色谱分离技术
第七章 色谱分离技术
④ 设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件， 因而不容易使物质变性，特别适于不稳定的大分子 有机化合物。
缺点： 处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此 主要用于实验室，工业生产上应用较少。
3.色谱法的分类 吸附色谱法
分配色谱法
分离机理
离子交换色谱法 凝胶色谱法
亲和色谱法
（一）基本原理
溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表 面时，分子会贴在固体表面上，发生吸附作用。
1.发生吸附作用的原理：
固体表面分子（或原子）与固体内部分子（或原子） 所处的状态不同：
固体内部分子（或原子）受临近四周分子的作用力是 对称的，作用力总和为零，即彼此互相抵消，故分子处 于平衡状态。
界面上的分子所受的力不对称，作用力总和不等于零， 合力指向固体内部。
小分子
（二）凝胶过滤介质
基本要求：
不能与原料组分发生除排阻之外的任何其他相 互作用，如电荷作用、化学作用、生物学作用
高物理强度、高化学稳定性 耐高温高压、耐强酸强碱 高化学惰性 内孔径分布范围窄 颗粒大小均一度高
常用的凝胶过滤介质 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
1. 葡聚糖凝胶
pH、缓冲液浓度、离子强度
③ 柱操作 柱的大小、长短 ④ 流速的控制 高速度、高效率 ⑤ 清洗 除去不结合的所有物质 ⑥ 洗脱 特异性洗脱（竞争性置换目的物） ⑦ 柱的再非生特异性洗脱（调节pH、离子强度和种类、温度）
（五）亲和色谱法的应用
1.亲和色谱法的特点： 专一、高效、简便、快速
2.应用 ① 分离和纯化各种生物分子 纯化生物大分子，适于从组织或发酵液中分离
色谱法应运而生。
色谱分离是一组相关技术的总称，又叫做色 谱法、层析法，是一种高效而有用的生物分离 技术。
色谱分离技术
二、离子交换树脂的性能 1. 交联度（degree of cross linking）： 离子交换 交联度（ ）： 树脂上胶联剂的含量称为交联度。 树脂上胶联剂的含量称为交联度。交联度用重量百分 比表示， 标号树脂， 比表示，如“×4”标号树脂，其交联度为 标号树脂 其交联度为4%。应根据 。 试样性质进行选择。 试样性质进行选择。 2.交换容量：每千克干树脂能参加交换反应的活 交换容量： 交换容量 性基团数， 表示。 性基团数，用mmol/g or mmol/ml表示。 表示 粒度：离子交换树脂颗粒的大小， 粒度：离子交换树脂颗粒的大小，用树脂溶胀态 所能通过的筛孔数表示。 所能通过的筛孔数表示。 三、流动相 离子交换色谱流动相最常用的是水缓冲液。 离子交换色谱流动相最常用的是水缓冲液。有酸 性缓冲溶液和碱性缓冲液，有时也用有机溶剂（甲醇、 性缓冲溶液和碱性缓冲液，有时也用有机溶剂（甲醇、 乙醇）同水缓冲液混合使用。流动相的pH， 乙醇）同水缓冲液混合使用。流动相的 ，缓冲液的 类型，离子强度， 类型，离子强度，以及加入的有机溶剂都会影响组分 的分离。 的分离。
二、纸色谱法 （一）基本原理 纸色谱法是用滤纸作载体的平面色谱法。 纸色谱法是用滤纸作载体的平面色谱法 。 固定相 为纸纤维吸附的水或吸留的甲醇胺、缓冲液等。 为纸纤维吸附的水或吸留的甲醇胺 、 缓冲液等 。 流动 相为与水不相混溶的有机溶剂。 相为与水不相混溶的有机溶剂 。 因为吸附在纤维上 20%的水分中，有约 的水分中， 的水分中 有约6%可通过氢键与纸纤维素上的羟 可通过氢键与纸纤维素上的羟 基结合生成复合物，与亲水性溶剂可形成两相。 基结合生成复合物 ， 与亲水性溶剂可形成两相 。 纸色 谱法属分配色谱， 谱法属分配色谱 ， 是利用样品组分在两相间分配系数 的不同达到分离的目的。实际上，纸色谱的分离机制 的不同达到分离的目的。 实际上， 较复杂，除分配外， 较复杂 ， 除分配外 ， 可能还有溶质与纸纤维素间的吸 附作用，与纸纤维素上某些基团（ 附作用 ， 与纸纤维素上某些基团 （ 造纸时引入到纤维 素上的）之间的离子交换作用。 素上的）之间的离子交换作用。
第7章 色谱分离技术
2. 按树脂骨架的物理结构
(1) 凝胶型树脂 (2) 大网格树脂 (3) 均孔树脂
