毛果杨PP2C基因家族生物信息学分析
谷子PP2C基因家族的特性
谷子PP2C基因家族的特性闵东红;薛飞洋;马亚男;陈明;徐兆师;李连城;刁现民;贾冠清;马有志【摘要】PP2Cs (2C type protein phosphatases)是一种单体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,在真核生物中,PP2Cs在脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)等激素信号传导途径中起着重要的调控作用.本研究通过序列比对,从谷子基因组中筛选出80个PP2C候选基因,聚类分析将其分为12个亚族(A、B、C、D、E1、E2、F1、F2、G、H、I、J).与拟南芥PP2C基因家族比对表明,A～I为2个物种共有的亚族,J亚族只存在于谷子基因组中,L亚族只存在于拟南芥中.将谷子A亚族的10个成员命名为SiPP2CA1-10.基因表达谱分析表明,A亚族基因不同程度受ABA、干旱、高盐、低温和低氮诱导表达,其中,SiPP2CA6、SiPP2CA8在5种处理下诱导表达量都高.对10个A亚族成员的启动子分析发现,在这些基因的启动子序列中含有多种参与逆境胁迫应答的顺式作用元件,其中,SiPP2CA5、SiPP2 CA6、SiPP2 CA7、SiPP2CA8的启动子中含有参与低氮胁迫响应的元件.进一步研究发现,SiPP2CA8主要在根部表达,且在低氮胁迫下一直有较高的表达水平.亚细胞定位结果显示SiPP2CA8定位在细胞膜、细胞质、细胞核中;双分子荧光互补试验(BiFC)结果表明,SiPP2CA8与一个ABA受体类似蛋白SiRCAR3(基因号为Si018317m.g)在细胞膜、细胞质及细胞核上互作,表明SiPP2CA8在谷子中可能参与ABA信号传导过程.【期刊名称】《作物学报》【年(卷),期】2013(039)012【总页数】10页(P2135-2144)【关键词】谷子;PP2C基因家族;非生物胁迫;表达分析【作者】闵东红;薛飞洋;马亚男;陈明;徐兆师;李连城;刁现民;贾冠清;马有志【作者单位】西北农林科技大学农学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学农学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/农业部麦类生物学与作物遗传育种重点实验室,北京100081;西北农林科技大学农学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/农业部麦类生物学与作物遗传育种重点实验室,北京100081;中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/农业部麦类生物学与作物遗传育种重点实验室,北京100081;中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/农业部麦类生物学与作物遗传育种重点实验室,北京100081;中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/农业部麦类生物学与作物遗传育种重点实验室,北京100081;中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/农业部麦类生物学与作物遗传育种重点实验室,北京100081;中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/农业部麦类生物学与作物遗传育种重点实验室,北京100081;中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/农业部麦类生物学与作物遗传育种重点实验室,北京100081【正文语种】中文蛋白磷酸酶和蛋白激酶介导的蛋白质可逆磷酸化在植物逆境信号传递过程中发挥重要作用[1]。
毛果杨PtIPT5基因的克隆及低温胁迫表达分析
櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄 残留情况分析［Ｊ］．现代农业科技，２０１２（３）：２１２－２１３．［５０］闫革彬，金文军．北京市昌平区蔬菜中农药残留状况分析［Ｊ］．中国食品卫生杂志，２００８，２０（３）：２５５－２５７．［５１］武丕武，侯润兰，王丽英．２００８年山西蔬菜中农药残留问题分析［Ｊ］．中国植保导刊，２００９，２９（６）：３８－４０．［５２］李树才，姚明辉．农药管理使用与农产品质量安全［Ｃ］／／２０１４年中国植物保护学会学术年会．厦门，２０１４：２４６－２５０．［５３］罗 鹏．蔬菜生产中农药使用现状、存在问题及对策研究［Ｊ］．乡村科技，２０１６（２４）：７４．［５４］江苏省市场监督管理局．江苏省市场监督管理局官网数据［ＥＢ／ＯＬ］．（２０２２－０６－０１）［２０２２－０６－０２］．ｈｔｔｐ：／／ｓｃｊｇｊ．ｊｉａｎｇｓｕ．ｇｏｖ．ｃｎ／．［５５］王琅 ．对农药包装废弃物回收处理的思考［Ｊ］．果农之友，２０２１（１２）：６３－６５．［５６］李宏秋．蔬菜农药残留现状及治理对策［Ｊ］．现代食品，２０２１（１４）：１２４－１２６．［５７］曹爱兵，姚 瑶，陈长军．江苏省绿色优质农产品基地在农药准入下的病害防控［Ｊ］．江苏农业科学，２０２２，５０（３）：１２５－１３０．［５８］曹爱兵，姚 瑶．江苏省农业绿色发展进阶思考与政策取向探讨［Ｊ］．农产品质量与安全，２０２１（２）：１４－１７．［５９］陆仲斐．２０１７年—２０２１年上海市叶菜类蔬菜中农药残留检测与分析［Ｊ］．上海农业科技，２０２２（３）：２７－３０．［６０］陈 海．蔬菜农药残留超标的原因及防治对策［Ｊ］．现代农村科技，２０２２（１）：１１１－１１２．［６１］张 妍．我国蔬菜农药残留形成原因及控制对策［Ｊ］．农业科技与信息，２０１９，１６（１９）：８０－８１．［６２］王志伟，李 洋．蔬菜中农药的使用对食品安全问题的影响［Ｊ］．现代食品，２０１７（１５）：１－４．［６３］曾永才．水稻病虫害防治与农药使用安全探讨［Ｊ］．世界热带农业信息，２０２３（３）：４４－４５．［６４］陈慧贞．蔬菜农药残留超标原因与控制策略［Ｊ］．食品安全导刊，２０２１（３０）：１４５－１４５，１４７．［６５］施 阳，王春昕，朱丽花，等．镇江新区蔬菜农产品质量安全监管现状及对策建议［Ｊ］．长江蔬菜，２０２０（１７）：３－５．［６６］陈长福．浅谈农药安全使用存在的问题及其对策［Ｊ］．南方农业，２０１７，１１（１９）：８５－８６，８９．毕田田，张 骐，代金玲，等．毛果杨ＰｔＩＰＴ５基因的克隆及低温胁迫表达分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０２３，５１（２２）：１４－２３．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２３．２２．００３毛果杨ＰｔＩＰＴ５基因的克隆及低温胁迫表达分析毕田田１，张 骐１，代金玲１，高秀芳２，白玉娥１（１．内蒙古农业大学林学院，内蒙古呼和浩特０１００００；２．鄂尔多斯市林业和草原事业发展中心，内蒙古鄂尔多斯０１７０００） 摘要：为探究异戊稀基转移酶基因（ＩＰＴ）的抗逆机理，通过ＰＣＲ技术从毛果杨叶片中克隆了ＩＰＴ基因，命名为ＰｔＩＰＴ５，对该基因及其蛋白进行生物信息学分析，并使用实时荧光定量技术（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析其在毛果杨组培苗不同组织及不同程度低温处理下的表达特性。
毛果杨全基因组磷酸根转运蛋白家族成员序列分析
关 键 词 ： 生 物 化 学 ；磷 素 ；杨 树 ；基 因组 ；序 列 分 析 ； 生 物 信 息 中 图 分 类 号 ：￥ １． ；Ｑ １ ７ ８３ ５ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：２ ９ —７ ６ ２ １ ）４０ １ ．ｌ ０ ５０ ５ （０ ２ ０ —５ ６ １
Ｇｅ ｏ — ｄ ｎ ｌ ｓｓｏ ｈ ｈ ｓ ｈ ｔ ｒ ｎ ｐ ｒｅ ｎ ｍｅｗｉ ｅ ａ ａｙ ｉ ｆｔ ｅ ｐ ｏ ｐ ａ ｅ ｔａ ｓ ｏ ｔｒ ｇ ｎ ａ ｌ ｎ Ｐｏ ｌ ｓ ｔｉ ｈ ｃ ｒ ｅ ｅ ｆ ｍｉ ｉ ｐｕ ｕ ｒｃ ｏ ａｐａ ｙ
ＷＡ Ｇ Ｃ Ｉ ｉｇｊ ｇ，Ｇ Ｎ Ｈ ｎ—ａ Ｉ ｏ ｇ，Ｌ Ｏ Ｚ ｉ ｉ ， Ｎ ｅ，Ｑ Ｎ Ｊ －ｎ Ａ ｏ ｇｈ ｏ，Ｌ ｎ Ｕ ｈ— ｎ 。 ｎ ｉ Ｈ ｂ
ｃｅ ｃｌ ｓ ｃ ｒｌ ｒｐ ｒｅ ｓｗ ｌ ａ ｕ —ｅｌｌ ｏａ ｏ ｓｏ ｕ ｈ ｓｈ ｔ ｔ ｎｐ ｒ ｒ （ｔ Ｈ １１ ｈ ｍｉ ， ｔ ｔ ａ ｐｏ ｅｔ ｓａ ｅｌ ｓｓｂｃｌ ａ ｌ ｔ ｎ ｆｆ ｒｐ ｏｐ ａｅ ｒ ｓｏ ｅｓ Ｐｒ Ｔ — ， ａ ｕ ｒ ｕ ｉ ｕｒ ｃｉ ｏ ａ ｔ Ｐ
从 毛 果杨 全基 因组数 据库 中搜 索并 筛选得 到 的 目标 蛋 白序 列为 基础 ．利 用 相 关 生物信 息学软 件 对其 进行 系统 发 育 分析 ，并 利 用一 系列在 线服 务 器对部 分 成 员的理 化参 数 、亲／ 水性 、跨 膜 域 、二 级 结构 、三 级 结 构和 亚 细胞 定位 疏 进行 了重 点 分析 。结 果表 明 ，在 毛 果杨 全基 因组 中共发 现 了 ３ １个磷 酸根 转 运蛋 白家族 成 员，根 据其 序 列相 似 性 ，
杨柳比较基因组信息学研究
杨柳比较基因组信息学研究本课题以已测序的两种杨柳科植物红皮柳和毛果杨的全基因组数据作为研究对象。
杨柳科植物除了经历了真双子叶共有的全基因组三倍乘(Whole-genome triplication,WGT or Core-eudicot-common hexaploidzation,ECH)事件之外,又经历了一次杨柳科植物共有的二倍乘(Saliceae whole-genomeduplication,SWD)事件。
为深入理解多倍化杨柳染色体和基因组的结构与功能演化,选取基因组结构较为古老的葡萄作为参照进行分析。
通过物种内与物种间的BLAST比对,找出具有共线性的同源基因对,构建具有可视化分析功能的同源结构点阵图;对毛果杨、红皮柳同源结构点阵图分析,课题推断出杨柳科植物加倍之前共有8条祖先染色体;通过同源片段的搜索分析以及对多物种间进行基因组联合比对,构建以葡萄基因组为参考的多基因组联合比对图谱;结合同源片段数量的统计,从基因组丢失与保留的角度,分析杨柳科植物的基因组进化过程;并分类统计出了不同事件关联的共线性基因集。
通过研究发现红皮柳经历SWD后的两套子基因组的平均共线基因丢失率为73%和77%,而毛果杨仅为69%和71%,红皮柳的共线基因丢失率显著高于毛果杨;且红皮柳SWD后的共线基因保留的数量为9017个,毛果杨则保留了15173个共线基因,红皮柳的共线基因保留数量显著低于杨树;红皮柳最近一次加倍的同源片段的Ks峰值为0.33,毛果杨的Ks峰值仅为0.23,红皮柳的Ks峰值相对于毛果杨更高;这些数据都表明红皮柳经历更剧烈的基因变化,即红皮柳的进化速率很可能快于毛果杨。
课题还推断出了SWD事件发生的时间大约在25~30个百万年前,而在SWD后,毛果杨与红皮柳分化的时间大约在15~20个百万年前。
之后通过基因表达量、基因家族、基因功能GO富集分析等方面,全面比对分析了毛果杨二倍乘之后产生的两套子基因组,发现这两套基因组在基因表达量、基因家族、基因功能几个层面均无显著差异,本研究为杨柳祖先为同源多倍体提供了更多证据。
杨树NRAMP_基因家族全基因组鉴定与生物信息学分析
文章编号 ０５１７－６６１１（２０２３）１４－００９０－０５
ｄｏｉ：１０．３９６９ ／ ｊ．ｉｓｓｎ．０５１７－６６１１．２０２３．１４．０２２
开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：
Ｇｅｎｏｍｅ⁃ｗｉｄｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｏｐｌａｒ ＮＲＡＭＰ Ｇｅｎｅ Ｆａｍｉｌｙ
镉和铁等有吸收和转运功能［４，１０－１２］ 。
植物在生长过程中，如遇重金属污染，过量的重金属会
ｓｉｓｔａｎｃｅ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＮＲＡＭＰ）是一类参与金
对植物细胞膜系统造成伤害，影响植物的生长发育。 如镉胁
。 ＮＲＡＭＰ 蛋白属于一种具有典型膜
细胞的有丝分裂速度，使植物生长缓慢；锰虽然是植物必需
摘要 为研究杨树自然抗性相关巨噬细胞蛋白（ＮＲＡＭＰ）家族成员的结构和功能，利用生物信息学方法，从杨树全基因组数据库中筛选
并鉴定 ＮＲＡＭＰ 家族基因序列，并对该家族成员的理化性质、二级结构、基因结构、保守基序、染色体定位、进化树和组织表达量进行分
析。 结果表明：从杨树基因组中共鉴定出 ６ 个 ＮＲＡＭＰ 基因家族成员，编码的氨基酸数量差异较大，为 ５０３ ～ １ ３１０，亚细胞定位表明其均
ＯｓＮＲＡＭＰ３、ＯｓＮＲＡＭＰ５、ＯｓＮＲＡＭＰ６ 和 ＯｓＮＲＡＭＰ７ 对锌、锰、
严重，威胁生态系统，影响人类健康
［１］
。 杨树适应性较强，广
根系发达，对毒性物质具有较强的耐性，对重金属具有较强
的富集及转运能力
［２］
。 天然抗性相关巨噬蛋白（ ｎａｔｕｒａｌ ｒｅ⁃
毛白杨(BJHR01)磷酸肌醇特异性磷脂酶C(PLC2)基因生物信息学分析
毛白杨（BJHR01）磷酸肌醇特异性磷脂酶C（PLC2）基因生物信息学分析作者：李墨野赵慧姜洋刘笑平林永红李开隆来源：《安徽农业科学》2014年第31期摘要 [目的]用生物信息学手段分析、预测毛白杨PLC2基因/蛋白质的结构与特征，为该基因的克隆及功能研究提供理论参考。
[方法]以PLC2基因及对应蛋白质为研究对象，利用各种网上数据库及生物信息学分析软件对其进行相关分析、预测。
[结果]PLC2基因的GenBank登录号为JX424764.1，ORF长957bp，编码318个氨基酸，对应蛋白质PLC2的分子量35 999.1D，理论等电点7.07；PLC2与毛果杨（XP_002313726.1）的同源性较高；PLC2属于PIPLCc_GDPD_SF超家族，无O糖基化位点，无二硫键，无跨膜区和信号肽，有16个磷酸化位点。
[结论]对PLC2基因/蛋白的各级结构及功能进行预测，为下一步试验奠定基础。
关键词毛白杨；磷酸肌醇特异性磷脂酶C；生物信息学中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）31-10867-06Bioinformatics Analysis of Populus tomentosa cultivar BJHR01 Phosphoinositidespecific phospholipase C （PLC2） GeneLI Moye， ZHAO Hui， JIANG Yang， LI Kailong et al（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Northeast Forestry University，Harbin， Heilongjiang 150040）Abstract [Objective] To analyze and predict the structure and feature of Populus tomentosa PLC2 gene/protein through bioinformatics method， and provide theoretical foundation for gene cloning and function research. [Method] Utilize various online databases and bioinformatics software to predict PLC2 gene and its corresponding protein. [Result] The GenBank accession number of PLC2 is JX424764.1， ORF is 957bp in length， encoding 318aa； the molecular weight of PLC2 is 35 999.1D， theoretical isoelectric point is 7.07； PLC2 has a higher homology withXP_002313726.1， belonging to PIPLCc_GDPD_SF superfamily， has no Oglycosylation site， no disulfide bond， no transmembrane domain or signal peptide， but 16 phosphorylation sites. [Conclusion] This study has predicted the structure and function of PLC2 gene/protein and paved the way for the following experiments.Key words Populus tomentosa； Phosphoinositidespecific phospholipase C； Bioinformatics毛白杨（Populus tomentosa）是以黄河中、下游流域为中心而广泛分布的杨柳科落叶乔木，该树种适应能力较强，是速生用材林，为防护林和行道河渠绿化的理想选择[1]。
