细胞生物学 第十一章

L11-rRNA复合物的三维结构 (引自Porse et.al.,1999)
酶作用物RNA
酶作用物RNA裂开
核糖体最早是Albert Claude于1930s后期用暗视野显微镜观察细胞的匀浆物 时发现的，当时称为微体(Microsomes). 1950s中期，George Palade在电子显微镜下观察到这种颗粒的存在。当时 George Palade和他的同事研究了多种生物的细胞，发现细胞质中有类似的 颗粒存在，尤其在进行蛋白质合成的细胞中特别多。 后来Philip Siekevitz用亚细胞组份分离技术分离了这种颗粒，并发现这些 颗粒总是伴随内质网微粒体一起沉积。化学分析揭示，这种微粒富含核苷 酸，随之命名为ribosome，主要成分是核糖体RNA(rRNA)， 约占60%、 蛋白质(r蛋白质)约占40%。
蛋白质合成过程中很多重要步骤 与50S核糖体大亚单位相关
结构与功能的分析方法
离子交换树脂可分离纯化各种r蛋白； 纯化的r蛋白与纯化的rRNA进行核糖体的重组装， 显示核糖体中r蛋白与rRNA的结构关系 双向电泳技术可显示出E.coli核糖体在装配各阶段中， 与rRNA结合的蛋白质的类型 双功能的交联剂和双向电泳分离可用于研究r蛋白在 结构上的相互关系 电镜负染色与免疫标记技术结合，研究r蛋白在核糖 体的亚单位上的定位。 对rRNA，特别是对16S rRNA结构的研究 70S核糖体的小亚单位中rRNA与全部的r蛋白关系 的空间模型
核糖核蛋白体,简称核糖体(ribosome) 基本类型 附着核糖体 游离核糖体 70S的核糖体 80S的核糖体 主要成分 r蛋白质：40%，核糖体表面 rRNA:60%,，核糖体内部 按存在的部位:有三种类型核糖体，细胞质核糖体、线粒 体核糖体、叶绿体核糖体。
二、核糖体的结构
结构与功能的分析方法
以上现象给大家什么样的提示？
在核糖体中rRNA是起主要作用的结构成分
具有肽酰转移酶的活性； 为tRNA提供结合位点(A位点、P位点和E位点)； 为多种蛋白质合成因子提供结合位点； 在蛋白质合成起始时参与同mRNA选择性地结合,以 及在肽链的延伸中与mRNA结合； 核糖体大小亚单位的结合、校正阅读(proofreading)、 无意义链或框架漂移的校正、以及抗菌素的作用等 都与rRNA有关。
提出直观、可靠且比人们的预料更为精巧复杂和可能的 作用机制，从而为揭开核糖体这一具有30多亿年历史的 古老的高度复杂的分子机器的运转奥秘迈出了极重要的 一步。
三、核糖体蛋白质与rRNA的功能分析
核糖体上具有一系列与蛋白质 合成有关的结合位点与催化位点
在蛋白质合成中肽酰转移酶的活性研究
核糖体上具有一系列与蛋白质 合成有关的结合位点与催化位点
游离核糖体
附着核糖体
翻转90度
60S
40S
原核生物与真核生物核糖体成分的比较
E.coli核糖体小亚单位中rRNA与r蛋白的相互关系示意图 线条表示相互作用及作用力的强（粗线）与弱（细线） （引自Alberts et al，1989）
E.coli

