木糖异构酶酶活测定方法
酶学思考题
1、简述酶学的发展历史。
（主要记住获得诺贝尔奖的人物和事件。
）1833之前，酶可以产生酒精；1833~1926，酶是某些具有生物催化功能物质，其中一些来自生物体（埃米尔·菲舍尔，研究糖和嘌呤衍生物的合成，获1902年诺贝尔奖；巴克纳兄弟，无细胞发酵，发酵是酶在起作用，或1907年诺贝尔奖）1926~1982，酶是具有生物催化功能蛋白质（萨姆纳，脲酶结晶，提出每的蛋白质本质，获1964年诺贝尔奖；桑格，因发现胰岛素分子结构和确定核酸的碱基排列顺序及结构，分别获1958和1980诺贝尔奖；斯坦福·穆尔和威廉·雷华德·斯坦，研究酶化学的基本理论，或1972年诺贝尔奖；）1982~Today，酶是具有生物催化功能的生物大分子，他们包括2类：P酶和R酶（托马斯切赫和西德尼奥特曼，发现核糖核酸催化性质的，获1989年诺贝尔奖）2、简述蛋白类酶的六大分类。
Oxidoreductases氧化还原酶；Transferases转移酶； Hydrolases水解酶；Lyases裂合酶；Isomerases异构酶；Synthetases/Ligases连接酶3、蛋白类酶中的全酶主要由哪几部分组成？其中辅因子包括哪些？酶蛋白和辅因子；辅基或辅酶和金属离子4、简述酶的特殊结构特征。
active center / active site（活性中心）：包括酶与底物结合的位点和催化位点essential group（必需基团）：氨基酸残基的化学侧链与酶活性密切相关5、研究酶动力学时，需要考虑哪些因素？Concentration of enzyme酶浓度, Concentration of substrate底物浓度, pH, temperature, inhibitors 抑制剂, activators激活剂,6、简述Km值的意义可以用来代表酶与底物的亲和力；Km值可以判断酶的专一性和天然底物；Km值可以帮助推断某一代谢反应的方向和途径；从k m的大小，可以知道正确测定酶活力时所需的底物浓度7、掌握Km、Vmax的测定方法。
多种酶酶活测定方法
木聚糖酶活力的测定方法1.木聚糖酶活力单位定义在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u。
2.测定原理木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖。
具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。
反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。
因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中木聚糖酶的活力。
3.试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。
3.1 乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。
加水溶解，定容至100ml。
3.2 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L：称取三水乙酸钠1.36g。
加水溶解，定容至100ml。
3.3 氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L：称取氫氧化鈉20.0g。
加水溶解，定容至100ml。
3.4 乙酸——乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH—CH3COONa）为0.1mol/L，pH值为5.5：称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。
再加水溶解，定容至2000ml。
测定溶液的pH值。
如果pH值偏离5.5，再用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节至5.5。
3.5木糖溶液，c（C5H10O5）为10.0mg/ml：称取无水木糖1.000g，加缓冲液（3.4）溶解，定容至100ml。
3.6 木聚糖溶液：1.0%（w/v）称取木聚糖（Sigma X0672）1.00g，加入氢氧化钠0.34 g，磁力搅拌再加入60ml水，磁力搅拌至木聚糖完全溶解。
再加入冰乙酸0.5 ml，再用乙酸溶液（3.1）调节pH值至5.5。
继续搅拌30min，用缓冲液（3.4）定容至100ml。
木聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。
测酶活方法