毛果杨PGR5基因转南林895杨的分子鉴定及表达量1）
毛果杨PGR5基因转南林895杨的分子鉴定及表达量1）王丽娜;李开隆【摘要】We introduced PGR5 gene from Populus trichocarpa toPopulus×euramericana cv. ‘Nanlin895 by agrobacterium medi⁃ated method, screened these transgenic plants by hygromycin resistance gene, and took the molecular detection and expres⁃sion analysis of these transgenic plants. With the data of PCR detection, 12 of 23 clones were positives, and the gene was integrated into the genome of poplars. ByRT⁃PCR detection, 12 clones had positive bands which were consistentwith the anticipated objective strap size, and the gene was expressed atthe transcripional level. By real time⁃PCR detection, the ex⁃pression of the 12 positive clones were 220 times as much as wild types.%采用农杆菌介导法将毛果杨（ Populus trichocarpa） PGR5基因转化南林895杨，经潮霉素抗性基因筛选并对转基因植株进行了分子检测和表达量分析。
普通PCR检测结果显示，有12株检测到阳性信号，表明该基因已整合到南林895杨基因组中；经RT－PCR检测，该12株转化子在目的基因处有阳性条带，表明该基因在转录水平表达；实时荧光定量PCR检测结果显示，12株阳性苗的表达量为野生型的2～20倍。
毛果杨PLD基因家族全基因组水平鉴定及其盐胁迫下的表达分析
2021,34(3):23-36 http ://www」ykxyj. com
D01:10.13275/ki.lykxxj.2021.03.003
毛果杨PLD基因家族全基因组水平鉴定 及其盐胁迫下的表达分析
刘 聪1,张 洋-夏德安1,陈雪冰1,魏志刚旷
1材料与方法
1.1毛果杨PLDs家族成员鉴定及基本特征分析 利用报道的拟南芥PLD的氨基酸序列比对
Phytozome 网站(https://) 中 的毛果杨基因组数据库凹，同时在毛果杨数据库检 索已注释的PZD,将获得的序列结果汇总并剔除 重复序列后作为候选基因。为了验证初始结果的可 靠性，将候选基因的氨基酸序列上传至HMMER 网站(https:///Tools/hmmer)以及 NCBI 保守结构域数据库(https:/// cdd/)鉴定保守结构域，以含有2个间隔250〜 400氨基酸的PLD典型HKD结构域(HMM模型 登录号为PF00614 )为标准进行筛选，并根据保守 结构域鉴定蛋白类型，最终鉴定出毛果杨PQ家 族全部成员小'"'珈性
动作用。
关键词:毛果杨；PZQ基因家族；生物信息学分析；盐胁迫
中图分类号:Q943
文献标志码:A
文章编号:1001-1498(2021)03-0023-14
植物作为固着生物，需要应对干旱、盐碱、低 温、高温以及病虫害侵袭等多种逆境胁迫，而对胁 迫信号的感知和转导是植物应对环境胁迫的前提和 基础叭研究表明，植物体内胁迫信号的转导需 要多种信号转导物质参与，如ABA、乙烯、H2O2 和NO等激素和小分子化合物囱以及信号转导蛋 白G蛋白切、磷脂酶AH〕、磷脂酶C^、磷脂酶D (PLD)问等激酶，其中，PLD能够水解磷酸二脂 键使细胞膜磷脂产生磷脂酸(PA)和可溶性头
毛果杨RAV基因家族生物信息学与组织表达分析
安徽农学通报2023年22期林业科学毛果杨RAV基因家族生物信息学与组织表达分析范文欣刘秋艳陈甜王一淇王海凌王晓立*（宿迁学院建筑工程学院园林教研室，江苏宿迁223800）摘要鉴定毛果杨基因组上RAV同源蛋白（PtRAV），为进一步分析毛果杨RAV同源蛋白基因提供信息。
从Phytozome数据库中查找已知RAV基因保守蛋白序列，通过毛果杨数据库得到毛果杨全基因组RAV保守蛋白序列。
解析RAV基因物理化学性质和亚细胞定位用，构建系统发育树以及组织表达。
本研究有利于为后续克隆毛果杨RAV基因提供信息，并为RAV同源蛋白功能的解析、调控网络的构建以及为植物的生长发育及抗逆中的作用提供一定的参考。
关键词毛果杨；RAV；理化性质分析；组织表达中图分类号Q811.4文献标识码A文章编号1007-7731（2023）22-0069-05毛果杨（Populus trichocarpa）为杨柳科半常绿乔木，具有易繁殖、生长迅速等特点，是木本植物研究的模式生物。
转录因子是一类能够与DNA序列特异性结合[1]，调节基因转录本表达的蛋白质。
转录因子在植物的生长发育、代谢反应和抗逆反应等多种过程中发挥重要作用[2]。
RAV属于AP2/ERF 转录因子家族的一个亚家族，仅在植物中存在，对植物的多个生物学过程有重要意义。
RAV蛋白同时含有B3保守域和AP2保守域[3]，其中B3保守域能特异地与靶序列CACCTG结合，处于蛋白C端；处于蛋白N端的AP2结构域则与GCC盒结合密切相关。
相关学者已在多个植物中对RAV家族进行了全基因组分析：荔枝[4]（Litchi chinensis）和杧果[5]（Mangifera indica）中鉴定得到4个RAV转录因子；新疆沙冬青[6]（Ammopiptanthus mongolicus）、钻天柳[7]（Chosenia arbutifolia）、二倍体棉花[8]（Gossypium australe）和龙眼[9]（Dimocarpus longan）中的RAV成员数量分别是2、4、10和4个；在拟南芥中[10]鉴定有13个RAV基因，其中有6个具有AP2结构域，其他则只具有B3结构域。
毛果杨PtrMYB161基因在木质部发育中的表达调控
毛果杨PtrMYB161基因在木质部发育中的表达调控刘欣颖;刘宝光;王志凤;刘慧子;李伟;姜立泉【摘要】木材形成是一个复杂的发育过程包括维管形成层分化形成次生木质部以及木质部中细胞壁的加厚等,其中MYB家族转录因子在此过程中发挥着重要调控作用.通过RNA-seq对毛果杨(Populus trichocarpa)基因组中的MYB基因表达模式分析,结果发现PtrM YB161基因在木质部特异表达,并且主要在纤维细胞中特异表达.为解析该基因在木质部发育中的表达调控功能,构建35S::PtrMYB161植物表达栽体并进行毛果杨遗传转化,共获得6个PtrMYB161过表达转基因株系.RT-PCR 结果表明,在过表达转基因株系中PtrMYB161基因的表达丰度增加500～5 000倍.表型和组织形态学分析表明,表达丰度增加最多的L5株系表现出明显的植株矮小、叶片面积小、茎节短、茎直径小、木质部面积减小及纤维细胞数量降低等特征,表明PtrMYB161基因参与调控毛果杨木质部发育等过程并起着至关重要的作用.【期刊名称】《东北林业大学学报》【年(卷),期】2018(046)008【总页数】6页(P20-24,73)【关键词】毛果杨;PtrMYB161;遗传转化;木质部发育【作者】刘欣颖;刘宝光;王志凤;刘慧子;李伟;姜立泉【作者单位】林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040;林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040;林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040;林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040;林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040;林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040【正文语种】中文【中图分类】S722.3+9木材是植物次生生长所形成的木质化组织，是制浆造纸、建筑和生物质能源的重要原材料，是不可或缺的可再生资源[1-2]。
毛果杨多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白家族PtPGIP_的生物信息学分析
山西农业科学 2023，51（8）：852-860Journal of Shanxi Agricultural Sciences毛果杨多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白家族PtPGIP 的生物信息学分析刘海静，田星，王露，宫海丰，殷涵，刘浩宁，包玉英（内蒙古大学 牧草与特色作物生物学教育部重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010020）摘要：植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（Polygalacturonase -inhibiting protein ，PGIP ）可特异性识别病原菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶，从而抑制病原菌对植物细胞壁重要成分——果胶的降解，以增强植物病原菌抗性。
为探明模式树种杨树PGIP 抗病机制，对毛果杨PGIP （PtPGIP ）家族成员进行鉴定，以及对蛋白质理化性质和结构、系统进化、基因表达模式进行分析。
结果表明，毛果杨基因组中鉴定到4个PtPGIP 基因，其中，PtPGIP1和PtPGI2位于6号染色体串联重复，PtPGIP3和PtPGIP4位于16号染色体串联重复；PtPGIP1是假基因，PtPGIP2、PtPGIP3、PtPGIP4具有完整的PGIP 蛋白结构域。
PtPGIP 均为疏水蛋白，具有良好的脂溶性，且具有3~7个N -糖基化位点。
亚细胞定位预测表明，其可能定位于细胞外。
除PtPGIP1以外，PtPGIP2、PtPGIP3、PtPGIP4蛋白均包含10个LRR 片段，LRR 中的保守序列xxLxLxx 及蛋白质分子对接均表现出差异性。
PtPGIP 基因的表达具有组织特异性，PtPGIP1基因在各个组织部位的表达水平均较低，PtPGIP2和PtPGIP4基因在根、幼苗、花序中的表达量高于叶片，尤其是PtPGIP2基因在花序中的表达量最高，说明毛果杨PGIP 基因家族发生了功能分化，使其在应对多种逆境胁迫中发挥重要作用。
关键词：毛果杨；多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白；基因序列；表达模式；蛋白结构中图分类号：S792.11 文献标识码：A 文章编号：1002‒2481（2023）08‒0852‒09Bioinformatics Analysis of Polygalacturonase-Inhibitor ProteinFamily PtPGIP in Populus trichocarpaLIU Haijing ，TIAN Xing ，WANG Lu ，GONG Haifeng ，YIN Han ，LIU Haoning ，BAO Yuying（Key Laboratory of Herbage and Endemic Crop Biology ，Ministry of Education ，Inner Mongolia University ，Hohhot 010020，China ）Abstract ：Polygalacturonases inhibiting proteins(PGIPs) are produced by plants to specifically recognize pathogen -secreted polygalacturonases, further inhibiting degradation of pectin, an important component of plant cell wall by pathogen, which enhances the resistance to plant pathogens. To explore the disease resistance mechanism of PGIP in a model tree species of Poplar, in this study, the members of PGIP(PtPGIP) family in Populus trichocarpa were identified, physical and chemical properties and structure of proteins, phylogeny,and gene expression patterns of PGIP(PtPGIP) family in Populus trichocarpa were analyzed. The results showed that four PtPGIP genes were identified in the Populus trichocarpa . PtPGIP1 and PtPGI2 were tandem duplications and located on Chr. 6, PtPGIP3 and PtPGIP4 were tandem duplications and located on Chr.16, PtPGIP1 was a pseudogen, and PtPGIP2, PtPGIP3, and PtPGIP4 possessed a complete PGIP protein domain. All PtPGIPs were hydrophobic proteins, had good lipophilicity and 3 to 7 N -glycosylation sites. Subcellular localization prediction indicated that they were probably located outside the cell. PtPGIP2, PtPGIP3, and PtPGIP4 contained 10 LRR fragments except for the PtPGIP1. The conserved sequence xxLxLxx in LRR as well as protein molecular docking showed differences. PtPGIP genes revealed tissue -specific expression. The expression levels of PtPGIP1 were low in various tissues. While the expression levels of PtPGIP2 and PtPGIP4 in roots, seedlings, and inflorescences were higher than those in leaves, especially the expression level of PtPGIP2 was the highest in inflorescences, indicating that the PGIP gene family of Populus trichocarpa had undergone functional differentiation, which made it play an important role in coping with various adversity stresses.Key words ：Populus trichocarpa ; polygalacturonase -inhibitor protein; gene sequence; expression pattern; protein structuredoidoi:10.3969/j.issn.1002-2481.2023.08.03收稿日期：2022-11-25基金项目：内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJZY19009）；内蒙古大学引进高层次人才科研启动基金项目（21400-5175163）作者简介：刘海静（1986-），女，河北承德人，讲师，博士，主要从事植物基因家族进化研究工作。
基于CRISPR／ Cas9 的毛果杨bHLH106 转录因子的功能研究
