BRAF基因与甲状腺乳头状癌的相关性研究

BRAF基因与甲状腺乳头状癌的相关性研究作者：王玉林巴颖
来源：《医学信息》2014年第18期
摘要：目的探究BRAF基因及其突变与甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)患者相关参数之间的关系。

方法应用免疫组化、PCR及基因测序技术对92例PTC患者，10例非PTC甲状腺恶性肿瘤患者、59例结节性甲状腺肿患者的新鲜标本进行BRAF蛋白表达情况、BRAF基因突变情况进行检测。

分析BRAF基因突变与患者年龄、性别、肿瘤直径、有无颈淋巴结转移、有无包膜、超声征象等临床病理学特征的关系。

结果 92例PTC中30例检出BRAF突变基因，而在对照组中未发现相应突变。

BRAF基因突变与PTC甲状腺肿瘤直径相关性显著，与性别、发病年龄、有无淋巴结转移等无关。

结论 BRAF基因突变与肿瘤直径大小相关性显著，突变可能影响PTC患者远期预后。

关键词：甲状腺乳头状癌；BRAF基因突变预后
甲状腺癌是最常见的内分泌腺恶性肿瘤，并且其近年的发病率呈现上升趋势，无论是全球范围还是在国内[1]，正逐渐引起研究者的重视。

根据肿瘤切除术后的病理结果，我们可以将其分为4个类型：乳头状腺癌、滤泡癌、髓样癌、未分化癌。

其中以甲状腺乳头状癌
( papillarythyroidcarcinoma，PTC) 的发病率最高，占所有甲状腺恶性肿瘤的80%[2]。

鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体基因（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1, BRAF），位于
7q23染色体，是RAF基因家族的成员之一。

其编码一个由783个氨基酸组成的蛋白，是一种特异性丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞通路RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK中，起到激活MEK/ERK 的重要作用，控制细胞的增殖、分化、凋亡等进程[3]。

BRAF基因外显子15如果出现单核苷酸突变（T1799A），则其相应的产物蛋白中，谷氨酸取代对应的缬氨酸（V600E），使蛋白成为活化蛋白激酶，激活下游有丝分裂信号，形成肿瘤[4]。

经过近几年的研究，人们发现PTC中存在高频率的BRAF突变，并且这种突变与PTC的病因、临床表现、肿瘤细胞生物学行为、病理诊断、治疗策略的选择、近远期预后等方面都具有明显的相关性[5]。

本文对本院今年来的PTC患者进行BRAF基因突变检测，并就上述问题进行分析研究，以期对临床治疗具有指导意义。

1资料与方法
1.1一般资料实验组：选取2011年1月~2013年6月在本院临床考虑为甲状腺乳头状癌，且行手术切除，并经病理科确诊患者92例。

见表1。

对照组1：选取2011年1月~2013年6月就诊于本院的患者，具体为7例滤泡癌、2例髓样癌、1例未分化癌。

对照组2：同时期于本院诊断为结节性甲状腺肿的患者59例。

两组对照组的性别构成、年龄构成与实验组无统计学差异。

以上患者诊断皆由本院基本外科甲状腺组教授予临床诊断，由本院病理科教授按WHO标准进行病理诊断。

1.2标本处理手术切除肿瘤组织后30min内，由病理科医生从标本肿瘤部位切取肿瘤组织（正常组的标本取自结节性甲状腺肿患者切除肿物周边的正常组织），取大部组织进行石蜡包埋切片，完成病理诊断、免疫组化检测，取部分组织（约0.5×0.5×0.5cm）用于突变基因检测（详见后文），剩余组织用液氮封存于标本管中。

1.3试剂实验采用鼠抗人单克隆抗体（克隆号：EPl52Y，购于福建迈新生物有限公司）作为BRAF抗体；免疫组化试剂盒购自上海研谨生物科技有限公司；PCR反应所用试剂购自北京索莱宝科技有限公司；检测BRAF基因突变所需使用的DNA抽提试剂盒购自北京博凌科为生物科技有限公司。

1.4实验方法
1.4.1免疫组化采用SABC法，利用PBS代替一抗为阴性对照，采用明确BRAF阳性的大肠癌切片为阳性对照。

步骤如下：取4μm厚切片，常规方法脱蜡，加入柠檬酸溶液后煮沸10 min，放至室温，加入3％H2O2甲醇液以失活内源性过氧化物酶，加入BRAF抗体，室温静置5h后用PBS洗涤2次，加入二抗，室温静置2h后用PBS洗涤2次，使用DAB显色，使用苏木精复染，脱水后使用二甲苯透明、使用中性树胶封固。

结果判断：显微镜下观察细胞核颜色为棕黄色者即提示BRAF蛋白阳性。

依次阅读每一张切片，随机观察10个视野，阳性肿瘤细胞占全体肿瘤细胞总数的百分比≥10%为阳性，反之即为阴性。

1.4.2基因突变的检测①DNA的提取：取前文所述标本，根据DNA抽提试剂盒所述步骤，提取DNA于-20℃冰箱保存；②PCR扩增目标片段：引物源自华大基因公司，正向引物
5'-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3'，反向引物5'-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3'，扩增后目标片段长度为218bp；PCR反应体系为：总体积50μL，其中dNTP（5mmol/L）
6μL、DNA聚合酶（10U/μL）0.4μL、模板DNA 3μL、正反引物(15μmol/L)各1.0μL、扩增缓冲液(10×)5μL、双蒸水33.6μL；反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，59℃退火30s，70℃延伸45s，进行40个循环后72℃延伸20min后结束；③电泳检测：取步骤②所得PCR产物7.0μL，加入缓冲液1.0μL混合，以DNA标记物1.0μL作为对照，在2％琼脂凝胶中进行电泳，并用EB染色；④PCR产物测序：由华大基因测序。

