第十二讲义章3液相色谱分析法4
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《液相色谱分析法》课件
液相色谱分析法
,
汇报人：
目录
01 添 加 目 录 项 标 题 03 液 相 色 谱 分 析 法 的
技术原理
05 液 相 色 谱 分 析 法 的 优缺点
02 液 相 色 谱 分 析 法 的 概述
04 液 相 色 谱 分 析 法 的 应用实例
06
液相色谱分析法的 发展趋势和未来展
望
Part One
单击添加章节标题
数据处理：对检测到的信号 进行处理，得到样品的色谱 图和定量结果
结果分析：根据色谱图和定 量结果，对样品进行分析和 鉴定
Part Four
液相色谱分析法的 应用实例
在药物分析中的应用
药物稳定性研究：研究药物 在储存过程中的稳定性
药物成分分析：分析药物中 的有效成分、杂质等
药物质量控制：控制药物的 质量，确保药物的安全性和
液相色谱分析法的研究热点和前沿技术
超高效液相色谱技术：提高分离效率，降 低检测限
生物样品分析：应用于生物医药、食品安 全等领域
质谱联用技术：提高检测灵敏度和准确性
环境样品分析：应用于环境监测、污染治 理等领域
微流控芯片技术：实现样品的微型化和快 速分析
智能化、自动化技术：提高分析效率，降 低人工操作误差
添加标题
核磁共振检测器：利用核磁共振原理，检测样品中的核磁共振信号，用于结构分析和定量分析
液相色谱分析法的操作流程
样品制备：将样品进行适当 的处理，如稀释、过滤等
样品注入：将样品注入到色 谱柱中
色谱分离：样品在色谱柱 中分离，根据不同组分的 性质和亲和力进行分离
检测器检测：样品经过检 测器时，检测器对样品进 行检测，得到相应的信号பைடு நூலகம்
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汇报人：
目录
01 添 加 目 录 项 标 题 03 液 相 色 谱 分 析 法 的
技术原理
05 液 相 色 谱 分 析 法 的 优缺点
02 液 相 色 谱 分 析 法 的 概述
04 液 相 色 谱 分 析 法 的 应用实例
06
液相色谱分析法的 发展趋势和未来展
望
Part One
单击添加章节标题
数据处理：对检测到的信号 进行处理，得到样品的色谱 图和定量结果
结果分析：根据色谱图和定 量结果，对样品进行分析和 鉴定
Part Four
液相色谱分析法的 应用实例
在药物分析中的应用
药物稳定性研究：研究药物 在储存过程中的稳定性
药物成分分析：分析药物中 的有效成分、杂质等
药物质量控制：控制药物的 质量，确保药物的安全性和
液相色谱分析法的研究热点和前沿技术
超高效液相色谱技术：提高分离效率，降 低检测限
生物样品分析：应用于生物医药、食品安 全等领域
质谱联用技术：提高检测灵敏度和准确性
环境样品分析：应用于环境监测、污染治 理等领域
微流控芯片技术：实现样品的微型化和快 速分析
智能化、自动化技术：提高分析效率，降 低人工操作误差
添加标题
核磁共振检测器：利用核磁共振原理，检测样品中的核磁共振信号，用于结构分析和定量分析
液相色谱分析法的操作流程
样品制备：将样品进行适当 的处理，如稀释、过滤等
样品注入：将样品注入到色 谱柱中
色谱分离：样品在色谱柱 中分离，根据不同组分的 性质和亲和力进行分离
检测器检测：样品经过检 测器时，检测器对样品进 行检测，得到相应的信号பைடு நூலகம்
经典液相色谱知识点总结
经典液相色谱知识点总结液相色谱（Liquid Chromatography, LC）是一种以液相为驱动相，将待测样品在静态相中进行分离的色谱分析方法。
液相色谱在分离生化样品、药物、天然产物等化合物时得到了广泛的应用。
本文将系统总结液相色谱的知识点，包括原理、分类、仪器设备、色谱柱、检测方法等方面的内容。
一、原理液相色谱的原理基于化合物在静态相（色谱柱填料）和流动相（溶剂）之间的分配与分离过程。
待分析的化合物在流动相与静态相之间的分配系数不同，因此当待测样品溶液通过色谱柱时，根据不同化合物在静态相中的分配行为，可以实现化合物的分离。
在液相色谱中，流动相主要由溶剂和缓冲液组成，可以根据需要进行调整。
而静态相则是色谱柱填料，填料的选择对色谱分离效果至关重要。
填料的种类、粒径、表面性质等都会影响到分离效果。
二、分类根据静态相的不同，液相色谱可以分为几种常见的类型：1、反相色谱：静态相是疏水性填料，流动相是亲水性溶剂，被分离物质的极性与填料相反。
反相色谱对极性化合物具有较好的分离效果，因此在分析生化样品、药物等方面得到了广泛的应用。
2、离子交换色谱：静态相是带电离子交换树脂填料，可进行阴离子或阳离子的分离。