1. POD活性测定：称取组织1g放于研钵中，加5 ml 0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH5.5）在冰浴中研磨成匀浆。
将匀浆全部转入离心管中，在3000rpm，4℃条件下离心10min，上清液为酶粗提液，4℃保存备用。
取酶液100μL，加反应混合液1. 2.9ml 0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH5.5)2. 1 ml 0.05mol/L愈创木酚溶液，0.05mol/L愈创木酚溶液,0.06207g愈创木酚定容10ml3. 1.0 ml 2%H2O2, 30% H2O2670μL，加水至10ml.在37℃水浴中混合均匀，于470nm处测定其吸光度，连续记录3min。
以不加酶的反应混合液作对照，每30秒钟读一次数，以每分钟吸光度值变化值0.01为一个酶活单位。
酶活计算: OD290。
g- 1.FW.h- 1=OD变化值/材料鲜重/反应时间2. CAT活性测定：设置两个重复一个对照,测定体系包括1. 0.2 ml酶液、2. 1.5 ml磷酸缓冲液pH7.0、3. 1 ml蒸馏水，4. 25℃预热后逐管加入300μL 0.1 mol/L的H2O2在240 nm下测定吸光度，每隔1 min读一次，共测3 min，以1 min内减少0.1的酶量为1个酶活单位。
0.1 mol/L的H2O2：30% H2O256.8μL加水至10ml.3. SOD活性的测定：采用改进的高灵敏度的氯化硝基氮兰四唑（NBT）光还原法测定SOD 活性。
每处理取3个小烧杯，分别加入3mLSOD反应液（参照附录B），A）0.lmol/L pH7.8磷酸缓冲液准确称取0.72gNa2HPO4·12H2O溶于20ml水中取18.3mL；准确称取0.312gNaH2PO4·2H2O溶于20mL水中取1.7mL，混合并定容至20mL。
（B）104mmol/L的甲硫氨酸称取0.39g甲硫氨酸溶解并定容至25mL。
（C）0.3mmol/L的NBT 称取0.0025g氯化硝基氮兰四唑（NBT），溶解后定容于10mL。
三种主要酶活测定方法
土壤纤维素酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法）一、原理纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。
在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。
所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。
纤维素酶解所生成的还原糖与3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。
二、试剂1）甲苯2）1%羧甲基纤维素溶液：1g 羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。
3）pH5.5醋酸盐缓冲液：0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L.0.2mol/L 醋酸钠溶液 16.4g C2H3O2Na或27.22g C2H3O2Na.3H2O溶至1L.取11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和88ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液混匀即成PH 5.5醋酸盐缓冲液. 4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml 2mol/LNaOH和125ml水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天），5）葡萄糖标准液（1mg/mL）预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。
准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。
若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。
三、操作步骤葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
称10g土壤置于50ml三角瓶中，加入1.5ml甲苯，摇匀后放置15min，再加5ml 1%羧甲基纤维素溶液和5ml pH5.5醋酸盐缓冲液，将三角瓶放在37℃恒温箱中培养72h。