第４５卷㊀第６期２０２１年１１月南京林业大学学报（自然科学版）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＥｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．６Ｎｏｖ．，２０２１ＤＯＩ：１０．１２３０２／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－２００６．２０２１０７０３１㊀收稿日期Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：２０２１⁃０７⁃２０㊀㊀㊀㊀修回日期Ａｃｃｅｐｔｅｄ：２０２１⁃０８⁃２５㊀基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（３２００１３３２）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（２５７２０１８ＣＬ０１）㊂㊀第一作者：孙佳彤（ｓｕｎｊｔｔ８９＠１６３．ｃｏｍ）㊂∗通信作者：周晨光（ｚｈｏｕｃｈｅｎｇｕａｎｇ＠ｎｅｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ），讲师，负责实验指导与论文修改，ＯＲＣＩＤ（００００－０００１－６４１４－４６９３）；李伟（ｗｅｉｌｉ２０１５＠ｎｅｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ），教授，负责选题与实验方案确定，ＯＲＣＩＤ（００００－０００２－４４０７－９３３４）㊂㊀引文格式：孙佳彤，国艳娇，李爽，等．基于ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的毛果杨ｂＨＬＨ１０６转录因子的功能研究［Ｊ］．南京林业大学学报（自然科学版），２０２１，４５（６）：１５－２３．ＳＵＮＪＴ，ＧＵＯＹＪ，ＬＩＳ，ｅｔａｌ．ＡｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｔｕｄｙｏｆｂＨＬＨ１０６ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｂａｓｅｄｏｎＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＥｄｉｔｉｏｎ），２０２１，４５（６）：１５－２３．ＤＯＩ：１０．１２３０２／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－２００６．２０２１０７０３１．基于ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的毛果杨ｂＨＬＨ１０６转录因子的功能研究孙佳彤，国艳娇，李㊀爽，周晨光∗，姜立泉，李㊀伟∗（林木遗传育种国家重点实验室（东北林业大学），黑龙江㊀哈尔滨㊀１５００４０）摘要：ʌ目的ɔ采用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因编辑系统创制毛果杨（Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）ｂＨＬＨ１０６（ＢａｓｉｃＨｅｌｉｘ－Ｌｏｏｐ－Ｈｅｌｉｘ１０６）基因的突变体，分析植株的表型特征，初步揭示ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因在毛果杨木材形成过程中的功能㊂ʌ方法ɔ基于前期对毛果杨野生型（ＷＴ）茎干的不同细胞类型（形成层㊁木质部和韧皮部细胞）ＲＮＡ－ｓｅｑ数据，克隆得到一个在形成层及木质部较高表达的ｂＨＬＨ基因ＰｔｒｂＨＬＨ１０６㊂采用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因编辑技术创制毛果杨ＰｔｒｂＨＬＨ１０６的功能缺失突变体㊂对生长６０㊁９０㊁１２０ｄ的毛果杨ｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体和ＷＴ植株进行表型观察；对生长１２０ｄ的植株各茎节进行石蜡切片，利用甲苯胺蓝染色观察并进行细胞统计分析㊂ʌ结果ɔ获得毛果杨ｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体；与ＷＴ相比，突变体植株的株高㊁地径无明显差异；在整个测量的生长周期中，第８茎节长度有缩短的趋势，茎节数量有增加的趋势；形成层细胞层数有增加的趋势但差异不显著，导管细胞孔径显著增大，纤维细胞数量显著减少㊂ʌ结论ɔｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体与ＷＴ植株在导管孔径和纤维细胞数量上存在差异，初步证明ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因参与了调控毛果杨次生木质部的发育㊂关键词：毛果杨；次生木质部发育；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因编辑；ＰｔｒｂＨＬＨ１０６转录因子中图分类号：Ｓ７９２．１１；Ｑ９４３．２㊀㊀㊀㊀文献标志码：Ａ开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：文章编号：１０００－２００６（２０２１）０６－００１５－０９ＡｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｔｕｄｙｏｆｂＨＬＨ１０６ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｂａｓｅｄｏｎＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａＳＵＮＪｉａｔｏｎｇ，ＧＵＯＹａｎｊｉａｏ，ＬＩＳｈｕａｎｇ，ＺＨＯＵＣｈｅｎｇｕａｎｇ∗，ＣＨＩＡＮＧＶｉｎｃｅｎｔ，ＬＩＷｅｉ∗（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＴｒｅｅＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００４０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ʌＯｂｊｅｃｔｉｖｅɔＷｅｇｅｎｅｒａｔｅｄＣＲＩＳＰＲ⁃ｂａｓｅｄｍｕｔａｎｔｓｏｆＰｔｒｂＨＬＨ１０６ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｉｔｓｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅｗｏｏｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ．ʌＭｅｔｈｏｄɔＢａｓｅｄｏｎｔｈｅｐｒｅｖｉｏｕｓＲＮＡ⁃ｓｅｑｄａｔａｏｆｖａｒｉｏｕｓｃｅｌｌｔｙｐｅｓ（ｃａｍｂｉｕｍ，ｘｙｌｅｍａｎｄｐｈｌｏｅｍｃｅｌｌｓ）ｏｆＰ．ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ，ｗｅｃｌｏｎｅｄａｂＨＬＨｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ，ＰｔｒｂＨＬＨ１０６，ｗｈｉｃｈｉｓｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｃａｍｂｉｕｍａｎｄｘｙｌｅｍ．ＴｈｅＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｓｙｓｔｅｍｗａｓｕｓｅｄｔｏｇｅｎｅｒａｔｅｐｔｒｂｈｌｈ１０６ｍｕｔａｎｔｓ．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓｏｆｐｔｒｂｈｌｈ１０６ａｎｄｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅ（ＷＴ）ｐｌａｎｔｓｇｒｏｗｎｆｏｒ６０，９０ａｎｄ１２０ｄｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔ．Ｐａｒａｆｆｉｎｓｅｃｔｉｏｎｓｏｆｓｔｅｍｉｎｔｅｒｎｏｄｅｓｏｆｐｔｒｂｈｌｈ１０６ａｎｄＷＴｐｌａｎｔｓｇｒｏｗｎｆｏｒ１２０ｄａｙｓｗｅｒｅｃｒｅａｔｅｄ，ａｎｄｔｏｌｕｉｄｉｎｅｂｌｕｅｓｔａｉｎｉｎｇｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌａｎａｌｙｓｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｗｏｏｄｃｅｌｌｓ．ʌＲｅｓｕｌｔɔＰｈｅｎｏｔｙｐｅｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗｅｒｅｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｐｌａｎｔｈｅｉｇｈｔａｎｄｇｒｏｕｎｄｄｉａｍｅｔｅｒ．ＣｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈａｔｉｎＷＴｐｌａｎｔｓ，ｔｈｅｉｎｔｅｒｎｏｄｅｓｌｅｎｇｔｈｏｆ８ｔｈｓｔｅｍｒｅｄｕｃｅｄ，ｔｏｔａｌｎｕｍｂｅｒｏｆｓｔｅｍｉｎｔｅｒｎｏｄｅｓｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｌａｙｅｒｏｆｃａｍｂｉｕｍｃｅｌｌｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｍｕｔａｎｔｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｔｈｅａｂｏｖｅｉｎｄｅｘｅｓｗｅｒｅｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｌｕｍｅｎａｒｅａｏｆｐｅｒｖｅｓｓｅｌｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｆｉｂｅｒｃｅｌｌｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｐｔｒｂｈｌｈ１０６．ʌＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎɔＴｈｅｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｐｔｒｂｈｌｈ１０６ｍｕｔａｎｔｓａｎｄＷＴｐｌａｎｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＰｔｒｂＨＬＨ１０６ｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙｘｙｌｅｍｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ. All Rights Reserved.南京林业大学学报（自然科学版）第４５卷ｉｎＰ．ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ；ｓｅｃｏｎｄａｒｙｘｙｌｅｍｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｓｙｓｔｅｍ；ＰｔｒｂＨＬＨ１０６ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ㊀㊀木材形成机制研究一直是林木研究的重点㊂木材的形成是一个高度有序且连续的过程，包括维管形成层的增殖㊁木质部细胞的分化扩张㊁次生细胞壁的沉积增厚㊁细胞的程序性死亡［１－２］㊂次生木质部包括纤维细胞㊁导管细胞和射线细胞［３］㊂已经从模式植物中鉴定出许多参与次生木质部发育的转录因子，它们形成转录调控网络用以调控木材的形成过程［４－６］㊂因此，探究转录因子在木材形成过程中的作用机制，可为利用林木分子生物学手段改良木材性状，提高木材质量提供理论依据㊂ｂＨＬＨ（ＢａｓｉｃＨｅｌｉｘ－Ｌｏｏｐ－Ｈｅｌｉｘ）是一类碱性螺旋－环－螺旋类转录调控因子，主要存在于真核生物中，是仅次于ＭＹＢ的第２大转录因子家族㊂在植物中，ｂＨＬＨ转录因子家族对植物的调控发育㊁胁迫响应㊁信号传导和次生生长方面起着重要作用［７－８］㊂大多数ｂＨＬＨ蛋白是在模式植物拟南芥中被发现和鉴定的，其功能包括：参与调节信号传导合成代谢途径，如植物激素的合成㊁光信号传导［９－１０］㊁光敏信号的调节［１１－１２］㊁脱落酸信号传导［１３］；参与植物的生长发育，如种子的萌发；调控植物抗逆胁迫，如低温胁迫［１４］㊁盐胁迫［１５］等㊂此外，ｂＨＬＨ基因家族同样参与木质部的生长发育，例如一个非典型的ｂＨＬＨ转录因子调节生长素下游的早期木质部发育［１６］；棉花ｂＨＬＨ蛋白ＧｈＦＰ１正向调节纤维细胞的伸长［１７］；在拟南芥次生细胞壁的相关转录组数据中，识别到了一些ｂＨＬＨ转录因子调控次生细胞壁的合成［１８］；在一项研究中确定一个ｂＨＬＨ转录因子二聚体ＴＭＯ５／ＬＨＷ是拟南芥中维管发育的关键调节因子［１９］，其缺失突变体中维管组织逐渐消失；ｂＨＬＨ转录因子ＬＨＷ－Ｔ５Ｌ１二聚体促进木质部前体细胞中关键细胞分裂素基因的表达，导致周围细胞中细胞分裂素水平升高，从而促进原形成层细胞的特异性增殖［２０］㊂然而，ｂＨＬＨ转录因子参与林木木材形成还鲜见报道㊂基因编辑工具的出现，为基因功能的研究和植物性状的改良带来了很大的帮助［２１］㊂ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅ⁃ｐｅａｔｓ）基因编辑技术在很大程度上提高了基因编辑的效率和实用性㊂目前，该技术已被广泛应用于基础科学㊁人类疾病治疗㊁作物基因功能及遗传育种等领域的研究中［２２］㊂ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统共包含了两个部分：向导ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）和Ｃａｓ９核酸酶，该系统的主要功能是在特定的基因组位点诱导ＤＮＡ双链的断裂［２３］㊂双链断裂之后非同源末端连接的细胞修复可能导致碱基的插入或缺失［２４］，从而改变碱基序列㊂利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术可以对全基因组的任何一个基因进行基因编辑，可通过ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统获得产量㊁品质和抗性都更高的优良品种［２５］㊂例如通过ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术编辑马铃薯Ｒ基因得到抗病马铃薯品系［２６］；以ＣＲＩＳＰＲ介导ＣＣＲ的基因编辑技术获得了低木质素的新杨树优良品系［２７］㊂自２０１５年首次将ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统应用于杨树中以来［２８］，已有许多将ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统应用于树木的基因功能研究㊂例如，利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术创制毛果杨ＰｔｒＶＣＳ２基因突变体，通过对突变体植株的分析发现ＰｔｒＶＣＳ２促进形成层向木质部分化，使植株提前产生增厚的次生细胞壁，表明毛果杨ＰｔｒＶＣＳ２参与木材形成的调控［２９］；利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术得到毛果杨形成层特异表达的ＰｔｒＷＯＸ４转录因子功能缺失突变体，使植株顶端优势被破坏，顶芽和根部发育不良，形成层发育受到显著影响，木质部分化紊乱［３０］㊂本研究通过分析东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室姜立泉团队前期对野生型（ＷＴ）毛果杨茎干不同细胞类型进行的ＲＮＡ－ｓｅｑ数据分析，鉴定出一个在形成层和次生木质部细胞中较高表达的ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因，利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统创制了毛果杨ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因功能缺失突变体㊂通过对突变体的表型观察及分析，初步揭示该基因在木材形成方面的功能㊂１㊀材料与方法１．１㊀实验材料、载体及试剂实验材料为东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室（本实验室）保存的毛果杨植株，基因型为Ｎｉｓｑｕａｌｌｙ－１㊂用次氯酸钠（ＮａＣｌＯ）对野生型毛果杨侧枝进行消毒后，经植物组织培养进行芽诱导，获得无菌毛果杨组培苗㊂组织培养条件：温度２５ħ，光强约４０μｍｏｌ／（ｍ２㊃ｓ），光周期为１６ｈ光照／８ｈ黑暗㊂温室培养条件：温度范围２２ ２５ħ，光强约３００μｍｏｌ／（ｍ２㊃ｓ），光周期为１６ｈ光照／８ｈ黑暗㊂温室种植毛果杨使用１３５ħ高温高压灭６１. All Rights Reserved.