利用降落PCR扩增KMT-1基因
PCR基因扩增技术原理及特点
PCR基因扩增技术原理及特点基因扩增技术（PCR）聚合酶链反应（polymerase chain reaction简称PCR）又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重点革新。
PCR扩增DNA的原理是：先将含有所需扩增分析序列的靶DNA 双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对依据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。
此引物范围就在包含所欲扩增的DNA片段，一般需20—30个碱基对，过少则难保持与DNA单链的结合。
引物与互补DNA结合后，以靶DNA单链为模板，经反链杂交复性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）为原材料按5到3方向将引物延长、自动合成新的DNA 链、使DNA重新复制成双链。
然后又开始第二次循环扩增。
引物在反应中不但起引导作用，而且起着特异性的限制扩增DNA片段范围大小的作用。
新合成的DNA链含有引物的互补序列，并又可作为下一轮聚合反应的模板。
如此重复上述DNA模板加热变性双链解开引物退火复性在DNA聚合酶作用下的引物延长的循环过程，使每次循环延长的模板又加添1倍，亦即扩增DNA产物加添1倍，经反复循环，使靶DNA片段指数性扩增。
PCR的扩增倍数Y=（1+E）n,这里Y是扩增量，n为PCR的循环次数。
E为PCR循环扩增效率。
设PCR扩增效率E为100%、循环次数n=25次，靶DNA将扩增到33554432个拷贝，即扩增3355万倍：若E为80%、n=20、则扩增数量将下降到1408865拷贝，即扩增产物约丢失93%，若E=100%，n=20，则扩增数量减少1048576个拷贝，扩增产物约减少97%。
可见PCR循环扩增效率及循环次数都对扩增数量有很大影响。
PCR扩增属于酶促反应，所以，DNA扩增过程遵从酶促动力学原理。
靶DNA片段的扩增最初表现为直线上升，随着靶DNA片段的渐渐积累，当引物模板/DNA/聚合酶实现肯定比值时，酶的促化反应趋于饱和，此时靶DNA产物的浓度不再加添，即显现所谓平台效应。
PCR扩增的原理和步骤
PCR扩增的原理和步骤聚合酶链反应(polymerasechain reaction PCR)技术是20世纪80年代中期发展起来的一项基因检测即一种体外核酸扩增技术。
它具有许多优点：特异性、易重复、高效性等，可以在几个小时完成过去几天或者更长时间完成的实验，因此这项技术在生物医学领域具有划时代的意义。
但是，传统PCR技术有它的缺点，它通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析而不能对起始模板准确定量，同时也无法对扩增反应实时检测且在实验过程中易污染而出现假阳性。
人们为了寻找更为灵敏、快速、简便、高特异性的方法进行了许多探索研究，直到1996年由美国Applied Biosystems公司推出了一种新的定量试验技术—荧光定量PCR(F lurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR；real-time quantitati ve PCR,RT-qPCR or qPCR)，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度，实现了PCR从定性到定量质的跨越，具有里程碑意义。
目前，此项技术已应用于干细胞研究、肿瘤学和遗传疾病研究、病原体检测和传染病研究、药物分析、药物基因组学、植物学研究和农业生物科技等多领域研究中。
本文对实时荧光定量PCR的原理、分类和应用进行阐述。
一、实时荧光定量PCR技术的原理real-time quantitative PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
在荧光定量PCR技术中有2个概念比较重要。
(1)荧光域值(t hreshold)的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号标准偏差的10倍。
降落PCR
降落PCR降落PCR（touchdown PCR），一种PCR技术，主要用于PCR的条件的优化。
在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行，例如特异性不够易错配等。
退火温度过高会使PCR效率过低，但退火温度过低则会使非特异扩增过多。
实验材料:基因样品仪器、耗材:PCR仪实验步骤：1. 反应体积为50 μl。
2. 人CD137胞膜外区基因的PCR扩增体系：CD137-pCDNA3质粒4 μl，P1，P2各0.5 μmol/L，MgCl2 2 mmol/L，dNTP 0.4 mmol/L，Taq 5 U。