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法生物样品预处理预冷解剖用具，采用颈后断头的方法将鱼杀死，立即取肝脏、腮、脑，操作均在4℃下进行，用预冷的0.15 mol/L KCl 溶液洗去血丝，用滤纸吸干后称重。
将肝、脑组织放入预冷的Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 mol/L KCl)匀浆（匀浆比（W/V）1:5），腮组织放入组织匀浆（匀浆缓冲液含40mmol/L咪唑，250mmol/L蔗糖，5mmol/L EDTA，pH7.0），匀浆比为1:40，匀浆速率为10000g，以15s为周期，重复3次。
分别取1ml匀浆液放入1.5ml离心管进行离心，4℃下离心(9000g，20min)，取上清液-80℃下保存，待测。
（1）250mL 0.15 mol/L KCl：取2.7956g（2）Tris-HCl缓冲液：125mL 0.1 mol/L Tris（1.5143g）+ 105mL 0.1 mol/L HCl+ KCl（0.15*0.23*74.55=2.5720g）（Na+＋K+）－ATPase活性的测定1、试剂（1）匀浆液（250ml）：40mmol/L咪唑0.6808g+250mmol/L 蔗糖21.3931g +5mmol/LEDTA 0.3653g（2）反应缓冲液（250ml）：80mmol/L咪唑1.3616g+4mmol/LMgCl2 0.2033 g+40mmol/LKCl 0.7455g（3）16mmol/L Na2ATP（10ml）：0.0988g（4）30%三氯乙酸（TCA）9g TCA+21mlH2O（5）定磷试剂（硫酸亚铁-钼酸胺试剂100ml）：10ml 5mol/LH2SO4+1.3556 g钼酸铵+90mlH2O每10ml加入FeS040.5g（FeS04·7H2O 0.0941g），25ml加入FeSO4·7H2 O 0.2353g，临用前配制。
酶活测法
酶活测定的方法[测定酶活]1.MDA的测定【原理】丙二醛在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5-三甲恶唑2,4-二酮），其最大吸收波长在532nm。
但是测定植物组织中MDA 时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，532nm处也有吸收。
植物遭受胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA-TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。
【试剂】（1）、0.5%硫代巴比妥酸（TBA）：称取硫代巴比妥酸，先加少量氢氧化钠（1mol/L）溶解，再用10%的三氯乙酸定容。
（2）、10%三氯乙酸（TCA）：10g三氯乙酸，蒸馏水定容至100ml。
【实验步骤】称取剪碎试材0.15g，加入3 mL 10% TCA（三氯乙酸），可多次加入↓4000 r/min离心15min↓吸取上清液3mL（对照加2mL蒸馏水），加入0.6%的硫代巴比妥酸（TBA）溶液1mL，混匀，将混合物于沸水浴中反应15min，迅速在冷水中冷却。
↓取上清液测定450﹑532和600 nm波长下的消光度。
按下式直接计算得植物样品提取液中MDA的浓度。
计算丙二醛含量C=6.45（A532-A600）－0.56A450单位：μmol /L2.超氧歧化酶(SOD)的测定【原理】SOD活性的测定采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法测定。
氮蓝四唑(NBT)在光下被O2。
-还原为蓝甲替，该物质在560nm处有最大的吸收峰。
SOD能通过降低O2。
-的量而抑制NBT的光还原过程，使的蓝甲替量降低，其降低程度与酶活性有关。
以每小时抑制氮蓝四唑还原反应50%的每克鲜重所含的酶量为一个活性单位。
【试剂】（1）、0.05mol/L磷酸缓冲液pH7.8（2）、反应介质：NBT 750μmol/LEDTA 0.1mmol/L蛋氨酸130mmol/L核黄素20μmol/L磷酸缓冲液0.05mol/L（3）、750μmol/L NBT溶液：称取0.06133g NBT，用0.05mol/L pH7.8磷酸缓冲液溶解并定容至100ml,避光保存,现配现用。
木糖苷酶活性的测定方法
木糖苷酶活性的测定方法
β-木糖苷酶活性是由从底物对硝基苯酚-β-D-木糖苷（pNPX，Sigma)释放出对硝基苯酚(pNP)的量来确定的。
采用分光光度法[50]。
测定体系总体积为800μL，反应体系为200μL，内含10μL20mmol/L底物pNPX、185μL 100mmol/L pH6.0的邻苯二甲酸氢钾-咪哇缓冲液、5μL适量稀释粗酶液，于65℃反应5min,然后加入600μL1mol/L的Na2CO3溶液终止反应并显色，在405nm处测定光吸收值的增加量。