㊀第６期孙佳彤，等：基于ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的毛果杨ｂＨＬＨ１０６转录因子的功能研究菌３０ｍｉｎ后冷却的土壤㊂ｐＥＮＴＲ载体（ｐＥＮＴＲ／Ｄ－ｔｏｐｏ）购自ＬｉｆｅＩｎ⁃ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；Ｔ载体（ｐＭＤ１８－Ｔ）购自ＴａＫａＲａ；ｐＵＣ１９－ＧＦＰ载体为本实验室保存；ｐＥｇＰ２３７－２Ａ－ＧＦＰ由ＫｅｉｓｈｉＯｓａｋａｂｅ实验室惠赠㊂ＲＮＡ试剂盒（ＲＮｅａｓｅｐｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ）㊁胶回收试剂盒（ＧＥＬＥｘ⁃ｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ）㊁ＰＣＲ纯化试剂盒（ＰＣＲｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ）㊁质粒提取试剂盒（Ｐｌａｓｍｉｄｍｉｎｉｋｉｔ）均购自ＱＩＡＧＥＮ公司；反转录试剂盒（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔ）购自ＴＡＫＡＲＡ；Ｐｆｕ聚合酶（ＰｆｕＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ）购自Ａｇｌｉｅｎｔ公司；体外转录试剂盒（Ｔ７ｑｕｉｃｋｈｉｇｈｙｉｅｌｄＲＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓｋｉｔ）购自ＮＥＢ；甲苯胺蓝染色剂购自Ｓｉｇｍａ；大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０感受态细胞㊁根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ３１０１感受态细胞均为本实验室保存㊂１．２㊀毛果杨ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因的克隆与分析根据ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因的ＩＤ（Ｐｏｔｒｉ．００６Ｇ０３７１００），在毛果杨基因组网站（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｈｙ⁃ｔｏｚｏｍｅ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／ｐｚ／ｐｏｒｔａｌ．ｈｔｍｌ）下载基因序列，设计特异性引物（表１）㊂使用ＲＮＡ提取试剂盒对毛果杨的分化木质部总ＲＮＡ进行提取，使用反转录试剂盒进行反转录后得到的ｃＤＮＡ作为ＰＣＲ扩增模板，对目的基因进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ反应体系：１０ˑＰｆｕＢｕｆｆｅｒ２μＬ㊁ｄＮＴＰｓ２μＬ㊁ｃＤＮＡ模板１μＬ㊁正反向引物各１μＬ㊁ＰｆｕＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．４μＬ㊁去离子水１２．６μＬ，反应体系为２０μＬ㊂ＰＣＲ反应程序：９４ħ预变性２ｍｉｎ；９４ħ变性４５ｓ，５２ħ退火３０ｓ，６８ħ延伸３０ｓ，３０个循环；６８ħ再延伸３０ｍｉｎ㊂ＰＣＲ扩增获得该基因片段，并连接到ｐＥＮＴＲ载体上，经热激法大肠杆菌转化后，获得阳性克隆，测序检测ＰｔｒｂＨＬＨ１０６序列㊂表１㊀所用引物及序列Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｌｉｓｔｉｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ引物名称ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ引物序列ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ用途ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＦ５ᶄ－ＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＡＣＴＧＴＣＡＧＧＡＧ－３ᶄＲ５ᶄ－ＣＡＴＡＧＣＣＡＴＴＣＡＡＣＧＴＣＣＡＡＡＧＡＴ－３ᶄＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因克隆ｃｌｏｎｉｎｇｏｆＰｔｒｂＨＬＨ１０６ｇｅｎｅＴ７－ｂＨＬＨ１０６⁃ｓｔｅｍ⁃ｌｏｏｐ５ᶄ－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＣＣＡＴＴＣＴＣＧＧＴＡＡＧＡＡＡＣＧＴＴＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧ－３ᶄ体外检测的ｇＲＮＡ转录模板ｇＲＮＡｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｔｅｍｐｌａｔｅｆｏｒｉｎｖｉｔｒｏｄｅ⁃ｔｅｃｔｉｏｎｐＵＣ１９－Ｆ５ᶄ－ＣＴＡＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＴＴＧＣＧＧＧＴＣＡＴＣＴＣ－３ᶄｐＵＣ１９－Ｒ５ᶄ－ＣＴＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＣＴＴＧＴＴＴＧＴＧＴＡＧＡＴＣＣＡＡＧ－３ᶄ体外检测中的模板ＤＮＡｔｈｅｔｅｍｐｌａｔｅＤＮＡｆｏｒｉｎｖｉｔｒｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎｇＲＮＡ－Ｆ５ᶄ－ＧＡＴＴＧＴＴＣＣＡＴＴＣＴＣＧＧＴＡＡＧＡＡＡＣ－３ᶄｇＲＮＡ－Ｒ５ᶄ－ＧＴＴＴＣＴＴＡＣＣＧＡＧＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＡＡ－３ᶄｐＥｇＰ２３７载体构建，Ｒ端引物亦用于转基因植株鉴定ｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐＥｇＰ２３７，ｇＲＮＡ－ＲａｌｓｏｆｏｒｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＭ１３Ｆ５ᶄ－ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ－３ᶄ转基因鉴定ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＰｔｒｂＨＬＨ１０６－Ｆ５ᶄ－ＡＣＴＴＧＣＧＧＧＴＣＡＴＣＴＣＣＣＴＴ－３ᶄＰｔｒｂＨＬＨ１０６－Ｒ５ᶄ－ＧＣＣＴＧＣＡＡＣＡＣＣＴＡＡＡＡＡＴＡＴＴ－３ᶄ靶位点编辑情况的鉴定ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇ１．３㊀毛果杨ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因ｇＲＮＡ选取及体外切割验证㊀㊀使用在线工具（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ＣＲＩＳＰＲ２／）对ＰｔｒｂＨＬＨ１０６进行ｇＲＮＡ的选取，选取ｇＲＮＡ的原则是分数高㊁脱靶概率低于０．５㊁ＧＣ含量在５０％左右，且定位在外显子上㊂在挑选好的ｇＲＮＡ序列前加Ｔ７启动子（５ᶄ－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ⁃ＣＡＣＴＡＴＡＧＧ－３ᶄ），后加ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ（５ᶄ－ＧＴＴＴＡ⁃ＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧ－３ᶄ），该序列作为ｇＲＮＡ的体外转录模板序列，用于ｇＲＮＡ的体外切割验证㊂将ｇＲＮＡ体外转录模板序列经ＰＣＲ反应生成双链ＤＮＡ㊂ＰＣＲ反应体系为：Ｔ７－ｂＨＬＨ１０６－ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ（０．５μｍｏｌ／Ｌ）２μＬ㊁ＢＳ６（０．５μｍｏｌ／Ｌ）２μＬ㊁Ｔ２５（１０μｍｏｌ／Ｌ）５μＬ㊁ＢＳ７（１０μｍｏｌ／Ｌ）５μＬ㊁ｄＮＴＰＭｉｘ１μＬ㊁１０ˑＰＣＲＢｕｆｆｅｒ５μＬ㊁ｒＴａｑ１μＬ㊁去离子水２９μＬ，共５０μＬ㊂ＰＣＲ反应程序：９５ħ１ｍｉｎ；９５ħ１０ｓ，５９ħ１０ｓ，７２ħ１０ｓ，４５个循环；７２ħ，３０ｓ㊂ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因ｇＲＮＡ的体外转录：利用体外转录试剂盒对ｇＲＮＡ进行体外转录，反应体系为：ＮＴＰＢｕｆｆｅｒＭｉｘ７．５μＬ㊁Ｎｕｃｌｅａｓｅ⁃ｆｒｅｅｗａｔｅｒ３７１. All Rights Reserved.南京林业大学学报（自然科学版）第４５卷μＬ㊁ＴｅｍｐｌａｔｅＤＮＡ８μＬ㊁Ｔ７ＲＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ１．５μＬ，共２０μＬ㊂置于３７ħ恒温水浴锅中４ｈ㊂模板载体的构建及模板质粒线性化：依据毛果杨网站提供的ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因全基因组的序列信息及ｐＵＣ１９－３５Ｓ－ＧＦＰ载体上所含有的酶切位点，在ｇＲＮＡ前后共１ｋｂ位置设计带有酶切位点的特异性引物（表１）㊂ＰＣＲ模板为野生型的全基因组ＤＮＡ，ＰＣＲ扩增后对目标片段的胶回收产物和ｐＵＣ１９－３５Ｓ－ＧＦＰ质粒分别同时进行ＢａｍＨⅠ和ＳａｌⅠ双酶切，Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行连接，将连接产物利用热激法转化到ＴＯＰ１０大肠杆菌中，筛选阳性单克隆进行测序验证㊂测序正确的单克隆进行质粒的提取，使用ＰｓｔⅠ进行模板质粒ｐＵＣ１９－Ｐｔｒ⁃ｂＨＬＨ１０６的线性化，酶切产物纯化后获得线性化的体外切割模板ＤＮＡ㊂体外检测ｇＲＮＡ切割结果：检测体系为Ｃａｓ９蛋白（１ｍｇ／ｍＬ，本实验室前期纯化获得）２μＬ㊁ｇＲＮＡ２μＬ㊁线性化的ＤＮＡ模板１２μＬ㊁Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）０．８μＬ㊁ＤＴＴ０．０２μＬ㊁ＭｇＣｌ２１μＬ㊁ＰＢＳ２．１８μＬ㊂置于３７ħ恒温水浴锅１ｈ，１ｈ后迅速放入液氮中，随后用ＰＣＲ纯化试剂盒进行产物纯化，经琼脂糖凝胶电泳检测并观察结果㊂１．４㊀ＣＲＩＳＰＲ基因编辑载体的构建设计经体外验证的ｇＲＮＡ引物（表１），对ｇＲＮＡ进行引物复性㊂反应体系为：１０ˑＥＸ－ＴａｑＢｕｆｆｅｒ２μＬ㊁ｇＲＮＡ－Ｆ９μＬ㊁ｇＲＮＡ－Ｒ９μＬ，共２０μＬ㊂ＰＣＲ反应程序如下：９５ħ３０ｓ；７２ħ２ｍｉｎ；３７ħ２ｍｉｎ；２５ħ２ｍｉｎ㊂ＰＣＲ产物稀释１００倍待用㊂载体ｐＥｇＰ２３７－２Ａ－ＧＦＰ经ＢｓａⅠ单酶切，与ＰｔｒｂＨＬＨ１０６的ｇＲＮＡ用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，将连接产物利用热激法转化到ＴＯＰ１０大肠杆菌中，筛选阳性单克隆进行测序验证，随后将阳性质粒ｐＥｇＰ２３７－Ｕ６－ＰｔｒｂＨＬＨ１０６ｇＲＮＡ－３５Ｓ－Ｃａｓ９转入ＧＶ３１０１农杆菌中，用于毛果杨的遗传转化㊂１．５㊀毛果杨遗传转化及转基因植株的鉴定毛果杨遗传转化采用已建立的农杆菌介导法［３１－３２］，选择生长３０ｄ左右的健康毛果杨无菌组培苗，株高１０ １２ｃｍ，切下第２ ３节茎段，用农杆菌侵染２０ｍｉｎ后放置暗处共培养４８ｈ；暗培养结束后，用含有２５０ｍｇ／Ｌ头孢霉素的无菌水浸泡清洗茎段，随后移至含有２５ｍｇ／Ｌ卡那霉素和２５０ｍｇ／Ｌ头孢霉素的选择培养基上，培养２５ ３０ｄ后，将抗性芽移至含有２０ｍｇ／Ｌ卡那霉素和１２５ｍｇ／Ｌ头孢霉素的抗性芽生根培养基中㊂待植株生根后，剪下转基因植株的叶片并提取全基因组ＤＮＡ，用ｐＥｇＰ２３７－２Ａ－ＧＦＰ上的Ｆ端引物Ｍ１３Ｆ（表１）和ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因ｇＲＮＡ的Ｒ端引物（表１）进行ＰＣＲ扩增鉴定㊂１．６㊀转基因植株ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因编辑情况鉴定㊀㊀参照毛果杨ＤＮＡ序列，在包含ｇＲＮＡ位点的上下游共５００ｂｐ处设计引物，以转基因植株ＤＮＡ为扩增模板，扩增目的片段ＤＮＡ，加Ａ尾后连接到Ｔ载体上，用热激法转化到ＴＯＰ１０大肠杆菌中，每个植株挑取３０个阳性单克隆进行测序，与野生型序列进行比对㊂１．７㊀毛果杨表型分析及茎的横切面解剖观察分别在ｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体和野生型毛果杨生长６０㊁９０和１２０ｄ时对其进行株高㊁地径测量，每个基因型取３株，重复３次测量㊂在ｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体和野生型毛果杨生长１２０ｄ时，分别取第２㊁４㊁６㊁８㊁１０茎节制作石蜡切片，利用甲苯胺蓝对切片进行染色，在Ｍ８数字扫描显微成像系统（Ｐｒｅｃｉｐｏｉｎｔ）下观察横切面细胞形态㊂１．８㊀测序及数据分析测序服务及全部引物的合成均由吉林省库美生物科技有限公司完成（ｗｗｗ．ｃｏｍａｔｅｂｉｏ．ｃｏｍ）㊂利用ＳＰＳＳ软件中的独立样本ｔ检验法对各生长指标及细胞数进行差异显著性分析，当Ｐ＜０．０５时，表示差异显著，当Ｐ＜０．０１时差异极显著㊂用ＳｉｇｍａＰｌｏｔ１０．０软件进行制图㊂２㊀结果与分析２．１㊀ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因的获得研究团队前期通过激光显微切割技术（ｌａｓｅｒｃａｐｔｕｒｅｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ，ＬＣＭ），分别精确收集了毛果杨野生型植株第８茎节的形成层㊁木质部和韧皮部细胞，对其进行ＲＮＡ－ｓｅｑ数据分析，结果发现ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因主要在形成层和木质部细胞中表达（图１），因此推测ＰｔｒｂＨＬＨ１０６可能在形成层和木质部发育中发挥一定的调控作用㊂通过对Ｐｔｒ⁃ｂＨＬＨ１０６的克隆及测序，获得７２３ｂｐ的ＣＤＳ序列㊂２．２㊀毛果杨ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因突变体的创制为了进一步研究ＰｔｒｂＨＬＨ１０６在木材形成过程中的功能，采用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因编辑技术创制了毛果杨ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因功能缺失突变体㊂在突变体创制前，利用体外切割技术对选取的ｇＲＮＡ进行了验证，以便确定ｇＲＮＡ的可用性㊂８１. All Rights Reserved.㊀第６期孙佳彤，等：基于ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的毛果杨ｂＨＬＨ１０６转录因子的功能研究标准化ＦＰＫＭ值即转录本丰度标准化为每千个碱基的转录每百万映射读取的片段数，误差线代表３个生物学重复的标准误㊂ＮｏｒｍａｌｉｚｅｄＦＰＫＭｉｎｄｉｃａｔｅｓｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｂｕｎｄａｎｃｅｓａｓｆｒａｇｍｅｎｔｓｐｅｒｋｉｌｏｂａｓｅｏｆｅｘｏｎｍｏｄｅｌｐｅｒｍｉｌｌｉｏｎｍａｐｐｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓ．ＥｒｒｏｒｂａｒｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔＳＥｖａｌｕｅｓｏｆｔｈｒｅｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．图１㊀毛果杨ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因在不同组织细胞类型中的表达Ｆｉｇ．１㊀ＴｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆＰｔｒｂＨＬＨ１０６ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｅｌｌｔｙｐｅｓｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ２．２．１㊀ｇＲＮＡ的体外验证通过ｇＲＮＡ网站预测，选取１条分数高㊁脱靶概率低㊁ＧＣ含量在５０％左右的ＰｔｒｂＨＬＨ１０６外显子上ｇＲＮＡ，切割的模板示意图如图２Ａ所示，ｇＲＮＡ位于线性化ＤＮＡ模板的－９５２ｂｐ处㊂经过体外切割，琼脂糖凝胶电泳结果如图２Ｂ所示，在不加入ｇＲＮＡ或Ｃａｓ９蛋白时，装有ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因片段的模板ＤＮＡ均未被切断（第１和２号泳道），在加入ｇＲＮＡ㊁Ｃａｓ９蛋白和模板ＤＮＡ后，ＤＮＡ被有效切成２段，电泳条带在约４．５ｋｂ和０．９ｋｂ处（第３泳道），与理论长度相符㊂该结果说明，选用的ｇＲＮＡ序列可有效结合Ｃａｓ９蛋白，并对靶位点进行切割，可用于后续实验㊂Ａ．模板ＤＮＡ示意图ｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｔｅｍｐｌａｔｅＤＮＡ；Ｂ．