（a）核糖体小亚单位中的部分r蛋白与rRNA的结合位点） （b）及其在小亚单位上的部位 （引自Albert et al.，1989，图a; Lewin,1997,图b）
与mRNA的结合位点 与新掺入的氨酰-tRNA的结合位点——氨酰基位点，又称A位 点 与延伸中的肽酰-tRNA的结合位点——肽酰基位点Байду номын сангаас又称P位点 肽酰转移后与即将释放的tRNA的结合位点——E位点(exit site) 与肽酰tRNA从A位点转移到P位点有关的转移酶 (即延伸因子EF-G)的结合位点 肽酰转移酶的催化位点 与蛋白质合成有关的其它起始因子、延伸因子和 终止因子的结合位点
核糖体小亚单位rRNA的二级结构 (a) E.coli 16S rRNA；（红色为高度保守区） (b) 酵母菌18S rRNA，它们都具有类似的40个臂环结构(图中1～40)， 其长度和位置往往非常保守；P、E分别代表仅在原核或真核细胞中 存在的rRNA的二级结构。(Darnell et al.，1990)
DNA代替了RNA的遗传信息功能
DNA双链比RNA单链稳定；
DNA链中胸腺嘧啶代替了RNA链中的尿嘧啶， 使之易于修复。
蛋白质取代了绝大部分RNA酶的功能
蛋白质化学结构的多样性与构象的多变性；
与RNA相比，蛋白质能更为有效地催化多种生化 反应，并提供更为复杂的细胞结构成分，逐渐演 化成今天的细胞。
同一生物中不同种类的r蛋白的一级结构 均不相同，在免疫学上几乎没有同源性。
不同生物同一种类r蛋白之间具有很高 的同源性， 并在进化上非常保守。
蛋白质结合到rRNA上具有先后层次性。
核糖体的重组装是自我装配过程
16SrRNA的一级结构是非常保守的 16SrRNA的二级结构具有更高的保守性： 臂环结构(stem-loop structure)
23S rRNA分子的肽酰转移酶活性证实
1992年，Harry Noller 和他的同事用蛋白酶K、SDS以及苯 酚等去垢剂处理大肠杆菌核糖体50S的亚基,将所有的蛋白 质都破坏后,仍然具有肽酰转移酶的活性。 但是，用核酸酶处理核糖体,将rRNA降解后,肽酰转移酶的 活性也随之丧失。这些结果提示是RNA而不是蛋白质具有 催化肽键形成的作用。在细菌核糖体中，已确定23SrRNA 分子中具有肽酰转移酶活性的区域。
RNA在生命起源中的地位及其演化过程
一、多聚核糖体 (polyribosome或polysome)
概念 核糖体在细胞内并不是单个独立地执行功能，而是由多个 甚至几十个核糖体串连在一条mRNA分子上高效地进行肽 链的合成，这种具有特殊功能与形态结构的核糖体与 mRNA的聚合体称为多聚核糖体。 多聚核糖体的生物学意义 细胞内各种多肽的合成，不论其分子量的大小 或是 mRNA的长短如何，单位时间内所合成的多肽分子数目都大体相 等。 同一条mRNA被多个核糖体同时翻译成蛋白质,大大提高了蛋 白质合成的速率. 以多聚核糖体的形式进行多肽合成，对mRNA的利用及 对其浓度的调控更为经济和有效。 更重要的是减轻了细胞核的负荷, 减少了基因的拷贝数, 也减轻了细 胞核进行基因转录和加工的压力。
rRNA三级结构的稳定性涉及多种作用力，如 rRNA螺旋间的相互作用以及腺嘌呤插入螺旋 小沟的作用力等。
蛋白质合成过程中很多重 要步骤与50S核糖体大亚单位相关
涉及的多数因子为G蛋白(具有GTPase活性)，核糖体上 与之相关位点称为GTPase相关位点。 最近人们成功地制备核糖体蛋白L11-rRNA复合物的晶体， 获得了其空间结构高分辨率的三维图象。 这一结果证实了前人用各种实验技术所获得的种种结论
核糖体的蛋白质合成功能是通过放射性标记实验发现的。将细胞与放射性 标记的氨基酸短暂接触后进行匀浆，然后分级分离，发现在微粒体部分有 大量新合成的放射性标记的蛋白质。后将微粒体部分进一步分离，得到核 糖体和膜微粒，这一实验结果表明核糖体与蛋白质合成有关。
亚细胞组份分离技术和放射性标记技术是发现核糖体和鉴定核糖体功能的 两个关键技术。
在蛋白质合成中肽酰转移酶的活性研究
核糖体蛋白 在核糖体中rRNA是起主要作用的结构成分
r蛋白质的主要功能
核糖体蛋白
很难确定哪一种蛋白具有催化功能： 在E.coli中核糖体蛋白突变甚至缺失对蛋白 质合成并没有表现出“全”或“无”的影响。
多数抗蛋白质合成抑制剂的突变株，并非由 于r蛋白的基因突变而往往是 rRNA基因突变。 在整个进化过程中rRNA的结构比核糖体蛋白 的结构具有更高的保守性。
第十一章
核糖体(ribosome)
核糖体的类型与结构
多聚核糖体与蛋白质的合成
第一节
核糖体的类型与结构
核糖体是合成蛋白质的细胞器，其唯一的 功能是按照mRNA的指令由氨基酸高效且精确 地合成多肽链。
核糖体的基本类型与成分 核糖体的结构 核糖体蛋白质与rRNA的功能分析
一、核糖体的基本类型与成分
核酶发现的过程及其意义。 1981年，Thomas Cech和他的同事在研究四膜虫的26S rRNA前体加工去除基因内含 子时获得一个惊奇的发现∶内含子的切除反应发生在仅含有核苷酸和纯化的26S rRNA前体的溶液中，其中不含有任何蛋白质催化剂的。 合理的解释只能是:内含子切除是由26S rRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。 为了证明这一发现，他们将编码26S rRNA前体DNA克隆到细菌中并且在无细胞系统 中转录成26S rRNA前体分子。结果发现这种人工制备的26S rRNA前体分子在没有 任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子。这种现象称为自 我剪接(self-splicing)，这是人类第一次发现RNA具有催化化学反应的活性，具 有这种催化活性的RNA称为核酶。 这一发现之后不久，在酵母和真菌的线粒体mRNA和tRNA前体加工、叶绿体的tRNA 和rRNA前体加工、某些细菌病毒的mRNA前体加工等过程中都发现了自我剪接现象 。 Thomas Cech 因发现了核酶而获得1989年诺贝尔化学奖。 核酶的发现在生命科学中具有重要意义，在进化上使我们有理由推测早期遗传信 息和遗传信息功能体现者是一体的，只是在进化的某一进程中蛋白质和核酸分别 执行不同的功能。核酶的发现为临床的基因治疗提供了一种手段，具有重要的应 用前景。 请你设计实验，验证23S rRNA分子的肽酰转移酶活性。
思考题：

P383 1，3，5，6
r蛋白质的主要功能
对rRNA 折叠成有功能的三维结构是十分重要的； 在蛋白质合成中, 某些r蛋白可能对核糖体的构象 起“微调”作用；
在核糖体的结合位点上甚至可能在催化作用中, 核 糖体蛋白与rRNA共同行使功能。
第二节
聚核糖体与蛋白质的合成
多聚核糖体(polyribosome或polysome) 蛋白质的合成