3. hIgG1Fc片段的PCR扩增体系：含人hIgG1Fc的PGEM-T质粒4 μl，P3、P4各0.4 μmol/L，MgCl2 2 mmol/L，dNTP 0.4 mmol/L，Taq 5 U。
4. HBVDNA多聚酶基因的PCR扩增体系：（1）第一轮：HBVDNA模板4 μl，P5、P6各0.25 μmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq 0.8 U.（2）第二轮：取5倍稀释的第一轮PCR产物4μl为模板，P7、P8各0.25 μmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq 0.8 U。
5. 分别在各灭菌PCR管加入上述各反应成分，100℃煮沸5 min，立即冰浴5 min，加入TaqDNA聚合酶，混匀，离心，PCR程序如下：6. 取10 μl PCR 扩增产物，在2%或3%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察扩增产物。
注意事项：由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在TD—PCR中最好应用热启动技术。
设计时，退火温度的范围应跨越15℃左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃。
PCR基因扩增原理
PCR 基因扩增实验原理﹑仪器试剂和操作步骤实验原理：PCR(Polymerase Chain Reaction)-聚合酶链式反应，可以选择性扩增一段DNA序列。
其基本步骤是，首先将待扩增的模板DNA变性使之成为单链，DNA样品中，特异性的引物能够与其互补的序列杂交，在dNTPs和Taq酶存在时，就可以合成模板DNA的互补链，反应完成后，将反应混合物加热使DNA双链变性，温度下降后，过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。
这种延伸—变性—退火—延伸的循环可以重复多次，使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。
1.变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链。
2.退火：使溶液温度降至50～60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合.3.延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA 聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs），按5ˊ→3ˊ方向复制出互补DNA上述3 步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。
从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。
影响PCR的主要因素PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。
引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。
现将几种主要影响因素介绍如下。
一、温度循环参数在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。
如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。
pcr扩增的原理高中生物
pcr扩增的原理高中生物PCR（聚合酶链反应）也称为核酸增强法，它是一种分子生物技术，是由Kary Mullis于1985年发明的。
它以反复的温度循环来扩增特定区域的DNA序列，使用它能够显著地把少量的核酸样本扩增到几十亿分子。
一、什么是PCRPCR（聚合酶链反应）是由Kary Mullis发明的一种分子生物技术，全称为聚合酶链反应。
它可以有效地把少量核酸样本进行扩增，从几十个分子扩增到几十亿个分子，且只需要一定的时间。
二、PCR的基本原理PCR的基本原理是反复地循环利用高温和低温，来模拟DNA的复制过程。
它是通过催化特定DNA序列片段（引物）以及三种特殊的酶催化剂，利用恒温反应器对特定区域的DNA序列进行反复循环，进而使少量的DNA扩增到几十亿分子。
三、PCR的过程1.引物合成：首先，根据DNA的序列信息，设计并合成出要扩增的特定DNA序列（引物）。
2.反应混合：将特定DNA引物，聚合酶、少量的DNA模板和含有抗转录试剂和丰度的DNA碱基的反应液，混合在一起，放入恒温反应器中。
3.热回收：恒温反应器将混合物加热到95°C左右，以解决模板DNA，使DNA引物能够与模板DNA配对。
4.退火：恒温反应器将混合物降温到55-65°C，以便酶能够在温度适宜的环境下迅速复制模板DNA。
5.再次加热：恒温反应器将混合物再次加热到90-95°C，以解决新合成的DNA，使DNA引物能够再次与模板DNA配对，开始新的一轮反应。