凝胶电泳结果ｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓ（Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ１００００；１㊁２．对照组ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；３．检测样品ｓａｍｐｌｅ）㊂图２㊀ｇＲＮＡ体外验证Ｆｉｇ．２㊀ＴｈｅｃｌｅａｖａｇｅａｓｓａｙｉｎｖｉｔｒｏｏｆｇＲＮＡ２．２．２㊀毛果杨遗传转化及转基因植株鉴定构建ＣＲＩＳＰＲ载体ｐＥｇＰ２３７－Ｕ６－ＰｔｒｂＨＬＨ１０６ｇＲＮＡ－３５Ｓ－Ｃａｓ９，通过农杆菌侵染㊁抗性愈伤组织出芽㊁抗性芽在卡那霉素培养基上两次生根筛选过程（图３Ａ ３Ｃ），获得３株抗性生根植株㊂提取待鉴定的抗性植株叶片基因组ＤＮＡ，使用载体引物Ｍ１３－Ｆ和ＰｔｒｂＨＬＨ１０６的ｇＲＮＡ－Ｒ端引物进行ＰＣＲ扩增，鉴定结果如图３Ｄ所示，两个阴性对照（第１和３泳道）均未扩增出片段条带，而抗性植株（第４ ６泳道）均扩增出与阳性对照（第２泳道）相同大小的条带，说明ＰｔｒｂＨＬＨ１０６重组质粒已经成功整合到毛果杨基因组中㊂Ａ．愈伤组织分化诱导ｃａｌｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；Ｂ．抗性芽诱导ｓｈｏｏｔｉｎ⁃ｄｕｃｔｉｏｎ；Ｃ．抗性植株筛选ｓｃｒｅａｎｉｎｇｏｆｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｌａｎｔｓ；Ｄ．转基因植株的ＰＣＲ鉴定ｔｈｅＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓ（Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００㊂１．ｄｄＨ２Ｏ为模板的阴性对照ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｗｉｔｈｄｄＨ２ＯａｓＰＣＲｔｅｍｐｌａｔｅ；２．ｐＥｇＰ２３７－Ｕ６－ＰｔｒｂＨＬＨ１０６ｇＲＮＡ－３５Ｓ－Ｃａｓ９质粒为模板的阳性对照ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｗｉｔｈｐｌａｓｍｉｄｐＥｇＰ２３７－Ｕ６－ＰｔｒｂＨＬＨ１０６ｇＲＮＡ－３５Ｓ－Ｃａｓ９ａｓＰＣＲｔｅｍｐｌａｔｅ；３．野生型毛果杨叶片ＤＮＡ为模板的阴性对照ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｗｉｔｈｌｅａｆＤＮＡｏｆｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅｐｌａｎｔａｓＰＣＲｔｅｍｐｌａｔｅ；４ ６．抗性植株叶片ＤＮＡ为模板的样品ｓａｍｐｌｅｗｉｔｈｌｅａｆＤＮＡｏｆｋａｎａｍｙｃｉｎ⁃ｒｅ⁃ｓｉｓｔａｎｔｐｌａｎｔａｓＰＣＲｔｅｍｐｌａｔｅ）㊂图３㊀毛果杨转基因植株的获得Ｆｉｇ．３㊀ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ２．２．３㊀ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因编辑情况分析对转基因植株的ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因靶位点的编辑情况进行测序鉴定，结果如图４Ａ所示：３个株系的突变体ｇＲＮＡ处均插入或缺失不同数量的碱基，如ｐｔｒｂｈｌｈ１０６－１的两条等位基因分别插入１个碱基和缺失２个碱基，ｐｔｒｂｈｌｈ１０６－２的两条等位基因分别插入１个碱基和缺失３个碱基，ｐｔｒｂｈｌｈ１０６－３的两条等位基因分别插入１个碱基和缺失１６个碱基㊂３个突变体植株均为双等位突变㊂编辑ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因后的蛋白翻译情况如图４Ｂ，部分碱基的插入和缺失后，导致翻译提前终止，产生的９１. All Rights Reserved.南京林业大学学报（自然科学版）第４５卷氨基酸序列远短于正常的ＰｔｒｂＨＬＨ１０６，ｐｔｒｂｈｌｈ１０６－２的１条等位基因缺失了１个氨基酸同时造成１个氨基酸的改变，其他基因序列的翻译序列均未包含ｂＨＬＨ家族的典型ＨＬＨ结构域［１８］㊂该结果表明，已成功获得毛果杨ｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体㊂为验证ＰｔｒｂＨＬＨ１０６转录因子的功能，选取突变体植株ｐｔｒｂｈｌｈ１０６－２㊁ｐｔｒｂｈｌｈ１０６－３进行后续研究㊂Ａ．等位基因编辑情况（红色字母表示碱基插入，红色 － 表示碱基缺失， －１６ｂｐ－ 表示缺失１６个碱基）ｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆａｌｌｅｌｅｓ（Ｔｈｅｒｅｄｌｅｔｔｅｒｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｓｅｒｔｉｏｎ；ｔｈｅｒｅｄｓｈｏｒｔｌｉｎｅｓ － ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｄｅｌｅｔｉｏｎ； －１６ｂｐ－ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ１６ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｄｅｌｅｔｉｏｎ）；Ｂ．被编辑基因的蛋白翻译情况预测（红色块区域代表氨基酸改变）ｔｈｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｅｄｓｈｏｒｔｌｉｎｅｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｍｉｎｏａｃｉｄｃｈａｎｇｅｄ）㊂图４㊀毛果杨ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因编辑情况Ｆｉｇ．４㊀ＧｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆＰｔｒｂＨＬＨ１０６ｇｅｎｅｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ误差线代表由３个生物学重复计算的标准误，∗表示通过ｔ检验，突变体与野生型植物各株系之间存在显著差异，∗．Ｐ＜０．０５，∗∗．Ｐ＜０ ０１）㊂下同㊂Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｒｏｗｔｈｉｎｄｅｘｏｆｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅ（ＷＴ）ａｎｄｐｔｒｂｈｌｈ１０６ｐｌａｎｔｓ．ＥｒｒｏｒｂａｒｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔＳＥｖａｌｕｅｓｏｆｔｈｒｅｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ａｓｔｅｒｉｓｋｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｅａｃｈｌｉｎｅｏｆｔｈｅｍｕｔａｎｔｓａｎｄｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅｐｌａｎｔｓｂｙＳｔｕｄｅｎｔ ｓｔｔｅｓｔ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．图５㊀毛果杨野生型与ｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体表型分析Ｆｉｇ．５㊀ＰｈｅｎｏｔｙｐｅｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＷＴａｎｄｐｔｒｂｈｌｈ１０６ｍｕｔａｎｔｓｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ２．３㊀毛果杨ｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体的表型分析对ｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体植株进行无性扩繁后，与高度相似的野生型毛果杨组培苗一起盆栽于温室中，在植株自然生长６０㊁９０和１２０ｄ时进行表型观察（图５）㊂从生长过程来看，毛果杨ｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体与野生型相比，株高和地径没有明显差异㊂同０２. All Rights Reserved.㊀第６期孙佳彤，等：基于ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的毛果杨ｂＨＬＨ１０６转录因子的功能研究时对茎节数以及第８茎节长度进行测定，统计结果表明，突变体植株在生长６０ｄ时的茎节数量显著大于野生型，随着植株生长时间的延长，茎节数有增加的趋势，但差异不显著；第８茎节的长度在植株生长６０和１２０ｄ时与ＷＴ差异显著，从植株生长周期来看，突变体植株第８茎节的长度有缩短的趋势㊂由以上结果初步推测，ＰｔｒｂＨＬＨ１０６的功能缺失，对植株的生长未造成严重的影响㊂为了进一步解析ＰｔｒｂＨＬＨ１０６在杨树木材形成过程中发挥的功能，通过石蜡切片对毛果杨ｂｈｌｈ１０６突变体的第２㊁４㊁６㊁８和１０茎节的横切面进行观察，结果显示突变体的各类型细胞的形态与野生型毛果杨无差异（图６Ａ）㊂对切片中单位面积的导管细胞㊁纤维细胞数量及单个导管细胞的孔径进行统计分析，结果（图６Ｃ和６Ｄ）表明，与野生型相比突变体植株的纤维细胞数量显著减少，导管细胞数量无明显差异，单个导管孔径显著增加㊂对形成层细胞进行观察分析，发现突变体植株的形成层层数有增加的趋势，但差异不显著（图６Ｂ和６Ｅ）㊂以上结果表明，ＰｔｒｂＨＬＨ１０６转录因子的功能缺失，导致木质部纤维细胞数量减少，导管孔径增大，初步说明该转录因子在次生木质部发育过程中发挥了调控作用㊂Ａ．野生型（ＷＴ）和突变体（ｐｔｒｂｈｌｈ１０６）毛果杨各茎节细胞形态观察（比例尺为２００μｍ）ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｓｔｅｍｉｎｔｅｒｎｏｄｅｓｏｆＷＴａｎｄｐｔｒｂｈｌｈ１０６（Ｂａｒｓ＝２００μｍ）；Ｂ．形成层细胞形态观察（红色线表示形成层区域，比例尺为１００μｍ）ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｃａｍｂｉｕｍｃｅｌｌｓ（Ｒｅｄｌｉｎｅｓｈｏｗｅｄｃａｍｂｉｕｍａｒｅａｓ，Ｂａｒｓ＝１００μｍ）；Ｃ．单位面积细胞数目统计ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｎｕｍｂｅｒｏｆｆｉｂｅｒａｎｄｖｅｓｓｅｌｃｅｌｌｓｉｎｐｅｒｕｎｉｔｃｅｌｌｓ；Ｄ．导管孔径面积统计ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｌｕｍｅｎａｒｅａｏｆｐｅｒｖｅｓｓｅｌ；Ｅ．形成层细胞层数统计ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｎｕｍｂｅｒｏｆｃａｍｂｉｕｍｃｅｌｌｌａｙｅｒ㊂图６㊀毛果杨ｐｔｒｂｈｈ１０６突变体石蜡切片观察及细胞统计Ｆｉｇ．６㊀Ｐａｒａｆｆｉｎｓｅｃｔｉｏｎｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌａｎａｌｙｓｅｓｏｆｃｅｌｌｓｉｎｐｔｒｂｈｌｈ１０６ｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ３㊀讨㊀论因树木生长周期长㊁遗传背景复杂㊁基因组信息不完善等因素的制约，对树木的生长发育和环境适应等方面的研究受到很多技术的限制，尤其是在基因功能研究过程中，功能缺失突变体的创制异常困难㊂然而ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因编辑技术在２０１５年首次用于杨树［２８］，就预示着树木突变体的创制１２. All Rights Reserved.南京林业大学学报（自然科学版）第４５卷不再是困扰科研人员的技术问题㊂应用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统成功获得了一个毛果杨转录因子的功能缺失突变体，为研究该转录因子功能提供了重要的遗传材料㊂在研究中，为了更加高效地获得毛果杨突变体，应用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统原理，开发了简易的体外切割实验，对选取的ｇＲＮＡ进行验证㊂实验结果也表明，经过验证的ｇＲＮＡ在毛果杨体内同样发挥着靶向高效性㊂该实验体系具有简便㊁耗时短㊁结果易观察等优点，但也存在ＤＮＡ模板单一的缺点，后续将对该体系进行进一步优化㊂不同的载体系统随着ＣＲＩＳＰＲ系统在作物中的广泛应用应运而生，本研究使用的载体系统来自Ｏｓａｋａｂｅ研究团队［３３－３４］，该载体系统可成功应用于苹果㊁葡萄等木本植物中，也同样成功地应用到林木中［３２，３５］㊂本研究中获得的３株转基因毛果杨经测序鉴定，均为双等位突变体，说明该载体系统在毛果杨中具有很高的编辑效率㊂目前获得树木的单突变体已不再困难，但是获得树木的双突变体或多突变体，仍是对开发高效ＣＲＩＳＰＲ系统的挑战㊂树木的遗传背景复杂，生长周期长，获得完整㊁高质量基因注释的树种还较少，许多树种的遗传转化系统不完善，缺少针对树木开发的ＲＮＡ聚合酶Ⅲ类启动子，都是制约树木多突变体创制的因素㊂此外，基因的精准编辑如单碱基编辑已广泛应用于农作物中［３６］，而在树木中还未建立完善的碱基编辑系统㊂Ｌｉ等［３７］首次在杨树中成功利用碱基编辑器对木质素合成酶基因４ＣＬ进行单碱基突变，预示着ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统也将在树木中持续发挥其巨大的潜力㊂木材形成是一个高度复杂的发育过程，涉及多类转录因子家族的参与和调控㊂从生物解剖学来看，木材是由次生木质部增厚的次生细胞壁形成的，而有关次生细胞壁的调控网络更是涉及多种转录因子，如ＮＡＣ㊁ＭＹＢ家族转录因子，分别在木质部纤维细胞㊁导管细胞的发育过程中起到分子开关㊁次级调控因子的作用［３８－３９］㊂除此之外，其他家族转录因子在木材形成调控网络中也直接或间接地调控木材形成相关基因的表达［６］㊂ｂＨＬＨ家族转录因子参与木质部的发育过程［１６－１８］，本研究的ＰｔｒｂＨＬＨ１０６属于该家族成员，主要在毛果杨的形成层和木质部表达㊂ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因编辑的突变体ｐｔｒｂｈｌｈ１０６在生长上并未受到影响，并且形成层的细胞层数有增加的趋势但变化不显著，说明ＰｔｒｂＨＬＨ１０６的功能缺失未对整个植株的生长和形成层细胞的分裂分化造成明显影响㊂值得注意的是，在选取突变体做后续实验时，其中１株突变体的基因编辑结果并未造成ＰｔｒｂＨＬＨ１０６氨基酸序列的较大变化，推测还保留该基因的功能㊂而两个突变体的表型一致，综合两个突变体的基因编辑情况和表型结果，说明可能是由于基因存在功能冗余［３２］，单独敲除１个基因，往往不能对树木重要发育过程产生很大影响㊂这一推测将通过后续获得多突变体等手段进行验证㊂本研究在木材发育相关基因的功能研究中发现，ｂＨＬＨ１０６基因在木材发育方面具有重要功能㊂毛果杨ｐｔｒｂｈｌｈ１０６突变体与野生型植株相比，虽然苗高生长和地径在统计学上没有显著的差别，但解剖视野中纤维细胞数量显著减少㊁导管孔径显著增大，形成层细胞层数增加，这说明ＰｔｒｂＨＬＨ１０６在树木的木质部细胞发育和木材形成过程中，对调控径向生长量可能有重要的作用㊂在木本植物中，有关木质部发育的转录调控，与木材生物质累积和木质资源的生物产品转化高度相关［４０－４１］㊂ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因对木材细胞壁纤维细胞的数量㊁导管的孔径大小，以及形成层细胞层数的调控，可能对木质部的组分，如纤维素含量㊁木质素Ｓ／Ｇ比例㊁含量甚至结构产生影响，从而改变木材的理化性质及终产品的加工利用工艺和品质㊂这也是杨树木材材性遗传改良的重要发展方向和研究重点［４２－４３］㊂诚然，本研究虽然拓宽了ｂＨＬＨ转录因子的功能范围，但有关ＰｔｒｂＨＬＨ１０６基因的更多功能及其分子调控机制还需要进一步深入探究㊂参考文献（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）：［１］ＮＵＬＬ．Ｅｓａｕ ｓｐｌａｎｔａｎａｔｏｍｙ：ｍｅｒｉｓｔｅｍｓ，ｃｅｌｌｓ，ａｎｄｔｉｓｓｕｅｓｏｆｔｈｅｐｌａｎｔｂｏｄｙ：ｔｈｅｉｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．ＣｈｏｉｃｅＲｅｖＯｎｌｉｎｅ，２００７，４４（７）：４４－３８６１．ＤＯＩ：１０．５８６０／ｃｈｏｉｃｅ．４４－３８６１．［２］李慧，郭晓蕊，刘雅琳，等．木材形成过程中次生壁沉积和细胞程序性死亡的分子调控机制［Ｊ］．中国科学（生命科学），２０２０，５０（２）：１２３－１３５．