3. 按活性基团分类
1) 阳离子交换树脂 活性基团为酸性， 对阳离子具有交换能力。
(1) 强酸性阳离子交换树脂
超临界流体色谱—流动相是在接近它 的临界温度和压力下工作的液体
三、色谱法的分类
根据固定相的附着方式分类 —固定相装在圆柱管中—柱色谱 —液体固定相涂在纸上—纸色谱(平板色谱)
—固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄层色谱
三、色谱法的分类
按分离机理不同，可分为： 吸附色谱法 分配色谱法 离子交换色谱法 凝胶色谱法 亲和色谱法
第7章 色谱分离技术
一、色谱分离技术的概念 色谱（chromatography）分离技术是 一类分离方法的总称，又称色谱法、层析法、 层离法等。它是利用不同组分在固定相和流 动相中的物理化学性质的差别，使各组分在 两相中以不同的速率移动而进一步分离的技 术。
二、色谱分离系统的组成
在色谱法中，表面积较大的固体或附着 在固体上且不运动的液体，静止不动的 一相（称为固定相 ；自上而下运动的一 相（一般是气体或液体）称为流动相 。
展开剂
常用溶剂极性次序为：己烷<环己烷<四 氯化碳<甲苯<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯< 丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<水<冰醋酸
（2）柱色谱的吸附剂与洗脱剂
吸附剂的选择
一般地说，所选的吸附剂应有最大的比 表面积和足够的吸附能力，它对欲分离 的不同物质应该有不同的解吸能力；与 洗脱剂、溶剂及样品组分不会发生化学 反应；还要求所选的吸附剂颗粒均匀， 在操作过程中不会破裂。
生化分离工程4.色谱分离
Willstätter的观点，即过分强调制备工作，也反映出 当时有机化学家的一种普遍态度。因此，茨维特的
吸附作用力可以是物理吸附作用，也可以是化 学吸附作用。物理吸附的特点是选择性低，吸 附速度较快，吸附过程可逆；化学吸附的特点 是有一定选择性，吸附速度较慢，不易解吸。 物理吸附和化学吸附可以同时发生，在一定条 件下也可以互相转化。
吸附色谱是各种色谱分离技术中应用最早的 一类，传统的吸附色谱以各种无机材料为吸 附剂。
凝胶色谱分为两大类：凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography，GFC）和凝胶渗透 色谱（gel permeation chromatography， GPC） 。
பைடு நூலகம்
电色谱
电色谱（electrochromatography）是电泳和液 相色谱的融合技术。所谓电色谱是采用电渗流 来推动流动相，使得峰扩展只与溶质扩散系数 有关，因而使电色谱的理论塔板数远远高于液 相色谱。同时由于引入了高效液相色谱的固定 相，使电色谱具备了高效液相色谱固定相所具 有的选择性，使它不仅能分离带电物质。也能 分离中性化合物。
1935年，Adams和Holmes 合成了离子交换树 脂，并用于色谱分离，从而诞生了离子交换色 谱法。
1941年A. J. P. Martin和R. L. M. Synge发明了 分配色谱法（partition chromatography）。 1952年获诺贝尔化学奖。
色谱分离技术及其应用
色谱分离技术及其应用色谱分离技术是指利用固定相和流动相间的相互作用，在物质混合物中将各种组分分离开的技术。
色谱分离技术已成为分离、检测和分析生物、化学和环境样品中物质的重要工具。
色谱分离技术的基本原理是将混合物分离成若干性质相近或相同，但成分不同的组分。
这是通过固定相和流动相的相互作用来实现的。
在固定相和流动相的相互作用中，固定相可以是一种具有表面活性、具有亲疏水性、或化学亲和作用的材料。
而流动相则可以是一种液体或气体，它们可以通过了固定相，使得混合物中的组分在固定相上吸附或溶解，从而实现各组分的分离。
色谱分离技术在生物、化学和环境科学等领域应用广泛。
例如，在生物学和医学中，在基因显微分析、捕获蛋白质、酶和细胞的单细胞检测中，广泛采用了色谱分离技术。
此外，还可以用于药物筛选、质量控制和制造的过程控制。
在环境领域，色谱分离技术可用于寻找化学毒物和环境污染物，并对环境废物进行检测和处理。
高效液相色谱（HPLC）是最常用的色谱分离技术之一，它可以处理各种类型的混合物，并对具有取向和激发导向性分子进行分离。