一个酶活单位定义为在该反应条件下，lmin内催化产生1μmol的对硝基苯酚所需要的酶量。
用对硝基苯酚作标准曲线[51].
用对硝基苯酚(pNP)作标准曲线，具体方法:木糖苷酶对人工底物对硝基苯酚-β-D-木糖苷（pNPX，Sigma)水解后的产物为对硝基苯酚(pNP)，碱性条件下它在405nm处有明显的光吸收值。
配制浓度为1μmol/m1的对硝基苯酚，然后用不同体积的对硝基苯酚和水混匀，使二者总体积为200μL，最后用同样的1mol/L的Na2CO3终止显色，在405nln处测吸光值，pNP的量与A405成线性关系(图2-l)。
酶活测定方法
、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
酶活的测定方法
酶活测试及试剂1 木素过氧化物酶（Lip）：3ml反应体系：①0.1mol/L酒石酸缓冲液(pH3.0) 1.5mL；②10mmol/L藜芦醇1.0mL；③粗酶液0.4mL；④10mmol/L H202 0.1mL启动反应，25℃反应3min。
于310nm测其光密度，以1.0mL缓冲液代替藜芦醇作空白对照，定义每分钟使1μmol的藜芦醇氧化成藜芦醛所需的酶量为一个酶活力单位(U)，藜芦醛的摩尔吸光系数9 300 mol-1cm-1。
0.1mol/L酒石酸缓冲液(pH3.0)：配0.1mol/L的酒石酸和酒石酸钠溶液各100mL，然后分别取出部分混合均匀至pH值为3.0。
（酒石酸：分子量75，0.1mol/L溶液为7.5g/L。
酒石酸钠：分子量230，0.1mol/L溶液为23g/L）10mmol/L藜芦醇：1.682g藜芦醇添加到1L水中即可（试剂藜芦（3,4-Dimethoxybenzyl alcohol）的分子量为168.19）10mmol/L H202（按1L计算）：称取1.13g过氧化氢试剂加入到1L纯水中即可（原试剂含30% H202）2 锰过氧化物酶（MnP）：3ml反应体系：① 0.05mol/L琥珀酸缓冲液（丁二酸）(pH4.5) 2.0mL；②15mmol/LMnSO4 0.5mL；③粗酶液0.4mL；④10mmol/L H202 0.1mL启动反应，37℃反应3min。
240nm测吸光值变化。
三价锰离子的吸光系数为8100 M−1 cm−1）0.05mol/L琥珀酸缓冲液（丁二酸）(pH4.5)：配0.05mol/L的琥珀酸和琥珀酸钠溶液各100mL，然后分别取出部分混合均匀至pH值为4.5。
（琥珀酸：分子量118.09，0.05mol/L 溶液为5.9g/L。
琥珀酸钠：分子量270.15，0.05mol/L溶液为13.5g/L）15mmol/L MnSO4（按1L计算）：2.535g硫酸锰加入到1L纯水中溶解即可。
d-木糖检测标准
d-木糖检测标准
木糖（D-木糖）是一种六碳单糖，常被用于检测生物样品中是否存在木糖酶活性。
以下是D-木糖检测的一般标准：
1. 材料准备：购买甲基红试剂和木糖标准品（纯度大于99%）。
2. 样品制备：待检生物样品需要经过适当的处理和处理，以提取或释放木糖。
3. 控制组准备：准备一组不含木糖的样品作为阴性对照组。
4. 学员组准备：将待检生物样品分为适当的学员组。
5. 样品处理：根据实验方案的要求，将样品和试剂混合均匀。
6. 试剂添加：将甲基红试剂按照规定的比例添加到样品中，充分混合。
7. 反应条件：对于甲基红法，通常在37摄氏度下孵育一段时间（通常为30分钟）。
8. 反应停止和观察：根据实验方案的要求，用适当的方法停止反应并观察反应结果。
9. 比色测定：根据实验方案，可以使用光度计或比色管等设备测定样品的吸光度。
10. 数据处理：根据实验方案的要求，采用适当的统计方法对数据进行处理，并得出结论。
需要注意的是，具体的D-木糖检测标准可能会因不同实验方案而有所不同，上述步骤仅为一般参考。
在进行实验之前，应仔细阅读和理解实验方案，并遵循实验室的操作规范和安全要求。
xylose isomerase iupac名称
xylose isomerase iupac名称【1】木糖异构酶的简介木糖异构酶（xylose isomerase），是一种具有生物催化作用的酶，能够促使木糖分子发生异构化反应，生成不同的糖类化合物。
木糖异构酶广泛存在于自然界，尤其在植物和微生物中具有重要作用。
【2】木糖异构酶的作用和应用木糖异构酶在生物体内起着关键作用，例如在植物中，它有助于木糖的合成和代谢。
此外，木糖异构酶在食品、医药等领域也有着广泛应用。
例如，在食品工业中，木糖异构酶可用于生产高果糖玉米糖浆，提高食品的甜度。
在医药领域，木糖异构酶可用于治疗一些糖代谢紊乱疾病，如糖尿病等。