离子交换色谱适用于分析离子化合物，如蛋白质、核酸等。
3、尺寸排除色谱：静态相是孔径大小均一的凝胶填料，根据分子大小进行排除分离。
尺寸排除色谱适用于分析大分子化合物，如蛋白质、多糖等。
4、亲和色谱：通过生物亲和分离剂与化合物间的特异性结合实现分离，主要应用于生化分析领域。
5、扩展液相色谱：液相色谱的一种改良方法，通过使用超高性能色谱柱和压力增加装置来提高分辨率。
三、仪器设备液相色谱仪器主要包括流动相输送系统、样品进样装置、色谱柱和检测器等部分。
1、流动相输送系统：用于输送流动相的高性能泵，包括梯度泵和等速泵两种，可实现不同流动相梯度的传送。
2、样品进样装置：通常采用自动进样系统，可实现自动进样、样品预处理等功能。
第十二章讲义高效液相色谱
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相柱 色谱装置
高效液相色谱仪
例：分离20种氨基酸
经典柱色 谱
柱长：170 cm 柱径：0.9 cm F：30 mL/h t分离: >20 h
HPL C
t分离：1 h
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相色谱法
固定相 固定相粒度（μm） 固定相粒度分布(RSD) 柱长（cm） 柱内径（cm） 柱 入 口 压 强 （ kg/cm2 ） 柱效(每米理论塔片数) 样品用量（g） 分析所需时间（h） 装置
液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为： ①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡
过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。 而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提 高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以 上的液体作流动相，增大分离的选择性。
其是在生物学和医学等方面应
用极为广泛。如氨基酸、蛋白
质、核酸、烃、碳水化合物、 分
药品、多糖、高聚物、农药、
子 量
抗生素、胆固醇、金属有机物
等 分 析 ， 大 多 是 通 过 HPLC 来
完成的。
右图是各种HPLC方法的应
用范围及对象
极性增加 不溶于水 非极性
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
反向分配
正向分配 离子交换
主要由接管、检测器流通池体积及检测器响应时间 等因素所引起。因此，尽可能用短而内径细的接管， 减少流通池体积，改进检测器和记录系统的响应速度 等都是克服柱后展宽的途径
第二节 高效液相色谱仪
一、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐(滤棒，可滤去颗粒状物质) 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
分析化学 液相色谱法PPT课件
• 阴离子交换反应
RN(CH3 )3+ OH- + X- == RN(CH3)3+X-+ OH-
2021年5月
32
第32页/共68页
树脂的再生
• 阳离子交换树脂用HCl溶液处理 •
• R阴离子-交S换O树3-脂M用N+aO+HH溶液+处C理l- == R - SO3-H + + M+Cl-
RN(CH
2021年5月
21
第21页/共68页
（六）操作方法
• 1.装柱 • 2.加样 • 3.洗脱
2021年5月
22
第22页/共68页
二、 液－液分配柱色谱法
• （一）分离机理 • 利用混合物中不同组分在两相溶剂中溶解性不同(分配系数不同)，当流动相携 带样品流经固定相时，各组分在两相间不断进行溶解、萃取，再溶解、再萃取。 样品在色谱柱内经过无数次分配之后，而使分配系数稍有差异的组分得到分离。 • 正相色谱：流动相的极性比固定相的极性弱 • 反相色谱：流动相的极性比固定相的极性强
第十二章 液相色谱法
• 第一节 概述 • 第二节 柱色谱法 • 第三节 平面色谱法 • 思考与练习
2021年5月
1
第1页/共68页
第一节 概述
色谱法(chromatography)又称层析法，是一种依据物质的物理化学性质的不同(如溶解性、极性、离子 交换能力、分子大小等)而进行的分离分析方法。
• 一、 色谱法的产生和发展
•
原理:硅醇基(吸附中心)与极性基团形成氢键(吸附性),组分与硅醇基形成氢键(被吸附)的能力不同而
分离。
•
应用:酸性和中性物质的分离，如有机酸、酚类、醛类.