在HPLC分离中，利用固定相与流动相间的相互作用来移动样品混合物。
固定相一般是一种高度纯化的压缩载体，使得各个样品成分分离时可以得到更高的纯度。
而流动相一般应适合所需要分离的物质类型。
在汽相色谱（GC）中，气相与液相的相互作用，使得分子在流动相中具有更高的活性和协同性。
此外，它还可以用于食品质量检测中。
例如，气相色谱技术常用于检测食品中的农药、有机物和污染物。
而在高效液相色谱技术中，可以利用蛋白质和植物次生物质进行分离，用于食品中的物质鉴定和质量评估。
总之，色谱分离技术已成为一个广泛应用的分析和分离技术。
随着科技的不断进步，色谱分离技术将更好地应用于各个领域的分析和分离中，为人类的健康和环境保证做出重要贡献。
色谱分离技术
▪ 色谱分离技术概述 色谱技术的基本概念 色谱技术的理论基础 色谱法的分类 色谱技术的操作方法
▪ 吸附色谱法 ▪ 分配色谱法 ▪ 亲和色谱法
第一节 色谱分离技术概要
色谱技术的起源: ▪ 1903年Tswett首创 ▪ 叶绿素的石油醚溶液通过碳酸钙管柱,
并继续以石油醚淋洗,由于碳酸钙对叶 绿素中各种色素的吸附能力不同,色素 被逐渐分离,在管柱中出现了不同颜色 的谱带。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
色谱技术的发展
分离对象： 不限于有色物质
色谱柱： 材料：玻璃、不锈钢、聚四氟乙烯
形状：直形、U形、螺旋形
二维平面形（纸、薄层色谱）
冲洗剂： 液体、气体
填料：
近千种 固体、液体
检测：
眼睛、各种检测器
操作：
手工 全自动 联用技术
气相色谱（1952年）
1-载气钢瓶； 2-减压阀；
3-净化干燥管；
4-针形阀；
▪ 加入洗脱剂使各组分分层的操作称为展开。 ▪ 洗脱时从柱中流出的液体称为洗脱液。 ▪ 展开后各组分的分布情况称为色谱图。 ▪ 将样品加到柱上的操作称为上样或加样。
A+B+C
信 号
ACB C B A
C
B
C
A
B
C
A
B
C
图11-1 色谱洗脱过程与色谱图
t，min
（一）固定相 ▪ 可以是固体物质（吸附剂，凝胶，离子交换剂），也可以
（三）分配系数，分配比和选择因子
▪ 1、分配系数：在一定条件下，某种组分在固定相和流 动相中含量（浓度）的比值。它是色谱中分离纯化物质 的主要依据。langmuir
▪ 无论色谱分离的机理如何，当溶质浓度较低时，固定相 浓度和流动相浓度成线性的平衡关系。
中药化学2.2 色谱分离技术
聚酰胺吸附力的影响因素： 1:形成氢键的能力与溶剂有关 水中＞有机溶剂中＞碱性溶剂中 常用溶剂对聚酰胺洗脱能力顺序如下： 水＜甲醇或乙醇＜丙酮＜稀氢氧化钠液或稀氨溶 液＜甲酰胺或二甲基甲酰胺＜尿素水溶液。
注意温度超过150 ℃则游离硅醇基之间脱 水形成硅氧醚结构丧失游离硅醇基的吸附能力。 为酸性吸附剂适于分离中性或酸性成分。
常用硅胶：
硅胶H（不含黏合剂） 硅胶G（含黏合剂） 硅胶GF254(含煅石膏，另含有一种无机荧 光剂)。硅胶GF254nm紫外光下呈强烈黄绿色 荧光背景，在荧光背景下通过紫外光照射成分 斑点为暗斑，常用于一般显色手段不易显色的 成分的分离。
3、 洗脱：
洗脱操作的目的是要将加入的样品中各个 组分先后从上往下带出来，并能分开收集各成 分。 洗脱的过程中，上端溶剂不能干，分段收 集是关键；作定性检查合并相同成分。 TLC时Rf为0.2－0.3的溶剂系统是最佳的 洗脱系统，梯度洗脱。
4. 应用 柱色谱分离能力比薄层分离能力更强， 效果更好，尤其对结构相似、性质接近、 采用薄层难以分离的成分分离效果好。
（一）吸附剂
4、常用的吸附剂
（1）硅胶SiO2•xH2O 多孔性的硅氧烷交链结构，极性吸附剂， 吸附性较氧化铝稍低，既适于分离亲水性成分， 又可用于分离亲脂性成分。 其吸附作用的强弱取决于游离硅醇基的数 目，也与含水量有关，含水量达17％以上，则 失去吸附性，所以需110℃活化30分钟。
（一）吸附剂
例：求图中A、B、C三斑点Rf大小并判断三成分 极性大小顺序。
色谱分离的技术
7.1.2.2 按固定相形状不同分类
(1)柱色谱
进样量大，回收容易。 除用于分析外，还广泛用于生物样品 的制备和工业生物产品的分离与纯化。
(2)纸上色谱 广泛用于定性与定量分析，不用于制备和生产。
(3)薄层色谱
主要用于分析，也可用于小量样品的制备。
7.1.2.3 其他分类方法
(1) 根据流动相的物态分类 气相色谱 、液相色谱和超临界色谱
Ve Vo K d Vi
或
(7-29) (7-30)
Ve Vo Kd Vi
Kd＝1，溶质分子完全不被排阻， 可自由进入所有凝胶颗粒微孔。 Kd＝0，溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒微孔之外，最先被洗脱。 对于中等分子，能进入部分凝胶空间，0＜Kd＜1。 当具有不同分子量物质的混合液流经凝胶柱时，其Kd值的大小就 决定了物质的流出顺序，即Kd值小的先流出，Kd值大的后流出。
7.1.4.2 吸附色谱
吸附色谱分离就是根据吸附剂(固定相)对不同物质的吸 附力不同而使混合物分离的。
离子交换色谱和亲和色谱也可归类于吸附色谱，前者主要 是静电引力的作用，而后者是生物专一亲和力的作用。
在一定温度下，分离物质在液相和固相中的浓度关系可用吸附 方程式来表示：
Ka A B A B Kd
极高的分辨率;
1944年 出现纸层析;
色谱分离技术
色谱分离技术色谱分离技术是一种非常有用的分离技术，它可以用来分离和测定各种化学物质和生物物质的构成成分。
这种技术的应用非常广泛，在分析科学、医药、食品和环境科学等多个领域都有重要的应用价值。
色谱是一种将一种物质分离成一个或几个组份的分离技术。
它是一种以溶剂混合物为分析对象的分离技术，分析动力学模型中，将一个复杂混合物分开成单一成分，或者将从同一样品收集到的多个成份分离开来，以便进行更详细的分析。
一般来说，色谱技术分为液相色谱、气相色谱和固相色谱三大类。
液相色谱（LC）是一种将混合物分离成单个部分的分离技术，它的分离原理是将混合物在某一特定流动相系统中进行分离，使混合化合物进入不同的体积比空间，从而实现分离。
一般情况下，使用液相色谱来分离复合物，并在高效液相色谱系统中加以鉴定。
它主要应用于复杂混合物的分离和分析，以得到单价结构或复杂组成物质。
气相色谱技术（GC）是一种利用混合物中不同物质之间比较大的分子质量来分离分析它们的技术。
分析时，气相混合物的各组分被溶解在柱的吸附剂中，在充满气体的情况下，根据其分子质量的大小，其分子在柱内移动的速度也不同，从而实现分离。
一般而言，气相色谱技术是极具灵敏性的，而且可以在较短的时间内获得较高的精度，因此，它在可控性和灵敏性等方面都明显优于其它技术。
最后是固相色谱技术（SPE），它也是一种分离技术，该技术主要用于纯化复杂混合物，它的操作步骤是将混合化合物放置在一种特殊的吸附剂上，利用温度的变化和物理因素，从而使其分离出单一的化合物。
与液相和气相色谱相比，固相色谱技术具有较高的纯度和较低的成本，而且该技术可以用于分离、测定、调节和表征诸如碳水化合物、蛋白质、核酸、有机酸和其他有机物等复杂物质。
色谱分离技术是当今分析科学领域中一种重要的技术，其应用非常广泛，可用于各种化学和生物物质的分离和测定。
液相、气相和固相色谱技术在很多领域都发挥了重要作用，为医药、食品、环境等领域的研究提供了强大的技术支持。
中药化学 第五章 色谱分离技术-吸附色谱、聚酰胺
（二）吸附柱色谱操作技术
操作步骤
色谱柱的选择 内径与柱长比：1：10～1：20
装柱 上样 洗脱检查
1、装柱
干法装柱：直接用小漏斗将吸附剂均匀装入柱内的方法。 湿法装柱：将吸附剂装入盛有洗脱液的柱内，或将吸附剂 与洗脱液混合成混悬液再装入柱中，吸附剂慢慢沉降。
二、吸附色谱基本构成要素
吸附剂（固定相） 展开剂（流动相、移动相） 被分离的成分
（一）吸附剂
1、基本要求 一般来说，吸附剂要有较大的表面积和适宜
的活性，与移动相溶剂及被分离各成分不起化学 反应、颗粒均匀，并且在所用各种溶剂中不溶解。
2、种类 极性吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺、氧化镁、 硅酸镁、碳酸钙和硅藻土等。 非极性吸附剂：活性炭
2、种类 亲脂性有机溶剂：石油醚、环己烷、四氯化碳、苯、 甲苯、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等。 亲水性有机溶剂：丙酮、乙醇、甲醇等。 极性吸附能力的大小与选择展开剂的极性 和被分离成分的极性大小有关。
一般来说，当选用常用的硅胶或氧化铝这类极性 吸附剂时，展开剂的极性越大，解吸附能力越强， 否则越弱。