6.循环复制：每次热回收后，给定的DNA序列就被复制一次，这就是扩增的基本过程。
在适当的温度条件下，反应混合物中的形成的新DNA分子就会参与到新的热回收过程中，进而使原来低浓度的模板DNA的片段迅速增多，从而达到扩增的目的。
四、PCR的应用PCR技术已经用于科研和临床实验中，PCR可以检测病原体及其产生的毒素，进行DNA基因分析，用于致病基因突变研究，还可以用来研究植物、动物等等。
降落PCR：一种优化PCR技术的简易方法
降落PCR：一种优化PCR技术的简易方法PCR是一种利用DNA聚合酶进行DNA扩增的技术，可以实现对目标DNA片段的快速复制和检测。
PCR的过程主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
变性是指将双链DNA在高温下分离成单链DNA；退火是指将特定的引物（primer）在适当的温度下与单链DNA互补结合；延伸是指在DNA聚合酶的作用下，引物沿着单链DNA合成新的双链DNA。
这三个步骤反复进行，每次都会使目标DNA片段的数量翻倍，从而实现指数级的扩增。
PCR的效率和特异性取决于多种因素，其中最重要的是引物的设计和退火温度的选择。
引物是一段短的单链DNA，通常长度为15-30个碱基，用于识别并结合目标DNA片段的两端。
引物的设计需要考虑其与目标DNA片段的互补程度、碱基组成、二级结构、Tm值等因素。
Tm值是指引物与目标DNA片段完全互补结合时的熔解温度，也就是变性时所需的最低温度。
退火温度是指引物与目标DNA片段结合时所需的最佳温度，通常为Tm值减去3-5°C。
如果引物设计不合理或退火温度选择不恰当，可能会导致PCR难以进行或产生非特异扩增。
非特异扩增是指引物与非目标DNA片段或自身结合，导致扩增出错误或无用的DNA片段。
为了避免非特异扩增，需要尽量提高引物与目标DNA片段之间的互补程度和特异性，同时降低引物与非目标DNA片段或自身之间的互补程度和特异性。
这样，就可以在较高的退火温度下进行PCR，使得只有目标DNA片段能够被有效地扩增，而非目标DNA片段或自身则被排除在外。
然而，在许多情况下，引物的设计使得PCR难以进行，例如特异性不够易错配等。
退火温度过高会使PCR效率过低，但退火温度过低则会使非特异扩增过多。
这虽然可以通过反复尝试来优化，但费时费力。
降落PCR提供了一个较为简易的优化方法。
降落PCR（Touchdown PCR）是一种改进的PCR技术，其原理大致是这样的：首先在较高的温度下扩增，此时虽然扩增效率低但非特异扩增基本没有。
降落PCR
降落PCR的原理及常见问题解答回答：Touchdown PCR是指每隔一个循环降低1°C反应退火温度，直至达到“Touchdown”退火温度，然后以此退火温度进行10个左右的循环。
该方法最初出现是为了避开确定最佳退火温度而进行的复杂的反应优化过程。
正确和非正确退火温度之间的任何差异将造成每个循环PCR产物量的两倍差异（每摄氏度造成4倍差异）。
因此相对于非正确产物，正确的产物可以得到富集该方法的另一个应用是在确定已知序列肽的DNA序列。
具体过程如下：使用两套与已知序列肽两末端可能配对的简并引物，这只需要知道一段长为13个氨基酸的肽段序列，5’和3’引物各长18个碱基（6个氨基酸），两者之间有一个碱基以上的间隔。
使用简并引物即可以进行“Touchdown PCR”。
由这种方法将获得大量的产物，但因为由肽序列可以知道引物之间的确切距离，所以可以根据产物的大小来选择所需要的产物。
该方法的优点在于可以富集引物与模板正确配对的产物。
如果克隆和测需一打PCR 产物，将可以确定肽的正确编码序列，设计进行杂交的寡核苷酸等。
该技术特别适用于由S er，Lys和Arg（每个有6个密码子）构成的多肽。
提问：降落PCR的优点？回答：综合比较普通PCR技术和最大耐受量聚合酶链反应，认为前者程序简单，省时，一般的PCR扩增仪都可完成，但缺点是退火温度不适当时容易出现假阳性;而最大耐受量聚合酶链反应虽然程序复杂，需要扩增仪有较大的内存，但能非常有效地降低或避免假阳性，且不在理想的工作条件（比如最佳镁离子浓度）下也可扩增出产物。
这就是降落PCR技术的优点吧。
不过我认为。
如果能用普通PCR技术扩出来的话，尽量用普通的聚合酶链反应，虽然降落聚合酶链反应比较省事省力，但是，它在一个很宽的退火温度里扩增，乱七八糟的条带肯定比较多哈。
虽然，电泳可能看不到。
降落PCR的一个优点是可以增加某些基因的特异性,不仅我自己在扩基因的艰难历程中,发现了这一优点,而且也推荐给周围的人,如果常规PCR循环程序的基因扩增效果不佳,我就来热启动加降落PCR.在非特异性背景较高的情况下,这招的确有效,但不绝对。
pcr反应的原理及步骤
pcr反应的原理及步骤PCR（聚合酶链式反应）一种分子生物学技术，它利用酶的特定性质将少量的DNA序列扩增为大量的DNA序列，以便于后续研究。
PCR技术已经广泛应用于医学、生物学、法医学和环境科学等领域，成为生物分子研究中最重要的工具之一。
下面详细介绍PCR反应的原理及步骤。
一、PCR反应的原理PCR反应是指把少量的DNA模板扩增为大量DNA的技术。