1.5统计学分析采用SPSS19.0软件，对实验所得数据进行χ2检验。

2结果
2.1 BRAF蛋白表达情况实验组中，共92例确诊PTC患者,其中BRAF蛋白表达阳性者为68例，占比7
3.9%。

其中：男性20例阳性（阳性率7
4.1%），女性48例阳性（阳性率
73.8%）,差异不显著；≤55岁者22例阳性（阳性率91.7%），＞55岁者46例阳性（阳性率67.6%）,差异具有显著性；肿瘤直径≤5mm者有23例阳性（阳性率54.8%），肿瘤直径＞5mm 者45例阳性（阳性率90.0%）,差异显著；出现淋巴转移者47例阳性（阳性率80.0%），未出现淋巴转移者12例阳性（阳性率63.6%）,差异不显著；出现点状钙化者19例阳性（阳性率70.4%），未出现点状钙化者49例阳性（阳性率75.4%）,差异不显著；有包膜者15例阳性（阳性率68.2%），无包膜者53例阳性（阳性率75.7%）,差异不显著。

见表1。

对照组中仅有1例滤泡癌患者出现BRAF蛋白阳性表达(阳性率14.3%)，其余所有对照均阴性表达。

2.2 BRAF基因T1799A突变实验组中，共有92例确诊PTC患者，其中BRAF基因突变者为30例，突变阳性率32.6%。

进一步分析突变基因碱基改变，为第1799位点的胸腺嘧啶被腺嘌呤所取代，即T1799A（图1）；从蛋白表达角度考虑，所有突变者均阳性表达BRAF蛋白。

具体分析：男性8例发生突变（突变率29.6%），女性22例发生突变（突变率3
3.8%）,
差异不显著；≤55岁者6例发生突变（突变率25.0%），＞55岁者24例发生突变（突变率35.3%）,差异不显著；肿瘤直径≤5mm者有7例发生突变（突变率16.7%），肿瘤直径＞5mm 者23例发生突变（突变率46.0%）,差异显著；出现淋巴转移者20例发生突变（突变率
33.9%），未出现淋巴转移者10例发生突变（突变率30.3%）,差异不显著；出现点状钙化者11例发生突变（突变率40.7%），未出现点状钙化者19例发生突变（突变率29.2%）,差异不显著；有包膜者9例发生突变（突变率40.9%），无包膜者21例发生突变（突变率30.0%）,
差异不显著。

见表1。

对照组中所有病例均未检测出突变。

图1PTC基因测序
3讨论
2002年，研究者第一次在恶性黑色素瘤中发现了BRAF基因的突变[6]，其后，BRAF基
因突变被多次发现于不同的肿瘤组织内，而其在PTC中的阳性率仅次于恶性黑色素瘤，文献[6]报道其突变率可达30%～83%。

这种突变的出现具有一定的特异性，即其他甲状腺恶性肿瘤中极少检测到BRAF基因的突变。

从本次实验得到的PTC组BRAF基因的突变率为32.6%，与
已有的文献报道是相符合的。

作为甲状腺恶性肿瘤中发病率最高的那种，PTC的预后也是其中最好的，特别是得益于近年甲状腺超声技术的发展和应用，大部分患者都能在较早期得到诊断和治疗，通过手术结合131 I放射治疗可以取得非常好的疗效，但遗憾的是，仍然有部分患者会出现复发，甚至远处
转移等情况。

因此，为了更好地判断PTC患者的远期预后，就极有必要去研究患者年龄、性别、肿瘤直径、有无颈淋巴结转移、有无包膜、超声征象等等影响其远期预后的因素[7]。

和
远处转移，BRAF基因正式研究这些因素的一把钥匙。

综合BRAF蛋白表达、BRAF基因突变
的结果，我们认为肿瘤直径与BRAF基因的相关性较为显著，肿瘤直径≤5mm者有7例发生突变（突变率16.7%），肿瘤直径＞5mm者23例发生突变（突变率46.0%）,肿瘤直径大者BRAF基因的突变率明显较高，在统计学上差异显著。

此外，本研究也探讨了BRAF蛋白在PTC患者中得情况。

从结果来看，PTC患者BRAF 蛋白的表达率为73.9%。

结合其在余下甲状腺恶性肿瘤中得表达率（仅滤泡癌中有14.3%，其余未见表达），可以认为BRAF蛋白在甲状腺肿瘤的病理诊断方面具有潜在应用价值。

参考文献：
[1]XingM．Prognosticutilityof BRAF mutation in papillary thyroid cancer［J］.Mol Cell Endocrinol，2010，321(1): 86－93
[2]HundahlSA,FlemingID,Fremgen AM.A national cance data base report on 53 856 cases of thyroid carcinoma treated in the U.S,1985-1995.
[3]PeyssonnauxC,Eychene A.The RAF/MEK/ERK pathway:new concepts of activation.
[4]周庚寅，白艳花，觉道健一．甲状腺乳头状癌的病理诊断及遗传学特点[J].临床与实验病理学杂志，2010，26(2):131－138.
[5]陈士超，何春年．用于甲状腺肿瘤鉴别诊断的相关分子标记物[J].临床与实验病理学杂志，2007，23(3):350－353.
[6]Davies H;BignellGR;Cox C Mutations of the BRAF gene in human cancer
[7]Kim SK,SongKH,Lim SD.Clinical and pathological features and the BRAF(V600E) mutation in patients with papillary thyroid carcinorna with and withoutconcurrent Hashimoto thyroiditis
编辑/哈涛。