。
5. 数据分析：质谱数据的处理和分析是磷酸化蛋白组学的最后一步。
首先，需要将质谱数据进行预处理，包括峰提取和去噪等步骤。
然后，根据质谱数据鉴定磷酸化肽，并确定它们的定量信息。
最后，可以使用生物信息学方法对磷酸化肽进行功能注释和信号通路分析。
结论：磷酸化蛋白组学是研究细胞中磷酸化蛋白质的重要方法，可以揭示细胞信号传导网络的调控机制。
通过样品制备、蛋白质消化、磷酸化肽的富集、质谱分析和数据分析等步骤，可以获得磷酸化蛋白质的全面信息。
磷酸化质谱
磷酸化质谱
磷酸化质谱是一种用于研究蛋白质磷酸化的分析方法。
磷酸化是一种重要的蛋白质修饰，它能够调节蛋白质的功能、定位和相互作用。
磷酸化质谱通过将蛋白质酶切成小片段，然后用质谱仪分析这些片段中的磷酸化位点，从而确定蛋白质的磷酸化模式和位置。
磷酸化质谱的过程包括样品制备、酶解、富集和质谱分析。
首先，样品需要经过预处理，包括去除污染物和离子对样品的影响等。
然后，样品被酶解成小片段，通常是通过胰蛋白酶消化。
接下来，磷酸化位点需要被富集，通常是通过亲和层析法或磷酸化特异性抗体捕获。
最后，富集后的样品被送入质谱仪进行分析，通过检测质量/电荷比和碎片离子的质量，确定蛋白质的磷酸化情况。
磷酸化质谱在蛋白质组学、信号转导和疾病研究等领域具有广泛的应用。
它能够帮助研究人员了解蛋白质的功能、调控机制和相互作用，以及研究疾病发生发展的分子机制。
同时，磷酸化质谱还可以用于新药研发和药物筛选，为药物研发提供重要的分子信息。
总之，磷酸化质谱是一种重要的分析方法，对于研究蛋白质磷酸化和相关生命科学领域具有重要意义。
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TiO2法磷酸化富集
试验：pH值对TiO2富集磷酸化蛋白的影响
共5个样品，各400ug蛋白（酶解之前），每个样品用1mg TiO2，共用5mg。
流程：
1.TiO2 Beads 活化
①向10mg TiO2 Beads中加入1000 ul Elute buffer 2，震荡20min，8200×g，2min，离心，弃上清；
②更换wash buffer 1 1000ul，第一遍摇晃两次，弃上清；第二遍，震荡20min，弃上清；
③更换Loading buffer 1000ul，2遍震荡30min，最后TiO2 Beads保存在Loading buffer中。
2.酶解后的肽段溶液中加入TFA酸化，使TFA终浓度为0.1%—0.5%，离心浓缩抽干，之后重新用Loading buffer溶解（体积控制在400ul左右）。
3.每400ug蛋白用1mg TiO2 Beads 富集，将1mg TiO2 加入到一个样品中，室温旋转30min，转速1100转/分。
4.将孵育好的肽段溶液加入脱盐柱中，8200×g，2min，收集为Flow Through。
5.再向脱盐柱中加入200ul wash buffer 1，8200×g，2min，，重复3次，收集600ul。
6.再向脱盐柱中加入200ul wash buffer 2，8200×g，2min，，重复3次，收集600ul。
4、5、6合并到一起，为Flow Through。
7.再向脱盐柱中加入200ul Elute buffer 1，8200×g，2min，，重复2次，收集400ul，为elute1；再加入200ul Elute buffer 2，8200×g，2min，收集200ul，为elute 2；合并elute 1和elute 2，总共600ul磷酸化多肽。
8.离心浓缩干，复溶于0.1% FA中，上样。
试剂准备：
Loading buffer：35%乙醇酸溶液/65%ACN/2%TFA
—3.5mL饱和谷氨酸溶液/乙醇酸
—6.5mL ACN
—0.2mL TFA
wash buffer 1：65% ACN/0.5% TFA
wash buffer 2: 65% ACN/0.5% TFA
Elute buffer 1：300mM氨水/50% ACN
—H2O 19.1mL
—ACN 20mL
—浓氨水（25%）0.9mL
Elute buffer 2：500mM氨水/60% ACN
—H2O 14.4mL
—ACN 24mL
—浓氨水（25%） 1.6mL。