该技术系多次复制小段DNA的过程，是一种体外的细胞复制技术。
PCR技术过程中主要包括三个重要的步骤：变性、引物与DNA复制。
在变性步骤，将DNA链分离成单链，使其能够与引物形成复合物，在引物的作用下，在DNA聚合酶的辅助下，进行合成反应，产生一个新的DNA链。
在PCR反应中，利用一种特殊的DNA聚合酶——Taq聚合酶。
由于Taq聚合酶稳定性高，耐高温和高盐浓度等多种条件下工作，使其成为PCR反应的首选酶之一。
PCR反应通常包括：预变性、变性、退变性、延伸和保持等步骤。
以下是详细的步骤介绍。
二、PCR反应的步骤（一）PCR反应的前期准备在进行PCR反应前，需要准备好以下的试剂和设备：1. DNA模板DNA模板是PCR反应的起点。
新鲜或保存时间较短的DNA更适合进行PCR反应，因为存放时间过长可能会导致DNA的降解。
2. 引物引物是指使用一对特定的寡核苷酸引物，用于聚合酶链反应的启动和反应的低温退火程序。
引物的设计对PCR反应的准确性、特异性和效率等方面起到关键作用。
3. dNTPsdNTPS是脱氧核苷酸三磷酸盐，是DNA链的合成所必需的单体，其中包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
通常采用等浓度的四种dNTPs。
4. 反应缓冲液反应缓冲液含有pH、离子和其他的成分，与聚合酶链反应的酶活性最佳条件一致。
（二）PCR反应的步骤1. 预变性（Pre-denaturation）在PCR反应之前进行预变性，使反应混合物中暴露的DNA链变性转变成单链状态，从而使引物在继续链扩增时能与模板DNA复合。
PCR基因扩增原理
PCR基因扩增原理PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种重要的分子生物学技术，主要用于在体外迅速扩增DNA序列，从而使得少量DNA可以被有效地放大。
PCR技术不仅可以用于基因克隆和基因定量分析，也可以应用于研究疾病诊断、遗传学研究、进化学研究及法医学等领域。
本文将详细介绍PCR基因扩增的原理。
PCR技术的关键是引物的设计，引物是一对短链DNA寡核苷酸（一般为18-24个碱基），其序列与待扩增的DNA靠近目标区域的序列完全互补。
PCR过程中的引物一般由前向引物（forward primer）和反向引物（reverse primer）组成。
引物通过特异性地与目标序列的两端结合，在酶的作用下进行DNA链的延伸，从而实现对目标序列的扩增。
PCR过程包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在第一步变性中，PCR反应体系中的DNA双链被高温（通常为94-98°C）所震动，使DNA双链断裂为两条单链，得到了待扩增的单链DNA模板。
接下来反应体系从高温快速降温到50-65°C的退火温度，在此温度下引物与目标序列互补结合形成稳定的引物-模板复合物。
在第三步延伸中，通过加入一种DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶，将引物和模板之间的空位依次补充，从而在复制过程中合成新的DNA链。
延伸时间视所扩增的片段长度而定，通常为1-3分钟。
PCR反应体系中的其他关键成分还包括四个dNTP（脱氧核苷三磷酸），即dATP、dCTP、dGTP和dTTP，它们是合成DNA所必需的碱基单元；缓冲液，用于维持适宜的酶活性和酸碱度；和Mg2+离子，作为反应的催化剂。
另外，还需加入DNA聚合酶抑制剂，以避免在变性步骤中引物与模板外的DNA结合。
以上所描述的是PCR过程的一个循环，每次循环可扩增出一个新的DNA片段。
PCR反应的扩增结果是几何级数增长的，即每个循环后DNA的数量翻倍。
通过进行10-40个循环，可以将目标序列扩增到可以被检测的水平。
一种优化的PCR方法_降落PCR扩增目的基因
江苏临床医学杂志2002年第6卷第2期 ・127・ ●技术与方法一种优化的PCR方法———降落PCR扩增目的基因万 兵1 闫 杰2 季明春1 张利宁3 申厚凤1 陈志琳1(1,扬州大学医学院,扬州,225001; 2,北京地坛医院,北京,100011)(3,山东大学医学院,济南,250012) 摘 要 目的:尝试用一种新的PCR方法———降落PCR扩增目的基因。
方法:在构建人CD137-hIgG1Fc-pCDNA3融合蛋白真核表达载体以及在检测HBV多聚酶YMDD变异的过程中运用降落PCR扩增目的基因。
结果:扩增出的特异性条带与目的基因大小一致。
结论:降落PCR省却了常规PCR中摸索最适退火温度的过程,对一些Tm值相近的PCR反应可应用一套温度程序扩增,是一种行之有效的PCR方法。
关键词;降落PCR;退火温度 中图分类号:R446161 文献标识码:A 文章编号:1007-6514(2002)02-0127-03 多聚酶链式反应(PCR)是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖DNA 聚合酶的酶促反应[1]。