色谱分离技术按色谱原理分吸附色谱分配色谱离子交换色谱凝胶色谱色谱分离技术按操作形式分平面色谱tlcpc柱色谱毛细管电泳色谱色谱分离技术按流动相分液相色谱hplc气相色谱gc超临界流体色谱sfc二分类由于色谱法具有强大的分离能力众多的分离模式和灵活的检测手段因而被广泛用于化工医药生化和环境保护等领域尤其对中药化学成分的分离精制定性和定量检测等方面行之有效
影响聚酰胺吸附能力的主要因素如下：
1. 形成氢键的能力与溶剂有关。一般聚酰胺在水中 与化合物形成氢键的能力最强，在有机溶剂中较弱， 在碱性溶剂中最弱。因此溶剂对聚酰胺的洗脱能力 的次序为： 水〈甲醇或乙醇〈丙酮〈稀氢氧化钠溶液或稀氨水 〈甲酰胺或二甲基甲酰胺。
《色谱分离法》课件
按分离机制分类
吸附色谱法
利用固体吸附剂对不同组分的 吸附能力差异进行分离。
分配色谱法
利用固定相和流动相之间的分 配平衡实现分离。
离子交换色谱法
利用离子交换剂对不同离子的 亲和力差异进行分离。
空间排阻色谱法
利用凝胶的分子筛效应，根据 分子大小进行分离。
03 色谱分离法的操作流程
CHAPTER
样品前处理
度法、荧光光谱法等。
检测灵敏度设置
根据待分离物质的浓度设置合适 的检测灵敏度，以提高检测准确
性。
收集结果
根据检测结果将各组分分别收集 起来，并进行后续处理和利用。
04 色谱分离法的优缺点
CHAPTER
优点
分离效果好
色谱分离法可以将混合物中的各组分 进行高效分离，得到较为纯净的单一 组分。
适用范围广
在药物分离纯化中的应用
药物分离纯化是色谱分离法应用的重 要领域之一。通过色谱分离法，可以 将混合药物中的有效成分与杂质进行 分离，提高药物的纯度和药效。
在药物分离纯化中，色谱分离法可以 用于中药、西药、生物药物等的分离 纯化，如大黄素、紫杉醇、蛋白质等 物质的分离纯化。
在食品检测中的应用
01
色谱分离法在食品检测中也有广 泛应用，主要用于食品中农药残 留、添加剂、有害物质的检测。
1950年代
出现了气相色谱法，利用气体 作为流动相，广泛应用于气体
和挥发性化合物的分析。
1960年代
出现了高效液相色谱法，利用 高分离效能的色谱柱和高压泵 ，提高了分离速度和灵敏度。
色谱分离法的应用领域
医药工业
用于药物生产和质量控制，以 及生物样品的分离和纯化。
食品工业
色谱分离技术
五、色谱图及基本概念
色谱图： 色谱图：混合液中各种 组分经色谱柱随流动相 依次流出，在检测器上 依次流出， 检测到的信号随时间的 变化曲线或随流动相的 体积的变化曲线为色谱 图。
1. 基线 色谱柱出口没有组分流出， 色谱柱出口没有组分流出，仅有纯流动相流 过监测器，即无试样通过检测器时， 过监测器，即无试样通过检测器时，检 测到的信号即为基线。 测到的信号即为基线。稳定的基线应是 一条平行于横坐标的直线。 一条平行于横坐标的直线。
分离度R的物理意义 分离度 的物理意义 分离度R综合考虑了保留值的差值与峰宽 分离度 综合考虑了保留值的差值与峰宽 两方面的因素对柱效率的影响， 两方面的因素对柱效率的影响，可衡量色 谱柱的总分离效能，R值越大 值越大， 谱柱的总分离效能，R值越大，两色谱峰 的距离越远，分离效果越好。 的距离越远，分离效果越好。
噪声：使基线发生细小波动的现象称为～， 噪声：使基线发生细小波动的现象称为～， 如空气峰。 如空气峰。
2、色谱峰 当样品中的组分随流动相流入检测器时，检 当样品中的组分随流动相流入检测器时， 测器的相应信号大小随时间变化所形成的 峰形曲线称为色谱峰， 峰形曲线称为色谱峰，峰的起点和终点的 连接直线称为峰底。 连接直线称为峰底。
色谱技术(分配色谱)--概念 色谱技术(分配色谱)--概念： 概念：
色谱技术是一组相关分离方法的总称， 色谱技术是一组相关分离方法的总称，色 谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质） 谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质） 和流动相，根据物质在两相间的分配行为 和流动相， 不同（由于亲和力差异），经过多次分配 不同（由于亲和力差异），经过多次分配 ）， 吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离 （吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离 的目的。 的目的。