【3】木糖异构酶在国际上的研究进展在国际上，木糖异构酶的研究已取得显著成果。
科学家们不仅对木糖异构酶的催化机制进行了深入研究，还通过基因工程等技术，实现了对木糖异构酶的改造，提高了其催化效率和稳定性。
【4】我国在木糖异构酶研究中的成果我国在木糖异构酶研究方面也取得了丰硕成果。
科学家们通过对木糖异构酶的结构和功能进行深入研究，不断创新和优化催化剂，提高了木糖异构酶的活性和应用范围。
此外，我国还积极开展木糖异构酶在生物炼制、新型糖源开发等领域的应用研究。
【5】木糖异构酶在食品、医药等领域的具体应用以木糖异构酶为核心技术，我国已成功研发出了一系列高果糖浆、低聚糖等产品，实现了产业化生产。
在医药领域，我国研究人员发现木糖异构酶具有降低血糖、改善糖代谢的作用，正在进行相关药物的开发。
【6】木糖异构酶的未来发展趋势和挑战随着生物技术的不断发展，木糖异构酶在食品、医药、生物能源等领域的应用前景十分广阔。
然而，要充分发挥木糖异构酶的潜力，还需克服一些挑战，如提高酶的稳定性、降低生产成本等。
酶活力测定讲解
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２.试剂 ? Folin- 酚试剂见“蛋白质含量测定”。 ? 0.4mol/L 碳酸钠溶液。 ? 0.4mol/L 三氯乙酸溶液。 ? 缓冲溶液
①PH7.5 磷酸缓冲液，适用于中性蛋白酶。 ②pH3.0 乳酸缓冲液，适用于酸性蛋白酶。 ③pH10.5 硼酸缓冲溶液，适用于碱性蛋白酶。
取两个100ml三角瓶分别于空白瓶和样品瓶中各加底物溶液4ml和磷酸缓冲液5ml于空白瓶加入95乙醇15ml40水浴预热5min然后在两瓶中各加待测酶液1ml立即混匀计时40水浴中准确反应15min在样品瓶中立即补加95乙醇15ml终止反应取出于空白瓶和样品瓶中各加酚酞指示液005mollnaoh标准溶液滴定直至微红并保持30s不退为其终点记录消耗005mollnaoh标准溶液的体积201951035计算酶活力定义
上述各种缓冲溶液，均须用 pH计校正。
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10g/L 酪蛋白溶液：称取酪蛋白 1.000g ，准确至 0.001g ，用少量 0.5mol/L NaOH 溶液（若酸性 蛋白酶则用浓乳酸 2～3滴）湿润后，加入适量 的各种适宜 pH 的缓冲溶液约 80mL ，在沸水浴 中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转 入100mL 容量瓶中，用适宜的 pH 缓冲溶液稀 释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为 3d 。
１.原理 α-淀粉酶水解淀粉为小相对分子质量的
糊精和少量的麦牙糖及葡萄糖，使淀粉 与碘呈蓝紫色反映逐渐变红棕色直至消 失，观察并测定颜色的消失速度可以衡 量酶活力的大小。
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２.试剂 原碘液：同“分光光度法”。 稀碘液：同“分光光度法”。
20g/L 可溶性淀粉溶液：同“分光光度法”
木糖异构酶酶活测定方法
木糖异构酶酶活测定方法：采用XI-SDH(木糖异构酶偶联山梨醇脱氢酶)一步法（Kuyper M et al.2003）：100mM，pH7.5Tris- HCl，500 mM xylose，10 mMMgCl2，粗酶液10μl，1U SDH，0.15 mM NADH，在340nm下检测NADH 被氧化的量（即在340nm下做时间扫描）。
酶的比活力定义为每mg酶蛋白，每分钟转化NADPH的μmol L-1数，即U mg-1蛋白。
酶活力测定还可以采用XI-SDH两步法（Lönn A et al.2002）：第一步：500mmol/L D-木糖，粗酶液10μl，10 mmol/L MgCl2，100mmol/L Tris-HCl pH7.5 缓冲液，作为底物溶液。
将底物溶液在30℃下保温，加入粗酶液10μl，在30℃下反应10 min，加入150µL 50%三氯乙酸终止反应和185µL 2M Na2CO3中和反应缓冲液。
第二步：取0.1 mL反应液加入100mM，pH7.5Tris- HCl，1U SDH(sigma)和0.15mM NADH，立即混匀，30℃下在340 nm下检测NADH被氧化的量（即在340 nm做时间扫描）。
酶的比活力定义为每mg酶蛋白，每分钟转化NADPH 的μmol L-1数，即U mg-1蛋白。
2.9.4木糖异构酶最适反应温度的测定采用XI-SDH两步法（Lönn A et al.2002）：第一步：500mmol/L D-木糖，10 mmol/L MgCl2，100mmol/L Tris-HCl pH7. 5 缓冲液，作为底物溶液。