ＬＩＨ，ＧＵＯＸＲ，ＬＩＵＹＬ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｍｏ⁃ｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｎｓｅｃｏｎｄａｒｙｗａｌｌｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈｏｆｗｏｏｄｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＳｃｉＳｉｎ（Ｖｉｔａｅ），２０２０，５０（２）：１２３－１３５．ＤＯＩ：１０．１３６０／ＳＳｖ－２０１９－０１３３．［３］ＥＡＳＵＫ．Ｐｌａｎｔａｎａｔｏｍｙ［Ｍ］．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９６４．［４］ＭＣＣＡＲＴＨＹＲＬ，ＺＨＯＮＧＲ，ＹＥＺＨ．ＳｅｃｏｎｄａｒｙｗａｌｌＮＡＣｂｉｎｄ⁃ｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔ（ＳＮＢＥ），ａｋｅｙＣｉｓ⁃ａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｔａｒｇｅｔｇｅｎｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｂｙｓｅｃｏｎｄａｒｙｗａｌｌＮＡＣｍａｓｔｅｒｓｗｉｔｃｈｅｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＳｉｇｎａｌＢｅｈａｖ，２０１１，６（９）：１２８２－１２８５．ＤＯＩ：１０．４１６１／ｐｓｂ．６．９．１６４０２．［５］ＬＩＮＹＣ，ＬＩＷ，ＳＵＮＹＨ，ｅｔａｌ．ＳＮＤ１ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ⁃ｄｉｒｅｃｔｅｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌｇｅｎｅｔｉｃｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｎｅｔ⁃ｗｏｒｋｉｎｗｏｏｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２０１３，２５（１１）：４３２４－４３４１．ＤＯＩ：１０．１１０５／ｔｐｃ．１１３．１１７６９７．［６］ＣＨＥＮＨ，ＷＡＮＧＪＰ，ＬＩＵＨＺ，ｅｔａｌ．ＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒａｎｄｃｈｒｏｍａｔｉｎｂｉｎｄｉｎｇｎｅｔｗｏｒｋｆｏｒｗｏｏｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２０１９，３１（３）：６０２－６２６．ＤＯＩ：１０．１１０５／ｔｐｃ．１８．００６２０．［７］文静，王春涛，杨永平．植物木质部次生细胞壁加厚调控的研究进展［Ｊ］．西南林业大学学报（自然科学），２０２１，４１（２）：２２. All Rights Reserved.㊀第６期孙佳彤，等：基于ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的毛果杨ｂＨＬＨ１０６转录因子的功能研究１８２－１８８．ＷＥＮＪ，ＷＡＮＧＣＴ，ＹＡＮＧＹＰ．Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｘｙｌｅｍｓｅｃｏｎｄａｒｙｃｅｌｌｗａｌｌｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇｉｎｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＪＳｏｕｔｈｗｅｓｔＦｏｒＵｎｉｖ（ＮａｔＳｃｉ），２０２１，４１（２）：１８２－１８８．ＤＯＩ：１０．１１９２９／ｊ．ｓｗｆｕ．２０１９０９０７７．［８］ＨＥＩＭＭＡ，ＪＡＫＯＢＹＭ，ＷＥＲＢＥＲＭ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｂａｓｉｃｈｅｌｉｘ⁃ｌｏｏｐ⁃ｈｅｌｉｘｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｆａｍｉｌｙｉｎｐｌａｎｔｓ：ａｇｅｎｏｍｅ⁃ｗｉｄｅｓｔｕｄｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙ［Ｊ］．ＭｏｌＢｉｏｌＥｖｏｌ，２００３，２０（５）：７３５－７４７．ＤＯＩ：１０．１０９３／ｍｏｌｂｅｖ／ｍｓｇ０８８．［９］ＮＡＫＡＴＡＭ，ＭＩＴＳＵＤＡＮ，ＨＥＲＤＥＭ，ｅｔａｌ．ＡｂＨＬＨ⁃ｔｙｐｅｔｒａｎ⁃ｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ，ａｂａ⁃ｉｎｄｕｃｉｂｌｅＢＨＬＨ⁃ｔｙｐｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒ／ＪＡ⁃ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＭＹＣ２⁃Ｌｉｋｅ１，ＡｃｔｓａｓａｒｅｐｒｅｓｓｏｒｔｏｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｊａｓｍｏｎａｔｅｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２０１３，２５（５）：１６４１－１６５６．ＤＯＩ：１０．１１０５／ｔｐｃ．１１３．１１１１１２．［１０］ＱＩＴ，ＨＵＡＮＧＨ，ＷＵＤ，ｅｔａｌ．ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＥＬＬＡａｎｄＪＡＺｐｒｏ⁃ｔｅｉｎｓｂｉｎｄｔｈｅＷＤ⁃ｒｅｐｅａｔ／ｂＨＬＨ／ＭＹＢｃｏｍｐｌｅｘｔｏｍｏｄｕｌａｔｅｇｉｂ⁃ｂｅｒｅｌｌｉｎａｎｄｊａｓｍｏｎａｔｅｓｉｇｎａｌｉｎｇｓｙｎｅｒｇｙ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２０１４，２６（３）：１１１８－１１３３．ＤＯＩ：１０．１１０５／ｔｐｃ．１１３．１２１７３１．［１１］ＮＩＭ，ＴＥＰＰＥＲＭＡＮＪＭ，ＱＵＡＩＬＰＨ．ＰＩＦ３，ａｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ⁃ｉｎｔｅｒ⁃ａｃｔｉｎｇｆａｃｔｏｒｎｅｃｅｓｓａｒｙｆｏｒｎｏｒｍａｌｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，ｉｓａｎｏｖｅｌｂａｓｉｃｈｅｌｉｘ⁃ｌｏｏｐ⁃ｈｅｌｉｘｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，１９９８，９５（５）：６５７－６６７．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｓ００９２－８６７４（００）８１６３６－０．［１２］ＨＵＱＥ，ＱＵＡＩＬＰＨ．ＰＩＦ４，ａｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ⁃ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｂＨＬＨｆａｃｔｏｒ，ｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｓａｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅＢｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．ＥＭＢＯＪ，２００２，２１（１０）：２４４１－２４５０．ＤＯＩ：１０．１０９３／ｅｍｂｏｊ／２１．１０．２４４１．［１３］ＡＢＥＨ，ＵＲＡＯＴ，ＩＴＯＴ，ｅｔａｌ．ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＡｔＭＹＣ２（ｂＨＬＨ）ａｎｄＡｔＭＹＢ２（ＭＹＢ）ｆｕｎｃｔｉｏｎａｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｏｒｓｉｎａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２００３，１５（１）：６３－７８．ＤＯＩ：１０．１１０５／ｔｐｃ．００６１３０．［１４］ＷＡＮＧＹ，ＪＩＡＮＧＣＪ，ＬＩＹＹ，ｅｔａｌ．ＣｓＩＣＥ１ａｎｄＣｓＣＢＦ１：ｔｗｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｃｏｌｄｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎＣａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ，２０１２，３１（１）：２７－３４．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ００２９９－０１１－１１３６－５．［１５］ＡＨＭＡＤＡ，ＮＩＷＡＹ，ＧＯＴＯＳ，ｅｔａｌ．ｂＨＬＨ１０６ｉｎｔｅｇｒａｔｅｓｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｇｅｎｅｓｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｉｒＧ⁃ｂｏｘｔｏｃｏｎｆｅｒｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１５，１０（５）：ｅ０１２６８７２．ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１２６８７２．［１６］ＯＨＡＳＨＩ⁃ＩＴＯＫ，ＭＡＴＳＵＫＡＷＡＭ，ＦＵＫＵＤＡＨ．ＡｎａｔｙｐｉｃａｌｂＨＬＨｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｅｓｅａｒｌｙｘｙｌｅｍｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｏｆａｕｘｉｎ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１３，５４（３）：３９８－４０５．ＤＯＩ：１０．１０９３／ｐｃｐ／ｐｃｔ０１３．［１７］ＬＩＵＺＨ，ＣＨＥＮＹ，ＷＡＮＧＮＮ，ｅｔａｌ．Ａｂａｓｉｃｈｅｌｉｘ⁃ｌｏｏｐ⁃ｈｅｌｉｘｐｒｏｔｅｉｎ（ＧｈＦＰ１）ｐｒｏｍｏｔｅｓｆｉｂｒｅｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｏｆｃｏｔｔｏｎ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍ）ｂｙｍｏｄｕｌａｔｉｎｇｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ［Ｊ］．ＮｅｗＰｈｙｔｏｌ，２０２０，２２５（６）：２４３９－２４５２．ＤＯＩ：１０．１１１１／ｎｐｈ．１６３０１．［１８］ＣＡＳＳＡＮ⁃ＷＡＮＧＨ，ＧＯＵÉＮ，ＳＡＩＤＩＭＮ，ｅｔａｌ．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｏｖｅｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｓｅｃｏｎｄａｒｙｃｅｌｌｗａｌｌｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔＰｌａｎｔＳｃｉ，２０１３，４：１８９．ＤＯＩ：１０．３３８９／ｆｐｌｓ．２０１３．００１８９．［１９］ＤＥＲＹＢＥＬＢ，ＭÖＬＬＥＲＢ，ＹＯＳＨＩＤＡＳ，ｅｔａｌ．ＡｂＨＬＨｃｏｍｐｌｅｘｃｏｎｔｒｏｌｓｅｍｂｒｙｏｎｉｃｖａｓｃｕｌａｒｔｉｓｓｕｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅｇｒｏｗｔｈｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．ＤｅｖＣｅｌｌ，２０１３，２４（４）：４２６－４３７．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｄｅｖｃｅｌ．２０１２．１２．０１３．［２０］ＯＨＡＳＨＩ⁃ＩＴＯＫ，ＳＡＥＧＵＳＡＭ，ＩＷＡＭＯＴＯＫ，ｅｔａｌ．ＡｂＨＬＨｃｏｍｐｌｅｘａｃｔｉｖａｔｅｓｖａｓｃｕｌａｒｃｅｌｌｄｉｖｉｓｉｏｎｖｉａｃｙｔｏｋｉｎｉｎａｃｔｉｏｎｉｎｒｏｏｔａｐｉｃａｌｍｅｒｉｓｔｅｍ［Ｊ］．ＣｕｒｒＢｉｏｌ，２０１４，２４（１７）：２０５３－２０５８．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｕｂ．２０１４．０７．０５０．［２１］ＫＮＯＴＴＧＪ，ＤＯＵＤＮＡＪＡ．ＣＲＩＳＰＲ⁃Ｃａｓｇｕｉｄｅｓｔｈｅｆｕｔｕｒｅｏｆｇｅ⁃ｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１８，３６１（６４０５）：８６６－８６９．ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｔ５０１１．［２２］林萌萌，李春娟，闫彩霞，等．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因编辑技术在作物中的应用［Ｊ］．核农学报，２０２１，３５（６）：１３２９－１３３９．ＬＩＮＭＭ，ＬＩＣＪ，ＹＡＮＣＸ，ｅｔａｌ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｇｅｎｅｅｄｉ⁃ｔｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｃｒｏｐｓ［Ｊ］．ＪＮｕｃｌＡｇｒｉｃＳｃｉ，２０２１，３５（６）：１３２９－１３３９．ＤＯＩ：１０．１１８６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００－８５５１．２０２１．０６．１３２９．［２３］ＪＩＮＥＫＭ，ＣＨＹＬＩＮＳＫＩＫ，ＦＯＮＦＡＲＡＩ，ｅｔａｌ．Ａｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｄｕａｌ⁃ＲＮＡ⁃ｇｕｉｄｅｄＤＮＡｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎａｄａｐｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉａｌｉｍｍｕ⁃ｎｉｔｙ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３３７（６０９６）：８１６－８２１．ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉ⁃ｅｎｃｅ．１２２５８２９．［２４］ＢＯＲＴＥＳＩＬ，ＦＩＳＣＨＥＲＲ．ＴｈｅＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍｆｏｒｐｌａｎｔｇｅ⁃ｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇａｎｄｂｅｙｏｎｄ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＡｄｖ，２０１５，３３（１）：４１－５２．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｔｅｃｈａｄｖ．２０１４．１２．００６．［２５］ＺＡＦＡＲＳＡ，ＺＡＩＤＩＳＳ，ＧＡＢＡＹ，ｅｔａｌ．ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｖｉａＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇ［Ｊ］．ＪＥｘｐＢｏｔ，２０２０，７１（２）：４７０－４７９．ＤＯＩ：１０．１０９３／ｊｘｂ／ｅｒｚ４７６．［２６］ＫＩＥＵＮＰ，ＬＥＮＭＡＮＭ，ＷＡＮＧＥＳ，ｅｔａｌ．ＭｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｇｅｎｅｓｔｈｒｏｕｇｈＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｃｏｎ⁃ｆｅｒｉｎｃｒｅａｓｅｄｌａｔｅｂｌｉｇｈｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｐｏｔａｔｏｅｓ［Ｊ］．ＳｃｉＲｅｐ，２０２１，１１（１）：４４８７．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０２１－８３９７２－ｗ．［２７］ＤＥＭＥＥＳＴＥＲＢ，ＭＡＤＡＲＩＡＧＡＣＡＬＤＥＲÓＮＢ，ＤＥＶＲＩＥＳＬ，ｅｔａｌ．ＴａｉｌｏｒｉｎｇｐｏｐｌａｒｌｉｇｎｉｎｗｉｔｈｏｕｔｙｉｅｌｄｐｅｎａｌｔｙｂｙｃｏｍｂｉｎｉｎｇａｎｕｌｌａｎｄｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔＣＩＮＮＡＭＯＹＬ⁃ＣｏＡＲＥＤＵＣＴＡＳＥ２ａｌｌｅｌｅ［Ｊ］．ＮａｔＣｏｍｍｕｎ，２０２０，１１（１）：５０２０．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１８８２２－ｗ．［２８］ＦＡＮＤ，ＬＩＵＴ，ＬＩＣ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９⁃ｍｅｄｉａｔｅｄｔａｒ⁃ｇｅｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｉｎＰｏｐｕｌｕｓｉｎｔｈｅｆｉｒｓｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＳｃｉＲｅｐ，２０１５，５：１２２１７．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１２２１７．［２９］林娇娇．毛果杨ＰｔｒＶＣＳ２基因在木材形成中的功能研究［Ｄ］．哈尔滨：东北林业大学，２０２０．ＬＩＮＪＪ．ＦｕｎｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰｔｒＶＣＳ２ｇｅｎｅｉｎｗｏｏｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ［Ｄ］．Ｈａｒｂｉｎ：ＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０２０．［３０］毛昱力．毛果杨ＰｔｒＤＬＴ和ＰｔｒＷＯＸ４基因在维管形成层发育中的功能解析［Ｄ］．哈尔滨：东北林业大学，２０２０．ＭＡＯＹＬ．Ｆｕｎｃ⁃ｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰｔｒＤＬＴａｎｄＰｔｒＷＯＸ４ｇｅｎｅｓｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｖａｓｃｕｌａｒｃａｍｂｉｕｍｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ［Ｄ］．Ｈａｒｂｉｎ：ＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０２０．［３１］ＬＩＳ，ＺＨＥＮＣ，ＸＵＷ，ｅｔａｌ．Ｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔｒａｎｓｆｏｒ⁃ｍａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｏｔｙｐｅＮｉｓｑｕａｌｌｙ⁃１：ａｂａｓｉｃｔｏｏｌｆｏｒｔｈｅｆｉｒｓｔｓｅｑｕｅｎｃｅｄｍｏｄｅｌｔｒｅｅ［Ｊ］．ＳｃｉＲｅｐ，２０１７，７（１）：２６３８．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１７－０２６５１－ｘ．［３２］ＷＡＮＧＺＦ，ＭＡＯＹＬ，ＧＵＯＹＪ，ｅｔａｌ．ＭＹＢｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃ⁃ｔｏｒ１６１ｍｅｄｉａｔｅｓｆｅｅｄｂａｃｋｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙｗａｌｌ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＮＡＣ：ｄｏｍａｉｎ１ｆａｍｉｌｙｇｅｎｅｓｆｏｒｗｏｏｄｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，２０２０，１８４（３）：１３８９－１４０６．ＤＯＩ：１０．１１０４／ｐｐ．２０．０１０３３．［３３］ＯＳＡＫＡＢＥＹ，ＬＩＡＮＧＺ，ＲＥＮＣ，ｅｔａｌ．ＣＲＩＳＰＲ⁃Ｃａｓ９⁃ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｉｎａｐｐｌｅａｎｄｇｒａｐｅｖｉｎｅ［Ｊ］．ＮａｔＰｒｏｔｏｃ，２０１８，１３（１２）：２８４４－２８６３．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５９６－０１８－００６７－９．［３４］ＮＩＳＨＩＴＡＮＩＣ，ＨＩＲＡＩＮ，ＫＯＭＯＲＩＳ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｉｃｉｅｎｔｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｉｎａｐｐｌｅｕｓｉｎｇａＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．ＳｃｉＲｅｐ，２０１６，６：３１４８１．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ３１４８１．［３５］ＬＩＳ，ＬＩＮＹＪ，ＷＡＮＧＰ，ｅｔａｌ．ＴｈｅＡＲＥＢ１ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｉｎ⁃ｆｌｕｅｎｃｅｓｈｉｓｔｏｎｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｄｒｏｕｇｈｔｒｅｓｐｏｎｓｅｓａｎｄｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２０１９，３１（３）：６６３－６８６．ＤＯＩ：１０．１１０５／ｔｐｃ．１８．００４３７．［３６］ＺＨＵＨ，ＬＩＣ，ＧＡＯＣ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＣＲＩＳＰＲ⁃Ｃａｓｉｎａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｐｌａｎｔｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］．ＮａｔＲｅｖＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ，２０２０，２１（１１）：６６１－６７７．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５８０－０２０－００２８８－９．［３７］ＬＩＧ，ＳＲＥＴＥＮＯＶＩＣＳ，ＥＩＳＥＮＳＴＥＩＮＥ，ｅｔａｌ．ＨｉｇｈｌｙｅｆｆｉｃｉｅｎｔＣ－ｔｏ－ＴａｎｄＡ－ｔｏ－ＧｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇｉｎａＰｏｐｕｌｕｓｈｙｂｒｉｄ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＢｉｏ⁃ｔｅｃｈｎｏｌＪ，２０２１，１９（６）：１０８６－１０８８．ＤＯＩ：１０．１１１１／ｐｂｉ．１３５８１．［３８］ＫＵＢＯＭ，ＵＤＡＧＡＷＡＭ，ＮＩＳＨＩＫＵＢＯＮ，ｅｔａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓｗｉｔｃｈｅｓｆｏｒｐｒｏｔｏｘｙｌｅｍａｎｄｍｅｔａｘｙｌｅｍｖｅｓｓｅｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＧｅｎｅｓＤｅｖ，２００５，１９（１６）：１８５５－１８６０．ＤＯＩ：１０．１１０１／ｇａｄ．１３３１３０５．［３９］沈方圆，王岚春，李校．欧洲山杨ｂＨＬＨ转录因子家族全基因组分析［Ｊ］．四川大学学报（自然科学版），２０２１，５８（３）：１７９－１８７．ＳＨＥＮＦＹ，ＷＡＮＧＬＣ，ＬＩＸ．Ｇｅｎｏｍｅ⁃ｗｉｄｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｂＨＬＨｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｆａｍｉｌｙｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｅｍｕｌａ［Ｊ］．ＪＳｉｃｈｕａｎＵｎｉｖ（ＮａｔＳｃｉＥｄ），２０２１，５８（３）：１７９－１８７．ＤＯＩ：１０．１９９０７／ｊ．０４９０－６７５６．２０２１．０３６００３．［４０］ＺＨＡＮＧＪ，ＸＩＥＭ，ＴＵＳＫＡＮＧＡ，ｅｔａｌ．Ｒｅｃｅｎｔａｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙｃｅｌｌｗａｌｌｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｔｈｅｗｏｏｄｙｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔＰｌａｎｔＳｃｉ，２０１８，９：１５３５．ＤＯＩ：１０．３３８９／ｆｐｌｓ．２０１８．０１５３５．［４１］李少锋．林木木材形成机制及材性改良研究进展［Ｊ］．温带林业研究，２０１９，２（２）：４０－４７．ＬＩＳＦ．Ｗｏｏｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｉｎｆｏｒｅｓｔｔｒｅｅｓ［Ｊ］．ＪＴｅｍｐＦｏｒＲｅｓ，２０１９，２（２）：４０－４７．ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９６－４９００．２０１９．０２．００７．［４２］ＺＯＢＥＬＢＪ，ＪＥＴＴＪＢ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓｏｆｗｏｏｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｍ］．Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９９５．ＤＯＩ：１０．１００７／９７８－３－６４２－７９５１４－５．［４３］康向阳．林木遗传育种研究进展［Ｊ］．南京林业大学学报（自然科学版），２０２０，４４（３）：１－１０．ＫＡＮＧＸＹ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｆｏｒｅｓｔｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄｔｒｅｅｂｒｅｅｄｉｎｇ［Ｊ］．ＪＮａｎｊｉｎｇＦｏｒＵｎｉｖ（ＮａｔＳｃｉＥｄ），２０２０，４４（３）：１－１０．ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－２００６．２０２００２０３３．（责任编辑㊀吴祝华）３２. 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多毛番茄CIPK基因家族生物信息学分析及低温下功能研究
doi ：10.19928/ki.1000-6346.2021.2004多毛番茄CIPK 基因家族生物信息学分析及低温下功能研究柴 畅1 狄成乾1 汪 杨2 王傲雪1，2*（1东北农业大学园艺园林学院，黑龙江哈尔滨 150030；2东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030）摘 要：CIPK 基因家族是Ca 2+介导的植物信号转导途径中的一个关键家族，在植物胁迫响应和生长中起着关键作用。
本试验基于多毛番茄全基因组数据筛选出24个多毛番茄CIPK 基因家族成员，系统进化分析将家族成员分为5个亚组，家族成员内部含有5个基因复制对。
亚细胞定位分析表明，多毛番茄CIPK 基因大多定位于细胞质；少数分布于质膜、细胞核、线粒体。
共线性分析结果表明，拟南芥和栽培番茄中的CIPK 基因家族中分别有14个和12个基因与多毛番茄存在共线性关系。
顺式作用元件分析结果表明，多毛番茄CIPK 基因家族基因含有光、激素、冷胁迫等相关的元件。
实时荧光定量PCR 结果表明，低温胁迫下ShCIPK2、ShCIPK17、ShCIPK19表达量显著提高，推测这3个基因可能在多毛番茄低温胁迫应答中起重要的作用。
关键词：多毛番茄；CIPK ；生物信息学；低温离子通道，调控细胞质中游离钙离子浓度变化，产生相应生理反应。
这些传感器主要包括钙调素蛋白（CaM ）、钙依赖型蛋白激酶（CDPK ）和类钙调磷酸酶B 蛋白（CBL ）。
CBL 作为传感器需要与相互作用的蛋白激酶（CIPK ）特异性结合形成功能上的复合物传递植物信号，调控离子流入。
CIPK 蛋白包含保守的N 端的激酶结构域和C 端的调节结构域。
前者包含丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域，有可以磷酸化的激活环。
后者包含磷酸酶相互作用域PPI 和自调节结构域NAF （又称FISL 基序）。
特征氨基酸Asn （N ）、Ala （A ）、Phe （F ）、Ile （I ）、Ser （S ）和Leu （L ）组成的NAF 基序是结合CBL 蛋白所必需的（Albrecht et al.，2001）。
木薯MePP2CAa基因克隆、表达及蛋白互作分析
第43卷 第1期2024年 1月Vol.43 No.1Jan. 2024，141~148华中农业大学学报Journal of Huazhong Agricultural University木薯MePP2CAa 基因克隆、表达及蛋白互作分析曾坚1，李丽珍1，沈梓欣1，林墁1，刘博婷1，吴春来2，3，李冰4，胡伟3，曾力旺2，31.韶关学院广东省粤北食药资源利用与保护重点实验室/英东生物与农业学院，韶关 512005；2.中国热带农业科学院科技信息研究所，海口 571101；3.中国热带农业科学院热带作物生物育种全国重点实验室/热带生物技术研究所，海口 571101； 4.平江县第一中学，岳阳 414500摘要 为探究2C 型蛋白磷酸酶（protein phosphatase 2C ， PP2C ）在木薯响应非生物胁迫过程中的作用，利用木薯Arg7叶片cDNA 扩增MePP2CAa 基因，分析该基因序列、启动子活性、不同逆境和激素处理下的表达模式以及与ABA 受体PYLs 之间的互作关系。
序列分析结果显示，MePP2CAa 基因全长1 311 bp ，编码436个氨基酸，具有PP2C 家族的结构域特征，与橡胶树和麻风树的PP2C 序列同源性最高，分别为78.95%和74.09%，在C 端保守；qRT -PCR 分析结果显示，MePP2CAa 基因在木薯储藏根中的表达显著高于茎、叶中的表达量；不同逆境和激素处理结果显示，甘露醇、NaCl 、ABA 、MeJA 、低温和SA 处理可以显著诱导MePP2CAa 基因的表达；MePP2CAa 基因启动子序列分析显示，启动子包含ABA 应答元件（abscisic acid responsive element ，ABRE ）、MeJA 响应元件、干旱诱导元件等；酵母双杂交结果显示MePP2CAa 能够与MePYL1互作。
以上结果表明，MePP2CAa 基因可能响应木薯的非生物胁迫。
14个物种RPSA基因编码区生物信息学分析
14个物种RPSA基因编码区生物信息学分析作者：付鑫，李祥龙，周荣艳，等来源：《湖北农业科学》 2012年第2期付鑫，李祥龙，周荣艳，李兰会（河北农业大学动物科技学院，河北保定０７１００１）摘要：采用生物信息学方法比较分析了大熊猫、牛、家犬、马、原鸡、人、猕猴、小家鼠、兔、绵羊、黑猩猩、毛猩猩、褐家鼠和野猪ＲＰＳＡ基因编码区（ＣＤＳ）的遗传多样性，并对该基因编码的氨基酸序列、蛋白质二级结构和结构功能域进行预测和分析。
结果表明，在来自１４个物种的８４条基因序列中检测到３３８个多态位点，共发现４２种单倍型，物种间及物种内ＲＰＳＡ基因编码区存在较丰富的遗传多样性。
ＲＰＳＡ基因编码蛋白质等电点均低于6，呈酸性；蛋白质二级结构的主要结构元件是α－螺旋和无规则卷曲，有一个保守结构域。
关键词：物种；ＲＰＳＡ基因；遗传多样性；生物信息学中图分类号：Q38文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）02－0389-04ＲＰＳＡ（ＲｉｂｏｓｏｍａｌｐｒｏｔｅｉｎＳＡ）也叫３７ｋＤ层粘连蛋白受体前体／６７ｋＤ层粘连蛋白受体（ＬＲＰ／ＬＲ），是一种在一些诸如癌症和朊病毒疾病病变中起作用的多功能蛋白质［１］。
ＲＰＳＡ基因是多拷贝基因家族中的一员，包含一个完整的功能基因和若干伪基因［２］。
病变生成的癌症（各种恶性肿瘤的统称）有乳腺癌、卵巢癌、肺癌和宫颈癌等；朊病毒疾病又称可传播性海绵状脑病，是一类引起人和动物神经组织退化的疾病，包括人的克雅氏病（ＣＪＤ），动物的震颤病，疯牛病［３，４］（又称牛海绵状脑病），绵羊和山羊中的羊瘙痒病［５，６］等。
本研究选用ＧｅｎＢａｎｋ中已提交物种的ＲＰＳＡ基因的编码区序列，利用比较基因组学和生物信息学方法研究了该基因编码区的变异，探明了该基因在不同种间及种内的遗传分化，进而为动物癌症和朊病毒疾病发生的相关研究以及动物育种工作提供基础资料。
１材料与方法１．１序列来源从ＮＣＢＩ网站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）的ＧｅｎＢａｎｋ中下载大熊猫、牛、家犬、马、原鸡、人、猕猴、小家鼠、兔、绵羊、黑猩猩、毛猩猩、褐家鼠和野猪１４个物种的８４条ＲＰＳＡ基因编码区（ＣＤＳ）的序列（表１）。
毛果杨NLP基因家族生物信息学分析与鉴定_吴翔宇.