色谱分离方法
色谱分离方法是一种常用的分析技术，用于将混合物中的化学物质按照其在固定相和流动相之间相互作用的差异进行分离。
常见的色谱分离方法包括气相色谱（Gas Chromatography, GC）、液相色谱（Liquid Chromatography, LC）以及超高效液相色谱（Ultra-High Performance Liquid Chromatography, UHPLC）等。
气相色谱（GC）是利用气体载气将样品中的化合物分离的方法。
在气相色谱中，样品被蒸发成气体并通过柱子上的固定相。
不同化合物在固定相上的停留时间不同，从而实现分离。
液相色谱（LC）则是基于液相为流动相的分离技术。
在液相色谱中，样品溶解在溶剂中，通过柱子上的固定相进行分离。
根据样品与固定相之间的相互作用力的不同，达到化合物分离的目的。
超高效液相色谱（UHPLC）是近些年发展起来的一种液相色谱技术。
它采用高压泵将流动相压入毛细管柱中，通过小颗粒固定相实现高效分离。
此外，还有其他的色谱分离方法，如离子色谱（Ion Chromatography, IC）、凝胶色谱（Gel Chromatography）等，它们根据需要选择不同的分析方法进行分离与检测。
天然药物化学(中药化学)中药化学第二章2(3)色谱分离技术
浓缩
柱层析操作（跑柱子）
二）、薄层色谱
粒径 5~40 m
1．吸附剂
硅胶
硅胶H 硅胶G 硅胶GF254 硅胶HF254
常用
氧化铝 硅藻土
聚酰胺
微晶纤维素
想一想 H、G、F各代表何种意思？试解释硅胶HF365？
种类
玻璃板 塑料膜
厚度 2mm
规格
5cm×20cm 10cm×10cm 10cm×15cm
紫外分析仪(三用)
6．检视装置
摄像设备
薄层色谱扫描仪(CS9301型）
7、操作技术
分类 自制薄层板
无黏合剂 含黏合剂
10%～15%煅石膏
0.2%～0.5%羧甲基纤维素钠水 溶液
1．薄层板 制备
市售薄层 板
操作方法
普通薄层板(玻璃、聚酰胺薄膜和铝基)
分类
高效薄层板（固定相粒径为5~7 ）um
操作方法
临用前一般应在110℃活化30分钟。聚酰胺薄膜不需活 化。铝基片薄层板和聚酰胺薄膜可根据需要剪裁
制板操作方法
• 将1份固定相和3份水（或羧甲基纤维素钠水 溶液）在研钵中沿同一方向研磨混匀，去除 表面的气泡后，置玻璃板上使涂布均匀，或 倒入涂布器（见图8-14）中，在玻板上平稳 地移动涂布器进行涂布(涂层厚度为0.2mm～ 0.3 mm)，取涂好的薄层板，置水平台上于室 温下晾干后，在110℃活化30分钟，立即置于 有干燥剂的干燥器中备用 。
薄层色谱（TLC） 纸色谱（PC) 薄膜色谱（TFC）
一、吸附色谱：利用吸附剂对被分离化合物分子 的吸附能力的差别而实现分离的一类色谱。
硅胶
氧化铝 活性炭 聚酰胺
吸附原理
物理吸附
化学吸附——碱 性化合物
色谱分离的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解色谱分离的基本原理和方法。
2. 掌握色谱仪器的操作方法和注意事项。
3. 学会使用色谱分离技术对混合物进行分离和鉴定。
二、实验原理色谱分离是利用混合物中各组分在固定相和流动相之间的分配系数不同，使各组分在固定相和流动相之间反复进行分配、迁移，从而实现分离的方法。
根据固定相和流动相的不同，色谱分离技术主要分为气相色谱、液相色谱和薄层色谱等。
本实验采用高效液相色谱（HPLC）技术，利用固定相和流动相之间的相互作用，对混合物中的各组分进行分离。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：高效液相色谱仪、色谱柱、流动相泵、检测器、进样器、计算机等。
2. 试剂：混合物样品、固定相（如C18、ODS等）、流动相（如乙腈、水等）、洗脱剂、标准品等。
四、实验步骤1. 样品制备：准确称取一定量的混合物样品，溶解于适当的溶剂中，配制成一定浓度的溶液。
2. 色谱柱的准备：将色谱柱安装在色谱仪上，按照仪器说明书进行色谱柱的平衡。
3. 流动相的准备：配制适当的流动相，用0.45μm滤膜过滤，然后装入流动相泵。
4. 进样：将配制好的样品溶液用进样器注入色谱柱。
5. 洗脱：启动色谱仪，根据实验需要设置流动相的流速、检测器的波长等参数。