将底物溶液在不同温度（20℃-80℃）下保温，加入粗酶液10μl，在不同温度下反应10 min，加入150µL 50%三氯乙酸终止反应和185µL 2M Na2CO3中和反应缓冲液。
第二步：取0.1 mL反应液加入100mM，pH7.5Tris- HCl，1U SDH(sigma)和0.15mM NADH，立即混匀，30℃下在340 nm下检测NADH被氧化的量（即在340 nm做时间扫描）。
一株嗜热菌木糖异构酶的纯化与性质研究
一株嗜热菌木糖异构酶的纯化与性质研究张波;殷燕【摘要】研究了1株嗜热菌(Anoxybacillus flavithermus)所产木糖异构酶的分离纯化以及酶学性质.结果表明,经硫酸铵沉淀、Sephadex G-75凝胶过滤、纤维素DE-52弱阴离子交换柱和Q Sepharose Fast Flow 强阴离子交换层析得到的木糖异构酶,分子量约为181 ku,由4个相同分子量的亚基组成.酶反应的最适温度为80℃,最适为pH为7.0且最适pH范围宽泛,pH6.0～11.0酶反应活性能保持80%左右.该酶热稳定性及耐碱性能良好,70℃保温1 h后酶活仍能保持近80%左右;pH5.0～8.0保温1 h后酶活仍能保持近80%以上,甚至pH12.0保温1 h后酶活性仍能保持40%左右.Mn2+ 和Co2+ 对酶活性有明显促进作用,Zn2+、Cu2+以及Al3+对酶活性有一定程度的抑制.%A xylose isomerase produced by thermophilic bacterium Anoxybacillus flavithermus was purified using Sephadex G- 75 gel filtration, DEAE-cellulose anion exchange chromatography and Q Sepharose Fast Flow anion exchange chromatography. The estimated molecular mass of the purified xylose isomerase was 181 ku and was made up of four sub-groups. The optima temperature and pH of enzymatic reaction were 80℃ and pH 7. 0, respectively. This xylose isomerase is alkali- tolerant and thermo-stable: the enzyme activity keep about 80％in 70℃ for lh and keep abo ut 80％ in pH5. 0 ～ 8.0 for 1 h, even keep about 40％ in pH12.0 for 1 h. The enzyme was mainly activated by Mn2+ and Co2+ but was mainly restrained byZn2+ , Cu2+ and Al3+.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2011(037)003【总页数】5页(P13-17)【关键词】嗜热木糖异构酶;酶的纯化;酶学性质【作者】张波;殷燕【作者单位】北京联合大学应用文理学院,北京,100191;北京中恒意美环境工程技术有限公司【正文语种】中文木糖异构酶 (xyloseisomerase,XI,EC 5.31.1.5),又称葡萄糖异构酶,此酶在细胞内可将五碳糖D-木糖转化为D-木酮糖,在微生物体内的糖代谢过程中起着重要的作用。
酶活,糖,蛋白,叶绿素含量测定方法总结
生理实验方法总结酶提取液制备称取干净叶片0.5g于预冷研钵中，加2ml的提取介质﹙PH7.8的50 mmol·L-1磷酸缓冲液﹚，充分研磨后，加提取介质冲洗钵体，并使最终体积为5ml，6000rpm离心30min，上清液即为提取液。
供SOD、CAT、POD、MDA和蛋白质含量测定。
1、叶片相对含水量：先求叶片鲜重Wf，然后将叶片浸入蒸馏水中数小时（要48h左右叶片质量才不会增加），使叶片吸水成饱和状态。
取出用吸水纸吸取表面的水分，立即放入已知重量的称瓶中称重，再放入蒸馏水中一段时间后取出吸干外面水分，再称重，直至重量不再增加为止。
此时即为叶片吸水饱和时的重量Wt，再将样品烘干，求得组织干重Wd，即得相对含水量=（Wf-Wd）/（Wt-Wd）×100%注：Wf——叶片鲜重（g）；Wd——叶片干重（g）；Wt——叶片饱水重（g）。
2、比叶重：单位面积的叶片的干重，避开主脉。