RN(CH3 )3+ OH- + X- == RN(CH3)3+X-+ OH-
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树脂的再生
• 阳离子交换树脂用HCl溶液处理 •
• R阴离子-交S换O树3-脂M用N+aO+HH溶液+处C理l- == R - SO3-H + + M+Cl-
RN(CH
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（六）操作方法
• 1.装柱 • 2.加样 • 3.洗脱
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二、 液－液分配柱色谱法
• （一）分离机理 • 利用混合物中不同组分在两相溶剂中溶解性不同(分配系数不同)，当流动相携 带样品流经固定相时，各组分在两相间不断进行溶解、萃取，再溶解、再萃取。 样品在色谱柱内经过无数次分配之后，而使分配系数稍有差异的组分得到分离。 • 正相色谱：流动相的极性比固定相的极性弱 • 反相色谱：流动相的极性比固定相的极性强
第十二章 液相色谱法
• 第一节 概述 • 第二节 柱色谱法 • 第三节 平面色谱法 • 思考与练习
2021年5月
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第一节 概述
色谱法(chromatography)又称层析法，是一种依据物质的物理化学性质的不同(如溶解性、极性、离子 交换能力、分子大小等)而进行的分离分析方法。
• 一、 色谱法的产生和发展
•
原理:硅醇基(吸附中心)与极性基团形成氢键(吸附性),组分与硅醇基形成氢键(被吸附)的能力不同而
分离。
•
应用:酸性和中性物质的分离，如有机酸、酚类、醛类.
《液相色谱法》课件
DATE
ANALYSIS
SUMMAR Y
REPORT
CATALOG
DATE
ANALYSIS
SUMMAR Y
05
液相色谱法的优化与注 意事项
实验条件的优化
1 2
流动相的选择
根据分析物的性质选择合适的流动相，如有机溶 剂、缓冲液等，以达到最佳分离效果。
流速的优化
流速对色谱分离效果有重要影响，需根据实际情 况调整流速，以达到最佳分离效果。
3
柱温的优化
柱温会影响物质的吸附和扩散速度，适当提高柱 温可以加快分析速度，但过高的温度可能导致柱 效降低。
液相色谱柱的维护与保养
使用前清洗
新柱子使用前需进行彻底清洗，以去除残留物和 污染物。
使用中维护
使用过程中应定期清洗和再生色谱柱，以保持其 性能和寿命。
储存条件
色谱柱应存放在干燥、避光的地方，避免直接阳 光照射和高温。
反相色谱法
总结词
反相色谱法是利用非极性固定相和极性流动相之间的相互作用来分离物质的分离 模式。
详细描述
反相色谱法中，固定相通常是烷基键合硅胶，流动相则是极性的溶剂，如水、甲 醇等。在分离过程中，非极性或弱极性的组分更容易被固定相吸附，因此会先被 洗脱出来。
离子交换色谱法
总结词
离子交换色谱法是利用离子交换剂与溶液中的离子之间的相互作用来分离物质的分离模 式。
动相。
流动相的流速和组成对分离效果 也有影响，需根据实际情况调整
。
固定相
固定相是色谱柱中的填料，用于吸附样品中的组分。
常见的固定相有硅胶、氧化铝、活性炭等，根据不同分离需求选择合适的固定相。
固定相的粒径和性质对分离效果有影响，粒径越小，性质越均匀，分离效果越好。
第十二章3液相色谱分析法4
2019/11/12
流动相组成
流动相按组成不同可分为单组分和多组分； 按极性可分为极性、弱极性、非极性； 按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相 的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。
2019/11/12
1. 影响分离的因素——流速
流速大于0.5 cm/s时, H～u曲线是一段斜率不大的直 线。降低流速，柱效提高不是 很大。但在实际操作中，流量 仍是一个调整分离度和出峰时 间的重要可选择参数。
2019/11/12
2. 固定相及分离柱
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相, 现多为 化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定 液结合在担体表面。
2019/11/12
3. 离子交换色谱
固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱 的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交 换能力的不同而得到分离。
4. 凝胶色谱（空间排阻色谱）
（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外 检测器时，流动相不应有紫外吸收。
2019/11/12
四、 高效液相色谱法的主要分离类型
1. 吸附色谱（液-固吸附色谱）
以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使 用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极 性的一元或多元溶剂。
2. 分配色谱（液-液分配色谱）
（1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱 中显得特别重要。 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱 剂。
（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极 性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正 相柱。
流动相组成
流动相按组成不同可分为单组分和多组分； 按极性可分为极性、弱极性、非极性； 按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相 的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。
2019/11/12
1. 影响分离的因素——流速
流速大于0.5 cm/s时, H～u曲线是一段斜率不大的直 线。降低流速，柱效提高不是 很大。但在实际操作中，流量 仍是一个调整分离度和出峰时 间的重要可选择参数。
2019/11/12
2. 固定相及分离柱
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相, 现多为 化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定 液结合在担体表面。
2019/11/12
3. 离子交换色谱
固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱 的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交 换能力的不同而得到分离。
4. 凝胶色谱（空间排阻色谱）
（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外 检测器时，流动相不应有紫外吸收。
2019/11/12
四、 高效液相色谱法的主要分离类型
1. 吸附色谱（液-固吸附色谱）
以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使 用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极 性的一元或多元溶剂。