在实验室日常工作中经常出现两种情况:一种是因未找到最佳扩增条件导致产生大量非特异性产物,另一种情况是未扩增出任何产物。
影响PCR的因素很多,除了受PCR仪器性能的制约外,也取决于反应体系和反应条件的设置,其中Mg2+浓度、缓冲液p H值、循环条件等因素尤为重要,而循环条件中的退火温度又是至关重要的因素。
降落PCR是一种设计多循环以使相连循环的退火温度越来越低[2],从而达到最佳扩增条件的方法。
我们在构建人CD137-h Ig G1Fc-pCDNA3融合蛋白真核表达载体以及在检测HBV DNA多聚酶基因突变的过程中运用降落PCR进行了扩增目的基因的尝试。
1 材料和方法111 质粒含有人CD137全长cDNA序列的pCDNA3质粒(CD137-pCDNA3),由Herbert Schwarz教授惠赠;含h Ig G1FccDNA的P GEM-T质粒由收稿日期:2001-11-13作者简历:万 兵(1975-),男,江苏江都市人,硕士研究生,发表论文3篇。
pcr扩增基因的原理
pcr扩增基因的原理宝子！今天咱们来唠唠PCR扩增基因这个超酷的事儿。
你可以把基因想象成是一本超级超级小的秘籍，小到咱们肉眼根本看不见。
但是呢，科学家们有时候就特别想把这个小秘籍里的某些内容大量复制出来，就像你复印文件一样，这时候PCR就闪亮登场啦。
PCR扩增基因呀，就像是一场微观世界里的魔法表演。
这里面有几个超级重要的小助手呢。
第一个小助手就是模板，这模板就是咱们要复制的那个基因，也就是那本小秘籍啦。
这个模板就安安静静地待在那儿，等着被放大。
然后呢，还有引物这个小可爱。
引物就像是两个小箭头，它们能准确地找到模板基因上特定的位置，就好像是两把小钥匙，精准地插入基因这个大锁的特定孔位。
这引物可是很聪明的哦，它们能决定从哪里开始复制基因呢。
再说说DNA聚合酶这个勤劳的小工匠。
它呀，就像一个超级复印机的操作员。
一旦引物找到了位置，DNA聚合酶就开始工作啦。
它会沿着模板，一个一个地把那些构成基因的小零件（核苷酸）连接起来，就像搭积木一样，慢慢地把基因的副本搭建起来。
那这个过程是怎么在微观世界里发生的呢？在一个小小的反应管里，我们把模板、引物、DNA聚合酶还有一些其他的原料都放进去。
这个反应管就像是一个小小的魔法工作室。
刚开始的时候，我们要给这个小工作室升温，就像给它打打气一样。
温度升高的时候，模板基因的两条链就会分开，就像原本缠在一起的两条小绳子被解开了。
这时候，引物就赶紧跑过去，抱住模板链上自己对应的位置。
接着呢，我们把温度降一降，这个时候DNA聚合酶就活跃起来啦。
它就开始沿着引物所在的地方，把那些核苷酸一个个地连接起来，慢慢地就形成了一条新的基因链。
这样，一次复制就完成了。
但是呀，这还不够呢。
我们要经过好多好多轮这样的升温降温过程。
每一轮，基因的数量都会翻倍哦。
比如说第一轮我们有1个基因，第二轮就变成2个，第三轮就是4个，第四轮就是8个，就像滚雪球一样，基因的数量就越来越多啦。
PCR扩增基因在现实生活中的用处可大啦。
pcr定点增添碱基技术的原理
pcr定点增添碱基技术的原理PCR定点增添碱基技术（PCR site-directed mutagenesis）是一种用于DNA序列特定位置引入碱基改变的分子生物学技术。
该技术可以在既有的DNA片段上精确地实现点突变、插入或删除某些碱基，从而对目标基因进行精细调控，进而研究其功能或产生所需的蛋白质变体。
PCR定点增添碱基技术在基因工程、蛋白质研究和药物开发等领域发挥着重要作用。
下面将从该技术的原理、步骤和应用进行详细介绍。
一、PCR定点增添碱基技术的原理PCR定点增添碱基技术主要依赖于聚合酶链式反应（PCR）进行特定DNA片段的扩增和突变。
其原理如下：（一）引物设计：首先需要设计出两条引物，它们的序列覆盖到目标DNA片段的两侧，并且含有要引入的碱基改变。
引物的设计要确保引物与目标DNA片段的序列互补，并且引物的GC含量要在40%~60%之间。
（二）PCR扩增：在PCR反应中，利用DNA聚合酶和两条引物将目标DNA片段进行扩增，同时引入碱基改变。
PCR反应的温度和时间需要根据目标DNA片段的长度和引物的特性进行合理设计。
（三）酶切：将扩增得到的PCR产物进行酶切，消化掉原有的DNA 片段，只保留含有碱基改变的新DNA片段。
（四）连接：采用DNA连接酶将新DNA片段连接到载体上，形成重组质粒。
（五）转化：将重组质粒导入到细菌中，使其在适宜的培养条件下进行复制和表达。
通过上述步骤，便可实现对目标DNA片段特定位置的碱基改变，从而得到所需的突变基因。
二、PCR定点增添碱基技术的步骤PCR定点增添碱基技术的关键步骤包括引物设计、PCR扩增、酶切、连接和转化。
下面将对这些步骤逐一进行详细介绍。
（一）引物设计：引物是PCR反应的关键因素之一，它直接影响到PCR扩增的效率和突变的成功率。
引物设计需要注意以下几点：1.引物的序列应覆盖到目标DNA片段的两侧；2.引物的长度一般控制在18~30个碱基之间；3.引物之间的Tm值要相近，一般在50~65摄氏度之间；4.引物的3’端尽可能避免有重复序列或GC富集区域；5.引物的两端要避免有碱基的修饰或序列变异。
pcr定点诱变原理例题