3、相对电导率：取大小相当的植物叶片(尽量保证叶片的完整性,少含茎节),用自来水洗净后再用蒸馏水冲洗3次,用滤纸吸干表面水分,将叶片剪成适宜长度的长条(避开主脉),快速称取鲜样3份,每份0.1g,分别置于10ml去离子水的刻度试管中,盖上玻璃塞置于室温下浸泡处理12h.用电导仪测定浸提液电导(R1),然后沸水浴加热30min,冷却至室温后摇匀,再次测定浸提液电导(R2).相对电导率=R1/R2!100% 4、叶绿素含量：将采回的样叶快速洗净擦干，去中脉，称取0.1g，加10ml95%的乙醇，在黑暗中泡45h（直到叶片发白）。
于721分光光度计测定在波长D470nm、645nm 和663nm下的光密度（OD值），按照Arnon公式，计算出每克叶片的叶绿素a,b和叶绿素总的含量：叶绿素a(mg/g鲜重)=（12.7D663-2.69D645）*[V/（1000*W）]叶绿素b(mg/g鲜重)=（22.9D645-4.63D663）*[V/（1000*W）]叶绿素总含量(mg/g鲜重)=（20.2D645+8.2D663）*[V/（1000*W）]类胡萝卜素含量(mg/g鲜重)=(1000D470－2.05Ca－114.8Cb)/245式中：D---光密度读数V---叶绿素提取液总体积（10ml）W---所用叶片鲜重（g）5、MDA含量的测定：用硫代巴比妥酸法：取干净试管，加入酶提取液1mL，然后再加入3ml10%的TCA和1ml 0.6%的TBA，摇匀，混合液在95℃水浴中保温30min，迅速冷却后，4000rpm下离心10min，取上清液分别于600nm，532nm，450nm波长下测定吸光度值。
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木糖异构酶酶活测定方法：采用XI-SDH(木糖异构酶偶联山梨醇脱氢酶)一步法（Kuyper M et al.2003）：100mM，pH7.5Tris- HCl，500 mM xylose，10 mMMgCl2，粗酶液10μl，1U SDH，0.15 mM NADH，在340nm下检测NADH 被氧化的量（即在340nm下做时间扫描）。
酶的比活力定义为每mg酶蛋白，每分钟转化NADPH的μmol L-1数，即U mg-1蛋白。
酶活力测定还可以采用XI-SDH两步法（Lönn A et al.2002）：第一步：500mmol/L D-木糖，粗酶液10μl，10 mmol/L MgCl2，100mmol/L Tris-HCl pH7.
5 缓冲液，作为底物溶液。
将底物溶液在30℃下保温，加入粗酶液10μl，在30℃下反应10 min，加入150µL 50%三氯乙酸终止反应和185µL 2M Na2CO3中和反应缓冲液。
第二步：取0.1 mL反应液加入100mM，pH7.5Tris- HCl，1U SDH(sigma)和0.15mM NADH，立即混匀，30℃下在340 nm下检测NADH被氧化的量（即在340 nm做时间扫描）。
酶的比活力定义为每mg酶蛋白，每分钟转化NADPH 的μmol L-1数，即U mg-1蛋白。
2.9.4木糖异构酶最适反应温度的测定
采用XI-SDH两步法（Lönn A et al.2002）：第一步：500mmol/L D-木糖，10 mmol/L MgCl2，100mmol/L Tris-HCl pH7. 5 缓冲液，作为底物溶液。
将底物溶液在不同温度（20℃-80℃）下保温，加入粗酶液10μl，在不同温度下反应10 min，加入150µL 50%三氯乙酸终止反应和185µL 2M Na2CO3中和反应缓冲液。
第二步：取0.1 mL反应液加入100mM，pH7.5Tris- HCl，1U SDH(sigma)和0.15mM NADH，立即混匀，30℃下在340 nm下检测NADH被氧化的量（即在340 nm做时间扫描）。
以比酶活为纵坐标，温度为横坐标作图，求出酶最适反应温度。
2.9.5木糖异构酶最适pH值的测定
采用XI-SDH两步法（Lönn A et al.2002）：第一步：配置终浓度为100mmol/L 缓冲液：sodium acetate、tris，在室温下调pH 5-10。
500mmol/L D-木糖，10 mmol/L MgCl2，100mmol/L 不同pH 缓冲液，作为底物溶液。
将底物溶液在30℃下保温，加入粗酶液10μl，在30℃下反应10 min，加入150µL 50%三氯乙酸终止反应和185µL 2M Na2CO3中和反应缓冲液。
第二步：取0.1 mL反应液加入100mM，pH7.5Tris- HCl，1U SDH(sigma)和0.15mM NADH，立即混匀，30℃下在340 nm
下检测NADH被氧化的量（即在340 nm做时间扫描）。
以比酶活为纵坐标，pH值为横坐标作图，求出酶最适反应pH。