2. 分配色谱（液-液分配色谱）
（1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱 中显得特别重要。 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱 剂。
（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极 性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正 相柱。
第三章液相色谱分析法
二、离子色谱装置类型
suppressed apparatus of IC
抑制型：抑制柱型、连续抑制型 分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.01～0.05
毫摩尔/克干树脂。 非抑制型: 当进一步降低分离柱中树脂的交换容量 (0.007～0.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度 的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。 检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱。
第三章 液相色谱分析法
high performance liquid chromatograph
第五节 离子色谱法
ion chromatograph, IC
一、离子色谱法原理 principle of IC 二、离子色谱连续抑制装置
suppressed apparatus of IC 三、离子色谱的应用 application of IC
2021/1/15
选择内容
第一节 高效液相色谱的特点与仪器
feature and instrument of HPLC
第二节 基本原理与主要分离类型
basic principle and main separating type
第三节 固定相与流动相
stationary phase and mobile phase
2021/1/15
第四节 影响分离的因素与操作条件选择
factors influenced separation and choice of operation condition
第五节 离子色谱法
ion chromatograph
第六节 超临界流体色谱
supercritical fluid chromatograph
2021/1/15
第三章液相色谱法
7/22/2020
反相色谱法
一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入 甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节 保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相 色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。 随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用 于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离， 常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的 pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH 值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。
7/22/2020
例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液， 于流动相中加入与待测离子X+有相反电荷的离子Y-
X+水相 + Y-水相
X+Y-有机相
由于离子对XY具有疏水性，因而被非极性固定 相提取。其它待测离子A1，A2...因与B离子间的 成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使 得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离 的目的。
7/22/2020
• ①流动相传质阻抗Hm＝Cmdp2u/Dm，Cm为常数。这是由于在一个流 路中流路中心和边缘的流速不等所致。靠近填充颗粒的流动相流速较 慢，而中心较快，处于中心的分子还未来得及与固定相达到分配平衡 就随流动相前移，因而产生峰展宽。
• ②静态流动相传质阻抗Hsm＝Csmdp2u/Dm，Csm为常数。这是由于溶 质分子进入处于固定相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起 峰展宽。Hsm对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用。固定 相的颗粒越小，微孔孔径越大，传质阻力就越小，传质速率越高。所 以改进固定相结构，减小静态流动相传质阻力，是提高液相色谱柱效 的关键。
反相色谱法
一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入 甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节 保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相 色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。 随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用 于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离， 常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的 pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH 值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。
7/22/2020
例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液， 于流动相中加入与待测离子X+有相反电荷的离子Y-
X+水相 + Y-水相
X+Y-有机相
由于离子对XY具有疏水性，因而被非极性固定 相提取。其它待测离子A1，A2...因与B离子间的 成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使 得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离 的目的。
7/22/2020
• ①流动相传质阻抗Hm＝Cmdp2u/Dm，Cm为常数。这是由于在一个流 路中流路中心和边缘的流速不等所致。靠近填充颗粒的流动相流速较 慢，而中心较快，处于中心的分子还未来得及与固定相达到分配平衡 就随流动相前移，因而产生峰展宽。
