KISS_1基因在肾癌中的表达及对细胞侵袭力的影响

KISS-1基因在肾癌中的表达及对细胞侵袭力的影响张辉１，赵丹懿２，宋永胜１△（１．中国医科大学附属盛京医院泌尿外科；２．附属第一医院肿瘤外科）［摘要］目的：检测肾癌原发灶和转移灶中ＫＩＳＳ－１基因的表达并在体外实验中验证其缺失对细胞侵袭能力的影响。

方法：选择３０例肾癌患者，应用荧光定量ＰＣＲ检测肾癌原发灶和转移灶中ＫＩＳＳ－１基因ｍＲＮＡ的表达，应用ＲＮＡ干扰技术获得ＫＩＳＳ－１基因表达缺失的肾癌细胞株，检测干扰前后细胞的侵袭能力变化。

结果：转移灶中的ＫＩＳＳ－１ｍＲＮＡ表达较原发灶中明显下调，ＫＩＳＳ－１表达与肿瘤远处转移呈显著相关。

干涉前后都有细胞穿透滤膜，干涉后细胞数明显高于干涉前，细胞数分别为３１±６和７８±８，两组有显著差异（Ｐ＜０．０５）。

ＫＩＳＳ－１基因表达缺失的肾癌细胞侵袭能力明显增强。

结论：ＫＩＳＳ－１基因在肾癌中具有转移抑制作用，可能在肾癌转移治疗中发挥作用。

［关键词］肾癌；转移；肿瘤转移抑制基因；ＫＩＳＳ－１基因；荧光定量ＰＣＲ［中图分类号］Ｒ７３［文献标识码］Ａ［文章编号］０２５８－４６４６（２００７）０２－０１７１－０２ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＫＩＳＳ－１ｇｅｎｅａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓｉｎｒｅｎａｌｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ肾癌又称肾细胞癌、肾腺癌等，约占肾脏肿瘤的８５％。

既往肾癌就诊时２０％￣３５％已有转移，６％￣１５％是因为转移症状而就诊［１］。

ＫＩＳＳ－１基因是一个新近发现的与肿瘤转移有关的肿瘤转移抑制基因，能明显抑制肿瘤细胞的化学趋向性和侵袭性。

我们在本研究中应用了荧光定量ＰＣＲ和体外细胞侵袭力实验以检测ＫＩＳＳ－１基因与肾癌转移的相关性并进一步讨论其在肾癌转移中可能发挥的作用。

１材料与方法１．１材料１．１．１标本：肾癌标本来源于中国医科大学附属盛京医院泌尿外科患者，手术切取原发肿瘤组织及转移肿瘤组织均经病理诊断证实，所有患者术前均未接受放疗和化疗。

组织标本于－７０℃冰箱中保存。

１．１．２细胞：人肾癌细胞系（７６９－Ｐ）购自中国科学院上海细胞所。

１．１．３主要试剂：总ＲＮＡ抽提试剂ＴＲＩＺＯＬ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，反转录试剂盒购自ＴａＫａＲａ公司，荧光定量ＰＣＲ相关试剂购自ＡＢＩ公司，ｓｉＲＮＡ体外合成试剂盒购自Ａｍｂｉｏｎ公司，ｓｉＲＮＡ转染试剂购自Ｑｉａｇｅｎ公司，Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室购自Ｃｏｓｔｅｒ公司。

１．２方法１．２．１荧光定量ＰＣＲ：提取总ＲＮＡ，反转录成ｃＤ－ＮＡ。

应用ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ２．０设计引物，上游引物：５′－ＴＴＣＣＴＣＴＧＴＧＣＣＡＣＣＣＡＣＴＴ－３′，下游引物：５′－ＧＣＡＧＴＡＧＣＡＧＣＴＧＧＣＴＴＣＣＴ－３′，Ｔａｑｍａｎ－ＭＧＢ探针：ＡＣＣＣＡＣＡＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＧＡＡＴＣＣ。

应用的仪器是ＡＢＩ公司的７７００荧光定量仪，使用的软件是ＳＤＳ１．７（７７００）。

１．２．２ＲＮＡ干扰：引物设计采用Ａｍｂｉｏｎ公司提供的［基金项目］辽宁省教育厅基金资助项目（２０１２２１５９）［作者简介］张辉（１９７８－），男，住院医师，硕士．△ＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇＡｕｔｈｏｒ′ｓＥ－ｍａｉｌ：ｓｏｎｇｙｓ＠ｃｍｕ２ｈ．ｃｏｍＺＨＡＮＧＨｕｉ１，ＺＨＡＯＤａｎ－ｙｉ２，ＳＯＮＧＹｏｎｇ－ｓｈｅｎｇ１△（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＵｒｏｌｏｇｉｃａｌＳｕｒｇｅｒｙ，ＳｈｅｎｇｊｉｎｇＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣｈｉｎａＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００４，Ｃｈｉｎａ；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｎｃｏｌｏｇｉｃａｌＳｕｒｇｅｒｙ，ＴｈｅＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ）［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＫＩＳＳ－１ｇｅｎｅ，ｏｎｅｏｆｍｅｔａｓｔａｓｉｓｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｇｅｎｅｓｗｈｉｃｈｐｌａｙａｃｒｉｔｉｃａｌｒｏｌｅｉｎｔｕｍｏｒｉｎｖａｓｉｏｎａｎｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，ｉｎｐｒｉｍａｒｙａｎｄｍｅｔａｓｔａｔｉｃｒｅｎａｌｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ，ａｎｄｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＫＩＳＳ－１ｇｅｎｅｄｅｐｌｅｔｉｏｎｏｎｔｈｅｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｃｅｌｌｉｎｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＫＩＳＳ－１ｍＲＮＡｉｎ３０ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｐｒｉｍａｒｙａｎｄｍｅｔａｓｔａｔｉｃｒｅｎａｌｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ．ＴｈｅｒｅｎａｌｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｗｉｔｈＫＩＳＳ－１ｇｅｎｅｄｅｐｌｅｔｉｏｎｗａｓｐｒｅｐａｒｅｄｂｙＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ａｎｄｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅｉｎｖａｓｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＫＩＳＳ－１ｍＲＮＡｗａｓｍｕｃｈｌｏｗｅｒｉｎｔｈｅｍｅｔａｓｔａｔｉｃｔｕｍｏｒｔｈａｎｉｎｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｔｕｍｏｒａｎｄｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｕｍｏｒｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．ＴｈｅｃｅｌｌｓｐｅｎｅｔｒａｔｅｄｔｈｅｆｉｌｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｂｏｔｈｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ｔｈｅｃｅｌｌｎｕｍｂｅｒａｆｔｅｒＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｂｅｆｏｒｅＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（７８±８ｖｓ．３１±６，Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＫＩＳＳ－１ｇｅｎｅｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｉｎｖａｓｉｏｎａｂｌｉｌｉｔｙｏｆｒｅｎａｌｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａａｎｄｉｓｅｘｐｅｃｔｅｄｔｏｂｅｕｓｅｆｕｌｉｎａｎｔｉｍｅｔａｓｔａｔｉｃｔｈｅｒａｐｙｏｆｒｅｎａｌｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ｒｅｎａｌｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ；ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ；ｔｕｍｏｒｍｅｔａｓｔａｓｉｓｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｇｅｎｅ；ＫＩＳＳ－１ｇｅｎｅ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ中国医科大学学报第３６卷第２期２００７年４月ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＣＨＩＮＡＭＥＤＩＣＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＶｏｌ．３６Ｎｏ．２Ａｐｒ．２００７１７１・・网上在线设计工具（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲ－ＮＡ＿ｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍｌ）。

序列为反义：５′－ＡＡＣＴＡＣＡＡＣＴＧ－ＧＡＡＣＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣ－３′，正义：５′－ＡＡＧＡＡＧ－ＧＡＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＴＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣ－３′，以相同核苷酸组成但随机重新排列的无义ｓｉＲＮＡ作为阴性对照。

应用ｓｉＲＮＡ体外合成试剂盒Ｋｉｔ体外合成双链ＲＮＡ。

１．２．３体外细胞侵袭实验：在Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室下室加入０．５ｍｌＮＩＨ３Ｔ３细胞上清液，上室加入待检测的细胞悬液２５μｌ，调整细胞浓度为２×１０５／ｍｌ，每组设２个复孔，以未经过处理的细胞为阴性对照。

培养１２ｈ后取出滤膜，甲醇固定１０ｍｉｎ，苏木素１ｍｉｎ，伊红（ＨＥ）２ｍｉｎ染色。

随机于显微镜下取上、下、左、右、中心５个视野，计数穿膜细胞数，取每个视野的平均数表示肿瘤细胞的侵袭能力。

１．３统计学方法结果以ｘ±ｓ的形式表示，采用ｔ检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。

２结果２．１荧光定量ＰＣＲ结果选取３０例肾癌组织标本进行荧光定量ＰＣＲ检测其ＫＩＳＳ－１基因表达，结果显示，原发灶和转移灶中的ＫＩＳＳ－１ｍＲＮＡ表达分别为９２．１０００±１０．４７１６５和１７．３９３９±９．９７４７８，转移灶中的表达较原发灶中明显下降，结果具有统计学差异（Ｐ＜０．０５）。

２．２ＲＮＡ干扰ｓｉＲＮＡ转染人肾癌细胞系７６９－Ｐ，干涉后５ｄ提取转染后细胞的ＲＮＡ，荧光定量ＰＣＲ检测未发现ＫＩＳＳ－１基因表达，而阴性对照的无义ｓｉＲＮＡ并未显示出抑制ＫＩＳＳ－１基因表达的能力。