6. 检测：记录色谱图，分析各组分的保留时间、峰面积等信息。
7. 结果分析：根据保留时间、峰面积等数据，对混合物中的各组分进行鉴定。
五、实验结果与分析1. 色谱图分析根据实验得到的色谱图，可以观察到混合物中各组分的峰形、保留时间等特征。
通过比较标准品的保留时间和峰面积，可以鉴定混合物中的各组分组分。
2. 结果讨论实验结果表明，通过高效液相色谱技术，成功实现了混合物中各组分的分离和鉴定。
实验过程中，色谱柱的选择、流动相的配比、流速等参数对分离效果有较大影响。
因此，在实际操作中，需要根据实验需求和样品特性，优化实验条件，以提高分离效果。
六、实验总结1. 本实验通过高效液相色谱技术，成功实现了混合物中各组分的分离和鉴定。
色谱分离技术
(1) 将内径约1.5cm的色谱柱 洗净后在底部放入一小团脱 脂棉花，加5ml95％乙醇溶液 除气泡。
(2) 称量7g中性Al2O3放入小 烧杯中，并用10ml 95％乙醇 调匀。
(3) 打开色谱柱活塞，控制 乙醇流速为1滴/s，将Al2O3从 柱顶一次加入柱内，并用装 有橡皮塞的玻棒轻轻敲击管 外壁，使其填装均匀。
☺ 1906年俄国M.C Tswett创立了色谱分离技术。 ☺ 20世纪30年代通过对植物代谢产物—色素 如叶绿素及胡萝卜素等分离，真正实现了液 相色谱技术有机制备的应用。 ☺ 50年代后飞速发展并形成独立的一门三级 学科——色谱学。 ☺历史上曾有两名科学家因为在色谱学领域 的卓越成就而获得诺贝尔化学奖，此外色谱 学还在12项获得诺贝尔化学奖项的研究工作 中起到关键作用。 ☺近年来，这一方法在化学、生物学、医学 中得到了普遍的应用。
橙黄色为胡萝卜素 黄色为叶黄素 蓝绿色为叶绿素a
黄绿色为叶绿素b
√ 吸附色谱
√ 分配色谱
利用固定相吸附中对物 质分子吸附能力的差异实现 对混合物的分离，吸附色谱 的色谱过程是流动相分子与 物质分子竞争固定相吸组分溶解度的差异来实现 分离。分配色谱的固定相需要一 种本身不起分离作用的固体吸住 它，用作洗脱或展开的液体称为 移动相。易溶于移动相的化合物 移动速率快一些，而在固定相中 溶解度大的化合物，移动速率慢 一些。
植物叶绿体色素一般由叶绿 素a；叶绿素b；胡萝卜素和叶黄 素组成。从植物叶片中提取提取 和分离色素利用的是叶绿体色素 能溶于有机溶剂且溶解度不同的 特性。
1.色素的提取 （一）实验材料 菠菜等新鲜的绿色植物叶片。 （二）仪器与用品 天平，剪刀，量筒，烧杯，研 钵，漏斗，滤纸等。 （三）试剂 丙酮，碳酸钙，石英砂。
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亲和色谱
亲和色谱是专门用于纯化生物大分子的色谱分离技术，它是基于固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和能力的不同来进行相互分离的。
亲和色谱的显著特点：
具有其他分离技术所不能比拟的高选择性，且色谱过程操作条件温和，能有效地保持生物大分子高级结构的稳定性，活性样品的回收率也比较高。
所以亲和色谱被广泛用于酶、治疗蛋白、抗体、核酸、辅助因子等生物大分子以及细胞、细胞器、病毒等超分子物质的分离与纯化。
特别是对分离含量极少而又不稳定的活性物质最有效，经一步亲和色谱即可提纯几百至几千倍。
亲和色谱的基本过程：
把具有特异亲和力的一对分子的任何一方作为配基，在不伤害其生物功能情况下，与不溶性载体结合，使之固定化，装入色谱柱，然后把含有目的物质的混合液作为流动相，在有利于固定相配基和目的物质形成络合物的条件下进入色谱柱。
目的物质被吸附，杂质直接流出。
变换过柱溶液，使配基与其亲和物分离，获纯化的目的产物。
亲和色谱分离中经常采用的生物亲和关系
①酶：底物、底物类似物、抑制剂、辅酶、金属离子；
②抗体：抗原、病毒、细胞；
③激素、维生素：受体蛋白、载体蛋白；
④外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞；
⑤核酸：互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白；
⑥细胞：细胞表面特异蛋白、外源凝集素。
亲和色谱操作中的洗脱方法
在亲和色谱洗脱操作中，洗脱方法有两类，即普通洗脱法和专一性洗脱法。
普通洗脱法：与其他色谱分离方法一样，可以通过改变溶剂或缓冲液的类型，改变缓冲液的pH和离子强度，改变洗脱温度，以及添加促溶剂等措施进行洗脱。