• ②静态流动相传质阻抗Hsm＝Csmdp2u/Dm，Csm为常数。这是由于溶 质分子进入处于固定相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起 峰展宽。Hsm对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用。固定 相的颗粒越小，微孔孔径越大，传质阻力就越小，传质速率越高。所 以改进固定相结构，减小静态流动相传质阻力，是提高液相色谱柱效 的关键。
液相色谱讲义四：梯度方法的开发及梯度分离时的注意事项
梯度方法开发实例 - 第六步
根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5 曲线使3-9号峰提前，改用50-95%B见到好的现象。
梯度方法开发实例 - 第七步
最后用50-90%B，曲线4，得到好的结果。
液相色谱的方法开发
（二）梯度方法
梯度洗脱的特点
优点
单位时间的分离能力增加 检测灵敏度提高
缺点
仪器设备要求高 不适合某些检测方式 柱梯度及低压梯度
A
泵
溶 剂 比 例 A 混 合
混 合 器 （ 溶 溶 剂 剂 混 泵 泵 B 溶 剂 B
梯度平衡时间的影响（二）
平衡时间∶6分钟 平衡时间∶7分钟 平衡时间∶8分钟 平衡时间∶9分钟
平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的 变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9 分钟变化 不大因而大于这个时间时，平衡充足。
有机污染物的影响（一）
50ml超纯水的有机物污染状态
有机污染物的影响（二）
梯度方法开发实例 - 第四步
空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰）中的第一个小峰 对第8个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。
梯度方法开发实例 - 第五步
根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5 曲线使3-9号峰提前(曲线5，50-100%B)，但是小峰仍没有分出来。
梯度方法开发实例 - 第二步
为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例（ 50100% ，水 - 乙腈），分离得到改善。但是 9 个化合物出了 10 个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的。
梯度方法开发实例 - 第三步
从空白梯度图显示，在同样 的色谱条件，同样的检测灵敏度 下，共有两个杂质峰。说明流动 相水中的杂质在此条件下可能会 对检测有影响。
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2021/3/12
(2) 梯度淋洗装置
外梯度: 利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按一 定的比例送入梯度混合室， 混合后进入色谱柱。
内梯度: 一台高压泵, 通过比例
调节阀,将两种或多种不同 极性的溶剂按一定的比例抽 入高压泵中混合。
2021/3/12
(3) 进样装置
流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：
2021/3/12
选择流动相时应注意的几个问题：
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定 相等。
（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相, 现多为 化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定 液结合在担体表面。
2021/3/12
感谢聆听！
1.流程
2021/3/12
2.主要部件
(1) 高压输液泵
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效， 但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常 高的工作，一般很少自行制备。
选择短柱、细内径提高分析速度； 研制高效柱填料是一活跃领域。
2021/3/12
3. 流动相及流动相的极性
（1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱 中显得特别重要。 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱 剂。
（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极 性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正 相柱。
（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液 液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上 的出峰顺序相反。
2021/3/12
流动相组成
流动相按组成不同可分为单组分和多组分； 按极性可分为极性、弱极性、非极性； 按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相 的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
2021/3/12
(4) 高效分离柱
柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
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(5) 高效液相色谱检测器
紫外光度检测器（UV）：最小检测量10-9g·mL-1，对流 量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。
最常用的检测器。
2021/3/12
光电二极管阵列检测器
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
2021/3/12
三、影响分离的因素
在高效液相色谱中, 速率方程中的分子扩散项B/U较小， 可以忽略不计，而只有两项，即：
H=A+Cu 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示：
影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。
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1. 影响分离的因素——流速
流速大于0.5 cm/s时, H～u曲线是一段斜率不大的直 线。降低流速，柱效提高不是 很大。但在实际操作中，流量 仍是一个调整分离度和出峰时 间的重要可选择参数。
2021/3/12
2. 固定相及分离柱
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其 选用原则与气相色谱一样。
精品
第十二章3液相色谱分析法4
液相色谱仪（1）
2021/3/12
液相色谱仪（2）
2021/3/12
液相色谱仪（3）
2021/3/12
液相色谱仪（4）
2021/3/12
一、高效液相色谱法的特点
特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
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二、流程及主要部件