植物研究2014，34（1）：37 43Bulletin of Botanical Ｒesearch基金项目：863高科技项目（2013AA102702）和中央高校基本科研业务费专项资金资助（DL13EA03－01）第一作者简介：吴翔宇（1988—），男，硕士研究生，主要从事林木氮素营养的分子生物学研究。
*通信作者：E-mail ：liuguanjun2013@nefu．edu．cn 收稿日期：2013－11－10毛果杨NLP 基因家族生物信息学分析与鉴定吴翔宇1许志茹1，2曲春浦1李蔚1孙琦1刘关君1*（1．东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨150040；2．东北林业大学生命科学学院，哈尔滨150040）摘要NLP 基因家族是一类特殊的转录因子，豆科植物根瘤的形成依赖于该基因家族的存在，在非豆科植物中具有调节植物硝酸盐吸收以及同化的功能。
通过对毛果杨（Populus trichocarpa ）基因组的生物信息学分析，共鉴定出14个毛果杨NLP 基因家族成员，这些成员具有低亲水性的特点，基因结构保守，都含有ＲWP-ＲK 以及PB1两个保守结构域。
通过细胞定位预测，所有成员都定位在细胞核中。
直系同源与旁系同源进化分析显示，NLP 基因家族成员在漫长的进化过程中经历了严格的选择。
染色体定位分析表明，毛果杨NLP 基因家族成员坐落在毛果杨9条染色体之上，成员数量的扩增来自于杨柳科染色体自身的扩增事件。
芯片数据分析结果显示，NLP 基因家族成员在嫩叶，根和雄花中表达，部分基因在木质部以及种子萌发过程之中表达，但所有成员均不在成熟叶片中表达。
关键词毛果杨；NLP ；基因家族；表达模式中图分类号：S792．11文献标志码：Adoi ：10．7525/j．issn．1673－5102．2014．01．006Genome-wide Identification and Characterization of NLP Gene Family in Populus trichocarpaWU Xiang-Yu 1XU Zhi-Ｒu 1，2QU Chun-Pu 1LI Wei 1SUN Qi 1LIU Guan-Jun 1*（1．State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding ，Northeast Forestry University ，Harbin 150040；2．College of Life Science ，Northeast ForestryUniversity ，Harbin 150040）Abstract NLP gene family is a special transcription factor ，the initiation of nodule development is dependent on the function of this gene family ，in other species plant it has the function of regulating plant nitrate absorption and assimilation．Genome-wide analysis in Populus trichocarpa had identified 14NLP gene family members．These members have the characteristics of low hydrophilic ，the conservative gene structure and contain ＲWP-ＲKand PB1two conservative domain．The localization of all members of NLP genes in P．trichocarpa was predicted in the nucleus．Evolution analysis showed that NLP gene family members experience strict filter．Chromosome localization analysis showed that the members of P．trichocarpa NLP genes were located on 9chromosomes ，the expanding of NLPs in P．trichocarpa was caused by Salicaceae duplication events．Microarray data analysis showed that NLPs had a high transcript accumulation in leaf ，root and male catkins ，some genes were expressed in xylem ，seed and female catkins ，but no gene was detected in the mature leaf．Key words Populus trichocarpa ；NLP ；gene family ；expression pattern 植物在整个生命周期当中需要大量的氮素营养。
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毛果杨PP2C基因家族生物信息学分析摘要：蛋白磷酸酯酶2C(PP2C)是蛋白磷酸酯酶中的一大类,广泛参与逆境信号的传递过程。
本实验采用比较基因组学的方法，利用已知的拟南芥PP2C蛋白序列为检索序列，在全基因组水平上搜索毛果杨的PP2C基因的同源序列。
最终确定了毛果杨45个PP2C候选基因。
对同源序列作进一步的多序列联配、ESTs、MEME和系统发生表达分析。
关键词：毛果杨比较基因组学基因家族Abstract: Protein phosphatase 2C (PP2C) is a protein phosphatase in a large class, the broad participation of adversity signal transmission process. In this study, we searched the homologous sequence from Populus trichocarpa protein database based on the complete genome by using comparative genomics methods and taking the Arabidopsis thaliana PP2C protein which has been isolated as the retrieval sequence. The results showed that 45 PP2C-like protein were identified from Populus trichocarpa. Further, we also analyzed the sequence alignment, MEME, EST and phylogenetic.Keywords: Populus trichocarpa comparative genomics genne family真核生物基因组中，编码蛋白磷脂酶的基因远远少于蛋白激酶，一般只有蛋白激酶基因数的四分之一至三分之一。
在过去的研究中，蛋白质可逆磷酸化研究的重点主要针对蛋白激酶，不过，现在越来越多的研究显示，在信号转导中，蛋白磷酸酶和蛋白激酶同样重要[1]。
根据底物蛋白分子上去磷酸化的氨基酸残基的种类，PP主要分为三个家族：酪氨酸蛋白磷酸酶（protein tyrosine phosphatases, PTPs）、丝氨酸蛋白磷酸酶（protein serine phosphatases, PPPs）和双特异性蛋白磷酸酶（dual specificity phosphatases, PSPs）。
根据酶对底物选择的特异性和对抑制剂的敏感程度，PPPs分为PP1和PP2。
根据亚基的结构、二价离子的依赖性和底物特异性，PP2又可进一步分为PP2A、PP2B和PP2C[2]。
大量研究表明，PP2A在进化过程中，高度保守且广泛表达。
PP2B是由催化亚基A和调节亚基B构成的二聚体，也是唯一受Ca2+／CaM调节的丝氨酸蛋白磷酸酶，在介导Ca2+信号到细胞应答中发挥了重要作用。
在所有PSPs的亚类中，只有PP2C没有调控亚基，是一种单体蛋白磷酸酶，活性依赖于Mg2+或Mn2+[4]。
PP2C与其他类型的PPP类蛋白磷酸酶相比,没有较明显的氨基酸序列同源性，但是蛋白质三维结构的相似性却揭示这些蛋白磷酸酶可能拥有相似的催化机制或相同的催化底物。
PP2C类蛋白磷酸酶的一个重要的结构特征是在其催化区域内含有11个保守的结构亚区[3]。
与哺乳动物PP2Cs相比，植物PP2Cs具有独特的结构模式，即植物中多数PP2C类磷酸酶C端具有保守的催化区域，而N端却是保守性不强、长度不一的延伸区域，在这些延伸区域内，含有与胞内信号相关的序列包括跨膜区域和激酶互作区域等，从而赋予了PP2C 不同的功能[1]。
蛋白磷酸酶结构的复杂性是功能广泛性的基础。
随着植物中越来越多的蛋白磷酸酶基因及其相关蛋白的分离、纯化与鉴定，以及基因特性与生理生化的深入研究，其众多的功能也陆续的被确定。
迄今为止，蛋白磷酸酶已经被证实与植物的生长发育、信号转导、细胞周期、渗透胁迫以及活性氧胁迫等各种抗逆性反应相关联。
如今，毛果杨的全基因组测序已经完成，数据库Populus trichocarpa v1.1(/Poptrl_1/Poptrl_1.home.html)公布了全部序列。
此后，在第一测序的基础上，进行了第二次补充测序。
毛果杨全基因组最新数据已经包含在数据库Phytozome v7.0(/poplar)。
本实验运用生物信息学方法对毛果杨的PP2C基因家族进行了初步分析鉴定[5]。
1 材料与方法1.1数据库的搜索根据拟南芥只已分离出的PP2C基因及其编码的蛋白质序列，在NCBI（美国国立生物技术信息中心，National Center for Biotechnology Information, /）中通过blastp检索毛果杨无荣誉蛋白质数据库，E≤10-26的序列被认为是候选蛋白。
利用Blastn 程序将获得的候选蛋白与拟南芥的PP2C基因作进一步的匹配，采用默认参数，取E≤10-10的击中项为最终的候选蛋白，由相应的程序和索引文件提取所有符合条件的蛋白序列，构建列表。
最后，从相应的数据库中下载最终确认的候选蛋白所对应的CDS序列[5]。
1.2序列联配分析与系统发生树的构建利用Clustal W软件对搜索到的蛋白质序列进行多序列联配分析。
以序列联配结果为基础，用MEGA3.1软件生成毛果杨PP2C蛋白的系统发生树。
进化树的生成采用邻接法（Neighbor-joining method)。
具体参数设置Test of Phylogeny: Bootstrap method; Replications: 1000; Method: Poisson model; Gaps: Pairwise deletion; Rates among Sites: Uniform rates。
其它为默认参数[7]。
1.3 PP2C的motif分析毛果杨PP2C类型基因的预测motif分析通过MEME （/meme/cgi-bin/meme.cgi）在线分析[14]。
1.4 PP2C的EST分析毛果杨PP2C基因家族的EST分析是通过NCBI，在Expressed sequence tags(EST)数据库中进行核苷酸比对，统计比对结果的组织类型的信息，进而与预测每个基因在不同组织类型中的表达情况。
2 结果与分析2.1 毛果杨PP2C的挖掘根据拟南芥PP2C基因编码的蛋白质检索出毛果杨PP2C基因家族蛋白，之后去冗余共得到45条毛果杨候选PP2C氨基酸序列，都具有PP2C保守区域。
从表可知，毛果杨的PP2C 基因分布于第1至18号染色体上，除四号染色体上无表达基因外，其余都有所表达。
从基因结构看，毛果杨内含子数目在2-10之间变化，并不包含没有内含子的基因，说明植物的PP2C基因，进化过程中没有发生内含子的插入和缺失事件。
详细信息如表1所示。
表1 毛果杨的PP2C候选蛋白及匹配EST的数量Table 1 The PP2C candidate proteins and the hits number of EST in Populus trichocarpa基因Gene 位点Locus蛋白质长度（aa）Protein length(aa)染色体Chromosome匹配EST数量The hits number of EST内含子IntronPPTP2C-1 EEF02439 397 LGX 119 3 PTPP2C-2 EEE88105 385 LGIX 118 4 PTPP2C-3 EEE84651 392 LGI 0 3 PTPP2C-4 ERP66114 411 LGI 0 3 PTPP2C-5 EEF05571 334 LGXV 122 3 PTPP2C-6 EEE96607 370 LGXII 120 2 PTPP2C-7 EEE79084 546 LGIII 147 3 PTPP2C-8 ERP66113 302 LGI 0 3 PTPP2C-9 EEE93007 548 LGVI 120 2 PTPP2C-10 EEF03306 551 LGXVIII 109 3 PTPP2C-11 EEE82783 388 LGI 0 3 PTPP2C-12 ERP49654 578 LGXVIII 109 3 PTPP2C-13 ERP59565 229 LGVI 120 2 PTPP2C-14 EEF05989 289 LGXV 122 3 PTPP2C-15 ERP52444 305 LGXV 122 3 PTPP2C-16 EEE97078 286 LGXII 120 2 PTPP2C-17 EEF05572 351 LGXV 122 8 PTPP2C-18 EEE96604 355 LGXII 120 8 PTPP2C-19 EEE94467 276 LGV 144 7 PTPP2C-20 ERP61405 273 LGV 144 7 PTPP2C-21 EEF02923 292 LGXVIII 109 8 PTPP2C-22 EEE92243 292 LGVI 120 8PTPP2C-23 ERP49572 262 LGXVIII 109 8 PTPP2C-24 EEE83289 392 LGI 0 3 PTPP2C-25 ERP54886 255 LGXII 120 2 PTPP2C-26 EEE87942 416 LGIX 118 3 PTPP2C-27 EEF02373 389 LGX 119 3 PTPP2C-28 EEF01832 397 LGX 119 5 PTPP2C-29 ERP65062 359 LGI 0 10 PTPP2C-30 EEE99269 397 LGXIV 131 3 PTPP2C-31 EEE97500 282 LGXI 159 4 PTPP2C-32 EEE88603 380 LGVIII 126 3 PTPP2C-33 ERP51920 284 LGXV 122 8 PTPP2C-34 ERP50526 313 LGXVII 189 4 PTPP2C-35 EEE79713 359 LGIII 147 10 PTPP2C-36 EEE92161 382 LGVI 120 3 PTPP2C-37 EEF04978 661 LGXVI 139 11 PTPP2C-38 EEF02837 380 LGXVIII 109 3 PTPP2C-39 EEF03484 358 LGXVIII 109 10 PTPP2C-40 EEE93202 358 LGVI 109 10 PTPP2C-41 EEE94216 381 LGV 144 3 PTPP2C-42 ERP53974 446 LGXIII 130 4 PTPP2C-43 EEE80809 389 LGII 112 3 PTPP2C-44 EEF03734 338 LGXVIII 109 4 PTPP2C-45 ERP58376 384 LGVII 117 4 注：毛果杨染色体构成LG_2.2 毛果杨PP2C蛋白的系统发生分析为了对毛果杨PP2C蛋白的功能和特性作进一步的了解，本实验对预测的毛果杨45个PP2C基因与已经鉴定出的拟南芥的所有蛋白序列的进化关系进行了评估。