pcr定点诱变原理例题
PCR（聚合酶链式反应）定点诱变是一种用于引入特定突变的技术，其原理是利用PCR反应来产生特定的突变。
这种技术可以被用于研究基因功能、蛋白质结构和酶催化机制等领域。
下面我将从原理和例题两个方面来回答你的问题。
首先，我们来看一下PCR定点诱变的原理。
PCR定点诱变利用了PCR反应中的错误复制和修复机制。
在PCR反应中，DNA聚合酶会复制DNA模板，但是由于其复制过程中的错误率，会产生一些突变。
通过控制PCR反应条件和引入特定的引物（引物中包含所需的突变信息），可以在特定位点引入所需的突变。
之后，可以通过转化或者其他方法将这些突变引入到目标生物体中，从而实现对特定基因的定点诱变。
接下来，我们来看一个例题。
假设我们希望在一个特定的基因中引入一个点突变，使得蛋白质的一个氨基酸发生改变。
首先，我们需要设计引物，其中包含我们希望引入的突变信息。
然后，我们进行PCR反应，使用这些引物来引发特定的突变。
接下来，可以通过测序等方法验证是否成功引入了突变。
最后，可以将这个突变基因导入到目标生物体中，观察其表型变化以及对应的功能变化。
通过PCR定点诱变技术，我们可以精确地引入特定的突变，从而研究基因功能、蛋白质结构以及酶催化机制等方面的问题。
这种技术在分子生物学和遗传学研究中具有重要的应用价值。
希望这个例题能够帮助你更好地理解PCR定点诱变的原理和应用。
2019届浙科版基因工程单元测试
基因工程一、单选题1．基因诊断是用荧光分子标记的DNA分子作探针，鉴定出所测标本上的遗传信息。
下列说法不正确的是（）A．基因诊断利用了DNA分子杂交原理B．采用基因诊断方法可快速诊断由病毒引起的疾病C．使用同一种DNA分子探针，可以诊断多种遗传病D．利用白血病患者细胞中分离出的癌基因作探针可以检测白血病【答案】C【解析】2．Mst Ⅱ是一种限制性内切酶，它总是在CCTGAGG的碱基序列中切断DNA。
图中显示了用Mst Ⅱ处理后的正常β－血红蛋白基因片段。
镰刀型细胞贫血症的根本原因是β－血红蛋白基因突变。
下列有关叙述中，错误的是( )A．在起初的正常β－血红蛋白基因中有3个CCTGAGG序列B．若β－血红蛋白基因某一处CCTGAGG突变为CCTCCTG，则用Mst Ⅱ处理该基因后产生3个DNA片段C．将Mst Ⅱ酶用于镰刀型细胞贫血症的基因诊断，若产生3个DNA片段，则β－血红蛋白基因正常D．将Mst Ⅱ酶用于镰刀型细胞贫血症的基因诊断，若产生4个DNA片段，则β－血红蛋白基因正常【答案】C【解析】试题分析：据图分析，该基因被切成四段，说明有3个CCTGAGG序列被Mst Ⅱ切割，所以A正确；若该基因某一处CCTGAGG突变为CCTCCTG，则Mst Ⅱ不能切割，故该突变的基因被切成三段，所以B正确；将Mst Ⅱ酶用于镰刀型细胞贫血症的基因诊断，若产生3个DNA片段，则β－血红蛋白基因不正常，所以C错误；将Mst Ⅱ酶用于镰刀型细胞贫血症的基因诊断，若产生4个DNA片段，与题中图解一致，则β－血红蛋白基因正常，所以D正确。
考点：本题考查基因工程的内容，意在考查考生对所学知识的理解。
3．酵素是一种总长度为419个氨基酸的具有催化能力的蛋白质。
某科学家以分子生物学技术，合成了五种不同长度的酵素X，并测定其活性，结果如图所示。
依据实验结果，推测酵素X分子中具有活性的部分氨基酸最可能是A．第196到419号B．第44到196号C．第1到43号D．第86到419号【答案】B【解析】据图分析，1-196号氨基酸组成的酶片段具有活性，说明酶分子的活性部位在1-196号氨基酸段，A错误；1-196号氨基酸组成的酶片段具有活性，44-419号氨基酸组成的酶片段具有活性，说明酶分子的活性部位最可能是在44-196号氨基酸段，B正确；1-196号氨基酸组成的酶片段具有活性，44-419号氨基酸组成的酶片段具有活性，说明酶分子的活性部位不在1-43号氨基酸段，C错误；86-419号氨基酸组成的酶片段不具有活性，说明酶分子的活性部位不在86-419号氨基酸段，D错误。
PCR突变技术方法概览
PCR突变技术方法概览1基于PCR 的体外诱变技术定点突变的方法很多，而基于 PCR 的定点突变技术由于其突变效率高，操作简单，耗时短，成本低廉等优点而倍受瞩目。
近十年来，基于 PCR 的定点突变技术获得了长足的发展，目前运用此技术已能实现各种类型的基因突变。
基因突变实验包括以下几个步骤:1目的基因全序列变异文库的构建;2利用高通量表达筛选载体从变异文库中筛选表达突变体;3表达突变体的鉴定和表达研究。
1.1 重叠延伸PCR（over-lap extension PCR OE-PCR）这种方法运用非常广泛、灵活，不受突变位置及突变类型的限制，利用OE-PCR不仅能实现基因点突变，还能便利地实现大片段的插入及删除及插入。
其基本原理如图（1）所示。
首先设计两个 PCR 反应以产生两个含突变位点的 DNA 片段，随后将上述两个 PCR 产物混合，二者通过末端互补区结合并在适宜的温度下互引物延伸得到完整的含突变的基因，对第一次 PCR 产物进行纯化处理可显著提高突变效率。