（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外 检测器时，流动相应有紫外吸收。
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四、 高效液相色谱法的主要分离类型
1. 吸附色谱（液-固吸附色谱）
以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使 用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极 性的一元或多元溶剂。
2. 分配色谱（液-液分配色谱）
(2) 梯度淋洗装置
外梯度: 利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按一 定的比例送入梯度混合室， 混合后进入色谱柱。
内梯度: 一台高压泵, 通过比例
调节阀,将两种或多种不同 极性的溶剂按一定的比例抽 入高压泵中混合。
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(3) 进样装置
流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：
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选择流动相时应注意的几个问题：
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定 相等。
（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相, 现多为 化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定 液结合在担体表面。
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感谢聆听！
1.流程
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2.主要部件
(1) 高压输液泵
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效， 但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常 高的工作，一般很少自行制备。
选择短柱、细内径提高分析速度； 研制高效柱填料是一活跃领域。
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3. 流动相及流动相的极性
（1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱 中显得特别重要。 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱 剂。
（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极 性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正 相柱。
（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液 液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上 的出峰顺序相反。
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流动相组成
流动相按组成不同可分为单组分和多组分； 按极性可分为极性、弱极性、非极性； 按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相 的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
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(4) 高效分离柱
柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
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(5) 高效液相色谱检测器
紫外光度检测器（UV）：最小检测量10-9g·mL-1，对流 量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。
最常用的检测器。
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光电二极管阵列检测器
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
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三、影响分离的因素
在高效液相色谱中, 速率方程中的分子扩散项B/U较小， 可以忽略不计，而只有两项，即：
H=A+Cu 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示：
影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。
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1. 影响分离的因素——流速
流速大于0.5 cm/s时, H～u曲线是一段斜率不大的直 线。降低流速，柱效提高不是 很大。但在实际操作中，流量 仍是一个调整分离度和出峰时 间的重要可选择参数。
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2. 固定相及分离柱
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其 选用原则与气相色谱一样。
精品
第十二章3液相色谱分析法4
液相色谱仪（1）
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液相色谱仪（2）
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液相色谱仪（3）
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液相色谱仪（4）
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一、高效液相色谱法的特点
特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
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二、流程及主要部件
（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外 检测器时，流动相应有紫外吸收。
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四、 高效液相色谱法的主要分离类型
1. 吸附色谱（液-固吸附色谱）
以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使 用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极 性的一元或多元溶剂。
2. 分配色谱（液-液分配色谱）