２．３体外细胞侵袭实验干涉后１０ｄ，细胞侵袭力明显增加。

干涉前后都有细胞穿透滤膜，但干涉后细胞数明显高于干涉前，细胞数分别为３１±６和７８±８（Ｐ＜０．０５），两组有显著差异，见图１。

３讨论ＬＥＥ等［２］１９９６年首先采用染色体功能定位克隆策略发现了１种新的黑色素瘤相关转移抑制基因ＫＩＳＳ－１。

ＫＩＳＳ－１基因定位于染色体１ｑ３２－ｑ４１，由４个外显子构成。

ＫＩＳＳ－１多肽能明显抑制肿瘤细胞的化学趋向性和侵袭性，并限制肿瘤细胞的迁移蠕动功能，表达于正常心脏、肝、肺、骨骼肌、肾组织和胰腺，而且在胎盘和脑观察到了高的表达。

将全长ＫＩＳＳ－１ｃＤＮＡ转染可以抑制黑色素瘤的转移，并且呈剂量依赖关系。

该基因在其他肿瘤中也存在转移抑制作用，如乳腺癌和胃癌。

本研究应用荧光定量ＰＣＲ检测３０例肾癌发现，转移肿瘤组织中的ＫＩＳＳ－１ｍＲＮＡ表达较原发肿瘤组织明显下调，结果具有统计学意义。

说明ＫＩＳＳ－１基因与人肾癌的转移有相关性，ＫＩＳＳ－１可能在抑制肾癌转移中发挥一定的作用。

为了进一步了解其在肾癌转移中发挥的作用，我们设计了针对ＫＩＳＳ－１基因的ｓｉＲＮＡ，干扰了ＫＩＳＳ－１基因在肾癌细胞中的表达，并检测了转染前后细胞的侵袭能力，发现ＫＩＳＳ－１基因表达缺失的肾癌细胞侵袭能力明显增强。

这与其他学者在乳腺癌、前列腺癌和甲状腺癌中的研究相符，说明ＫＩＳＳ－１基因在不同肿瘤中有相似的转移抑制机制。

但是其具体作用机制尚不清楚。

近年来的研究表明，ＫＩＳＳ－１基因编码的蛋白ｋｉｓｓｐｅｐｔｉｎ与其受体蛋白ＧＰＲ５４结合后可以改变肿瘤细胞的形态、抑制肿瘤细胞的转移［３］。

ＫＩＳＳ－１基因可以抑制ＭＭＰ－９的表达，从而使得肿瘤细胞难以降解基底膜［４］，而其促进Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ的表达则使肿瘤细胞与基底膜的连接更加牢固。

ＫＩＳＳ－１特异性的抑制ＭＭＰ家族的活性，是一个有前途的抗肿瘤生长和侵袭的药物。

参考文献：［１］葛宏发，李慎勤．泌尿外科疾病诊断和鉴别诊断［Ｍ］．２版，北京：人民卫生出版社，２００１：１９９．［２］ＬＥＥＪＨ，ＭＩＥＬＥＭＥ，ＨＩＣＫＳＤＪ，ｅｔａｌ．ＫＩＳＳ－１，ａｎｏｖｅｌｈｕｍａｎｍａｌｉｇ－ｎａｎｔｍｅｌａｎｏｍａｍｅｔａｓｔａｓｉｓｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｇｅｎｅ［Ｊ］．ＪＮａｔｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ，１９９６，８８（２３）：１７３１－１７３７．［３］ＳＴＡＦＦＯＲＤＬＪ，ＸＩＡＣ，ＭＡＷ，ｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ－ｔｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅｍｅｔａｓｔａｓｉｓ－ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒＫＩＳＳ－１ａｎｄｉｔｓＧ－ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，２００２，６２（１９）：５３９９－５４０４．［４］ＹＡＮＣ，ＷＡＮＧＨ，ＢＯＹＤＤＤ．ＫＩＳＳ－１ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ９２－ｋＤａｔｙｐｅｃｏｌｌａ－ｇｅｎａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＮＦ－ＢｂｉｎｄｉｎｇｔｏｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒａｓａｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＩＢ－ｉｎｄｕｃｅｄｂｌｏｃｋｏｆｐ６５／ｐ５０ｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００１，２７６（２）：１１６４－１１７２．［收稿日期］２００６－０９－１１ａ：ＲＮＡ干扰前；ｂ：ＲＮＡ干扰后图１ＲＮＡ干扰ＫＩＳＳ－１基因前后人肾癌细胞系７６９－Ｐ侵袭能力的变化×４００Ｆｉｇ．１Ｃｈａｎｇｅｓｉｎｉｎｖａｓｉｏｎａｂｌｉｌｉｔｙｏｆｒｅｎａｌｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅ７６９－ＰｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＫＩＳＳ－１ｇｅｎｅ×４００%&中国医科大学学报第３６卷１７２・・。