OE-PCR 不足之处在于：○1一个突变需要两对引物，3次 PCR，并且需对中间产物进行纯化。
相对而言步骤较烦琐，不经济；○2由于 DNA 二级结构及互补链的竞争等因素的影响，有时两个中间产物难于有效地相互结合导致目的产物得率很低；○3当利用 Taq 聚合酶进行PCR 反应时，经常在 PCR 产物末端加上腺苷酸，这一多余的腺苷酸一方面导致两个中间产物难于有效地相互结合，另一方面可能会插入基因中导致产生非预期的移码突变。
针对这些不足，后来许多学者对OE-PCR 进行了改进。
1997年，Urben等提出一步重叠延伸 PCR 法（one-step overlap extension PCR），使得三个 PCR 反应得以在一个试管里进行，并且省略了烦琐的中间产物纯化过程。
其原理是首先将待突变的 DNA 以相反的方向克隆到两个载体中，这两个载体除了多克隆位点相反外其余均相同（例如pUC18,19）。
湖南省常德市市第七中学2019年高二生物上学期期末试题含解析
湖南省常德市市第七中学2019年高二生物上学期期末试题含解析一、选择题（本题共40小题，每小题1.5分。
在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。
）1. 下列关于森林群落垂直结构的叙述错误的是（）A．是长期自然选择的结果B．缓解了种间竞争C．其结构主要由水分决定D．有利于对资源的充分利用参考答案：C【考点】F5：群落的结构特征．【分析】生物群落的结构包括空间结构﹣﹣垂直结构和水平结构，群落的外貌和时间节律，群落中的动植物在垂直方向上有分层现象，水平方向上有镶嵌分布现象，且其中的动植物的种类也不同，草原群落在垂直方向也有分层现象，只是没有森林群落的分层现象明显．群落的空间结构特征是长期自然选择的结果，既有利于充分利用资源，又有利于缓解种间竞争，导致这种结构特征的主要非生物因素是光照．【解答】解：A、森林群落垂直结构是长期自然选择的结果，是生物对环境的一种适应，A 正确；BD、群落的空间结构特征是长期自然选择的结果，既有利于充分利用资源，又有利于缓解种间竞争，BD正确；C、森林群落垂直结构主要和光照决定的，C错误．故选：C．2. 人类某种遗传病的患者，女性患者约是男性患者的二倍，致病基因可能是A．显性基因位于常染色体 B．隐性基因位于常染色体上C．显性基因位于X染色体D．隐性基因位于X染色体上参考答案：C3. 已知突触前神经元释放的某种递质可使突触后神经元兴奋，当完成一次兴奋传递后，该种递质立即被分解。
某种药物可以阻止该种递质的分解，这种药物的即时效应（）A．突触前神经元持续性兴奋B．突触后神经元持续性兴奋C．突触前神经元持续性抑制D．突触后神经元持续性抑制参考答案：B4. 下面关于DNA分子结构的叙述中，错误的是A．每个DNA分子中都会含有四种脱氧核苷酸B．每个DNA分子中，都是碱基数＝磷酸数＝脱氧核苷酸数＝脱氧核糖数C．双链DNA分子中的一段，若含有40个腺嘌呤，就一定会同时含有40个胸腺嘧啶D．每个脱氧核糖上均连着一个磷酸和一个碱基参考答案：C5. 下列几组生物①根瘤菌与豆科植物、②细菌与噬菌体、③狐与兔、④大小两种草履虫它们的种间关系分别为A．互利共生、寄生、捕食、竞争B．竞争、寄生、互利共生、捕食 C．寄生、捕食、互利共生、竞争D．互利共生、竞争、寄生、捕食参考答案：A6. 设计植物体细胞杂交实验时，若期望获得性状优良的作物新品种，不需要考虑的是：A. 亲本细胞的生殖隔离问题B. 选择具有优良性状的亲本C. 亲本细胞的融合技术D. 杂种细胞愈伤组织的诱导和再分化参考答案：A7. 下列能够产生抗体的细胞是A. T淋巴细胞B.浆细胞C.B淋巴细胞D.靶细胞参考答案：B8. 农业上为了有效地降低有害昆虫的种群密度，常采用在田间施放人工合成的性引诱剂的方法来治理，性引诱剂的治虫最终要达到（）A．改变昆虫性别比例 B．降低昆虫的出生率C．增加昆虫的死亡率D．改变昆虫的年龄组成参考答案：B9. 下列关于同位素示踪实验的叙述，不正确的是A．给小麦提供14CO2，则14C的转移途径是14CO2→14C3→（14CH2O）B．用含3H标记胸腺嘧啶脱氧核苷酸的营养液培养洋葱根尖，在核糖体处检测不到放射性C．要得到含32P的噬菌体，必须先用含32P的培养基培养大肠杆菌D．小白鼠吸入18O2后，呼出的二氧化碳中不可能含有18O参考答案：D10. 现代生物进化理论认为，生物进化的基本单位是A．基因B．染色体C．个体 D．种群参考答案：D11. 若半透膜允许水分子通过，不允许蔗糖分子通过，初始状态时，半透膜的一侧是蔗糖，一侧是清水，渗透平衡时，半透膜两侧的浓度大小关系是A. 相等B. 水一侧浓度大C. 蔗糖一侧浓度大D. 无法判断参考答案：C半透膜蔗糖溶液一侧浓度较大，吸水力较大，液面升高，渗透平衡时，蔗糖溶液一侧浓度较大，才能维持一定高度的液柱。
pcr-sbt技术原理
pcr-sbt技术原理
PCR-SBT技术是一种高分辨率的基因分型方法，其原理如下：
1.PCR扩增。
PCR-SBT技术首先需要对待测DNA进行PCR扩增，以扩增出要分型的
基因区域。
一般采用多个pair的引物设计，以保证扩增出所有可变位点。
PCR反应过程中，每个可变位点都会扩增出多种长度的片段，这些片段可
