胆碱能抗炎通路调节肺泡巨噬细胞极化减轻急性肺损伤的机制研究

胆碱能抗炎通路调节肺泡巨噬细胞极化减轻急性肺损伤的机制

研究

背景与目的:急性肺损伤(ALI)为脓毒症的常见并发症,发病率和死亡率居高不下。肺泡巨噬细胞(AM)在ALI的防御和修复中起着重要的作用。

在不同微环境刺激下,巨噬细胞可发生M1和M2极化,但AM的极化及对ALI 的影响尚不明确。GTS-21为胆碱能抗炎通路(CAP)选择性α 7烟碱型乙酰胆碱受体激动剂(α7nAChR),在ALI的治疗中具有广阔的应用前景。

然而,GTS-21介导的抑制炎症反应的分子机制仍有部分不清楚。高迁移率族蛋白-1(HMGB1)可激活黑素瘤缺乏因子2(AIM2)炎症小体复合物引起促炎反应,

且两者在ALI中均具有重要的作用。

然而HMGB1与AIM2之间的相互作用机制尚不清楚。巨噬细胞可表达AIM2

炎症小体复合物和HMGB1的主要受体:晚期糖基化终产物受体(RAGE)、Toll样受体2、4(TLR 2、TLR4)来传递细胞内信号。

研究目的:1.探索GTS-21通过调节AM的极化功能来参与脂多糖(LPS)所致ALI的抗炎机制;2.探索HMGB1通过调节AM的极化功能来参与LPS所致ALI的炎症反应机制。方法:第一部分:从C57BL/6小鼠肺泡灌洗液(BALF)中提取AM,刺激后极化为M1型AM和M2型AM。

再将M1和M2型AM分别注入去除AM的小鼠气道,然后建立LPS所致ALI模型,观察M1和M2型AM对LPS所致ALI小鼠肺损伤评分、肺水肿程度和肺部炎症因子的影响。第二部分:建立LPS所致ALI小鼠模型,分为空白对照组、LPS组、GTS-21组和GTS-21+LPS组。

体外培养AM,在有无LPS和有无GTS-21的刺激下,分为同样四组。通过体内

和体外实验观察GTS-21对LPS所致ALI中AM的数量、AM的极化以及对HMGB1分泌的影响。

第三部分:应用anti-HMGB1或rHMGB1干预LPS所致ALI小鼠,测定干预措施对肺组织炎症损伤、AIM2炎症小体复合物的蛋白以及mRNA表达。通过流式细胞学检测M1型AM表面相关因子(MHCⅡ、CD80、CD86、CD40)和M2型AM表面相关因子(CD206、IL-10)的表达水平。

体外培养骨髓来源的巨噬细胞,观察Anti-HMGB1或rHMGB1刺激后AIM2炎症小体复合物的蛋白以及mRNA表达以及M1和M2型AM表面相关因子的表达。第四部分:为了验证HMGB1对巨噬细胞的作用通路,应用anti-HMGB1或rHMGB1作用于LPS所致ALI小鼠,观察TLR2/4、RAGE受体和NF-κB表达水平的变化;应用TLR2/4和RAGE受体拮抗剂作用于LPS所致ALI小鼠,观察肺部炎症和AIM2炎症小体复合物的变化。

在体外培养的巨噬细胞中加入以上干预措施,观察AIM2炎症小体复合物的变化。结果:(1)M1型AM可加重LPS所致ALI的促炎反应。

主要表现为:肺MPO活性增强,肺W/D上升,BALF中(TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1)的水平明显增高。M2型AM可减轻LPS所致ALI小鼠的炎症反应,主要表现为肺损伤评分降低,肺MPO活性和肺W/D减低,BALF中MCP-1的水平降低。

(2)在LPS所致ALI小鼠中,GTS-21可减轻肺组织炎症,减少AM的数量及炎症因子的表达,降低肺组织、血浆以及BALF中HMGB1的分泌和表达。GTS-21可降低LPS所致ALI小鼠和体外培养的AM中M1型AM生物活性分子iNOS和促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-12)的水平,增加M2型AM生物活性分子 Arg1、Ym1 和抗炎因子(CCL17、CCL22、CCL24)的水平。

(3)抗HMGB 1抗体可减轻LPS所致ALI小鼠肺组织炎症,抑制AIM2炎症小体复合物的活性,抑制AM向M1极化;rHMGB1可增加LPS所致ALI小鼠肺组织炎症,增强AIM2炎症小体复合物的活性,促进AM向M1极化。(4)抗HMGB 1抗体可下调LPS所致ALI中TLR 2、TLR 4和RAGE/NF-κB的表达;rHMGB 1可上调上述受体的表达;(TLR2、TLR4受体拮抗剂)LPS-RS和(RAGE受体拮抗剂)FPS-ZM1能抑制LPS所致ALI肺部炎症,降低AIM 2炎症小体复合物的表达。

结论:(1)M1型AM可加重LPS所致ALI肺组织炎症;M2型AM可减轻LPS所致ALI肺组织炎症。(2)胆碱能抗炎通路可通过减少AM的数量,抑制M1型AM的极化,抑制AM内HMGB 1的分泌来减轻LPS所致ALI。

(3)HMGB1可通过激活AIM2炎症小体复合物和促进AM的M1极化来参与LPS 所致ALI的炎症反应过程。(4)在LPS所致ALI中,HMGB1激活AIM2炎症小体复合物和促进巨噬细胞的M1极化的作用可能是通过TLR2、TLR4、RAGE和NF-κB 通路来实现的。