以分别代表不同的等位基因。
2.序列反应。
PCR扩增出的片段需要进行测序。
一般采用Sanger测序技术，对片
段进行单链序列反应。
由于PCR扩增出的不同等位基因片段含有不同的序
列变异，因此序列反应后即可获得不同等位基因序列信息。
3.数据分析。
经过序列反应后，得到的数据需要进行分析。
首先要对测序数据进行
整合，以确定每个可变位点的基因型组成。
然后需要进行比对，将新测定
的基因型与已知的基因型进行比对，从而确定其种属和亚种。
最后还要进
行质量控制，检查结果的准确性和可靠性。
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关 键词 ： 落 Ｐ Ｒ ； 火温度 ； ＭＴ一１ 因 降 Ｃ 退 Ｋ 基
中图分 类号 ： ７ Ｑ８
文 献标 志码 ： Ａ
文章 编 号 ：０ ６— ９ ６ ２ １ ） ２一 ０ １ ０ １０ ８９ （００ ０ ＯＯ — ３
Ｔｏ ｈ ｄｏ ｕｃ ｗｎ ＰＣＲ ｏ ｍ ｐｌ ｃ ｔｏ ｆＫＭ Ｔ — ｅ ｓ ｆ ｒａ ｉ ａｉｎ ｏ ｉ ｆ —１ｇ ｎｅ
第２ ８卷 第 ２期 ２１ ０ ０年 ４月
青 海 大 学 学 报 （ 自 然 科 学 版 ） Ｊｕｎ ｌ ｆ ｉｇ ａ Ｕ ｉｅ ｉ （ ａ ｒ ｃｅｃ ） ｏ ｒａ ｏ ｎ ｈｉ ｎｖｒ ｔ Ｎ ｔ ｅＳ ｉ ｅ Ｑ ｓｙ ｕ ｎ
Ｖ０ ． ． １２８ Ｎｏ ２
Ａｐ ． ０１ ｒ２ ０
Ｇｅ ｍ ｉ ｎｏ ｃ ＤＮＡ ｔａ ｔｏ ｔＶｅ ． ０． ｅ ＫＭ Ｔ 一 １ ｇ ｎ ｒ ｇ ｎ ｓｘ ｒ ｃｉｎ Ｋｉ ｒ ２． Ｔｈ ｅ ｅ ｆａ ｍｅ ｔ ｍ ｔａ ｎ ｏ ａ ｔｕ ｅｌ ｌ ｒ
下依赖 Ｄ Ａ聚合 酶的酶促反应 ＿ 。试验 中经常 出现 ２种情况 ： Ｎ ｌ Ｊ 一种是 因未找到最 佳扩增条件 导致产生大 量
非特异性产物 ， 另一种情况是未扩增 出任何产物 。影 响 Ｐ Ｒ的因素很多 ， Ｃ Ｃ Ｐ Ｒ仪器性能 的制约 是一个不 可
排除的因素 ， 还有反应体系和反应条件 的设 置 ， 这些 因素均影 响 Ｐ Ｒ扩增 的结 果 ， 中退火 温度更是至关 重 Ｃ 其 要 ＿ 。降落 Ｐ Ｒ主要针对退火温度不确定 的基 因扩增 ， ２ Ｃ 通过设计多个循环使相连循 环的退火温度越来越低 以扩增 出 目的片段 的一种扩增方法 。作为一种行之有效 的 Ｄ Ａ体 外扩增方法 ， Ｎ 降落 Ｐ Ｒ 目前 已被广泛 Ｃ 使用。本 文利用 降落 Ｐ Ｒ技术在 Ｍｙ ｅｅ Ｓｒ ｓ ｅ ｉ ｈｒ ｌ ｙｌ ｏ ｅ Ｍ ２ 型 Ｐ Ｒ仪上试扩增 了 Ｃ Ｇ ｎ ｅ ｅ ｈｅ Ｔ ｅ ｃ ｒ ｄｌ Ｇ ５＋ ｉ Ｐ ｒ ｍａ Ｃ ｅ Ｍ Ｃ 牦牛源多杀性 巴氏杆菌 （Ａ ８ 的 Ｋ Ｔ一１ Ｃ ７— ） Ｍ 基因片段 ， 了比较理想的结果 。 获得
Ｋ ｅ ｏ ｄｓ：ｏ ｃ ｏ ＣＲ ； ｎ ａ ｉ ｇ ｔｍ ｐ ｒ ｔ ｅ； ｙｗ ｒ ｔｕ ｈ ｄ ｗｎ Ｐ ａ ｎｅ ｌｎ ｅ ｅ ａｕｒ ＫＭ Ｔ 一 １ ｇ ｎ ｅｅ
聚合酶链式反应 （ ｏ ｍ ｒ ｅｃａｎｒａｔ ｎ Ｐ Ｒ 是在模板 Ｄ Ａ、 ｐｌ ｅａ ｈｉ ｅｃ ｏ ，Ｃ ） ｙ ｓ ｉ Ｎ 引物 和 ４种脱氧核糖核苷酸存在的条件
Ｚ ＡＮＧ Ｒｕｑａ ｇ，ＡＮ Ｐ ｎ ， Ｈ Ｈ ｉｉｎ Ｆ ｉｇ Ｚ ＡＮＧ Ｈｏ ｇｉｎ Ｚ ＡＯ ｉｇ ｎｊ ，Ｈ ａ Ｊｎ
（ ｇ ｃｌ ｒ ｎ ｎｍ ｌ ｓａ ｄｙＣ ｌ ｇ ， ｉｈｉ ｎｖｒ ｔ， ｉｉ １０ ６ Ｃ ｉａ Ａ ｎ ｕｔ ｅａ ｄＡ ｉ ａ Ｈｕｂ ｎ ｒ ｏ ｅ ｅ Ｑｎ ａ Ｕ ｉ ｓ ｙ Ｘ ｎ ｇ８０ １ ， ｈｎ ） ｕ ｌ ｅｉ ｎ
普 通 Ｐ Ｒ扩增 Ｋ Ｃ ＭＴ一１ 因片段 。结 果表 明 ： 落 Ｐ Ｒ法扩 增 出 Ｋ 基 降 Ｃ ＭＴ一１ 因片段 的特异性 基
条带 与 目的 片段 长 度一 致 ，普 通 Ｐ Ｒ法没 有结 果 。相 同的反 应体 系， 落 Ｐ Ｒ程序 能 明显提 Ｃ 降 Ｃ
高 Ｐ Ｒ 的特异 性 ， 用于扩 增普 通 Ｐ Ｒ难 以扩增 的基 因片段 。 Ｃ 可 Ｃ
利 用 降 落 Ｐ Ｒ扩 增 Ｋ Ｃ ＭＴ一１基 因
张瑞 强 ， 繁 萍 ， 红见 ， 张 赵 静
（ 海 大 学农 牧 学 院 ， 海 西 宁 青 青 ８０１） １０ ６
摘要 ： 用试 剂盒提 取 一株 牦牛 源 多杀性 巴氏杆 菌 （ ４ ８ 基 因组 Ｄ Ａ， Ｃ ７— ） Ｎ 同时应 用降 落 Ｐ Ｒ和 Ｃ
Ａ ｓ ａｔＴ ｅ ｔ ｇｔＫ ｂ ｔ ｃ ：ｏｇｔ ａ ｅ ＭＴ一１ｇ ｎ ｓｂ ｉ ｐｅａ ｄ ｅ ｃ ｎ ｔ ｃ ｏ ｎ Ｐ Ｒ （ Ｄ—Ｐ Ｒ） ｒ ｒ ｅ ｅ ｙａｓ ｌ ｎ ｆ ｉ ｔ ｏ ｈ ｄ ｗ Ｃ ｍ ｉ ｆ ｅ ｕ Ｔ Ｃ ．
Ｇｅ ｍｉ ｎｏ ｃ ＤＮＡ ｒ ｍ ｔａ ｎ ｏ ａ ｔｕ ｅｌ ｈ ｃｄａ ｗａ ｘｒ ｃ ｅ Ｋａ ｎ ＢＥＳ Ｂａ ｔ ｒａ ｆｏ ａ ｓｒ ｉ ｆ Ｐ ｓｅ ｒ ｌａ Ｍｕ ｏ ｉ ｓ ｅ ｔａ ｔｄ ｂｙ Ｔａ Ｒａ Ｍｉ ｉ Ｔ ｃｅ ｉ ｌ