专一性洗脱法：是指溶液中的配基、抑制剂或半抗原等物质与亲和层析剂上的配基，同时对生物活性物质产生竞争性的结合，从而达到洗脱的目的。
一般说来，专一性洗脱可以获得很高的分辨能力。
但是，专一性洗脱剂的价格都比较昂贵，所以常与普通洗脱条件配合作用。
离子交换色谱
离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。
离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。
固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。
离子交换色谱的分离原理：
离子交换色谱（IEC）以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。
当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。
根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。
离子交换色谱的固定相：
离子交换色谱常用的固定相为离子交换树脂。
目前常用的离子交换树脂分为三种形式，一是常见的纯离子交换树脂。
第二种是玻璃珠等硬芯子表面涂一层树脂薄层构成的表面层离子交换树脂，第三种为大孔径网络型树脂。
它们各有特点，例如第二种树脂有很高的柱效，但它的柱容量不大；第三种树脂适用于非水溶液中物质的分离，因为它们的孔径和内表面积大，不需要用水溶胀，便可满意地使用。
按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。
阳离子交换树脂上具有与样品中阳离子交换的基团。
阳离子交换树脂又可分为强酸性和弱酸性树脂。
强酸性阳离子交换树脂所带的基团为磷酸基（一），其中和有机聚合物牢固结合形成固定部分，是可流动的能为其他阳离子所交换的离子。
阴离子交换树脂具有与样品中阴离子交换的基团。
阴离子交换树脂也可分为强碱性和弱碱性树脂。
阴离子交换树脂属强碱性，它是由有机聚合物骨架和一季胺碱基团所组成，它带有正电荷。
而与相反的是可以移动的部分，它能被其它阴离子所交换。
离子交换色谱的流动相：
离子交换色谱的流动相最常使用水缓冲溶液，有时也使用有机溶剂如甲醇，或乙醇同水缓冲溶液混合使用，以提供特殊的选择性，并改善样品的溶解度。
离子交换色谱所用的缓冲液，通常用下列化合物配制：钠、钾、被的柠檬酸盐，磷酸盐，甲酸盐与其相应的酸混合成酸性缓冲液或氢氧化钠混合成碱性缓冲液等。
离子交换色谱主要是用来分离离子或可离解的化合物。
它不仅广泛地应用于无机离子的分离，而且广泛地应用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离。
凝胶色谱
凝胶色谱是基于溶质分子的流体力学体积大小进行分离的。
在凝胶介质颗粒内部, 含有十分丰富的多分散性微孔。
较小的分子能够进入更多的或者全部的微孔, 较大的分子只能进入部分微孔甚至完全排斥于孔外, 因而不同大小的分子流经凝胶柱时小分子被保留而大分子首先被排除, 凝胶孔起到筛分物质质点大小的作用。
根据构成凝胶的物质的极性不同, 可以分为亲水性凝胶和疏水性凝胶两大类。
亲水性凝胶具有“筛分”无机盐的能力。
一般认为凝胶色谱分离无机盐的机理除了体积排除效应以外, 还存在诸如离子排斥、物理吸附、两性离子交换等次级效应, 这种次级效应给无机盐的分离带来好处。
SCN- 就是一个十分典型的离子, 它在凝胶中存在比较明显的吸附趋向, 分配系数往往大于1，从而有利于与其它无机盐的分离。
也有学者认为SCN-离子在凝胶中能格外保留的原因还可能在于水化度及水化过程的热力学性质变化。
凝胶色谱不同于离子交换, 高价阳离子或形成络合物的离子不致被牢固地滞留于凝胶介质中, 因而即使长期使用也无需用化学试剂再生, 使用寿命比离
子交换树脂更长, 这是一种比较理想的溶剂净化手段。
凝胶色谱有许多其他色谱所不具备的特点。
例如由于它的分离主要并不依赖于相互作用力, 所以对流动相要求不高, 不需要使用梯度淋洗, 实验操作比较
简单, 重复性好。
吸附色谱
吸附色谱法是指混合物随流动相通过吸附剂时，由于该吸附剂对不同物质有不同的吸附力而使混合物分离的方法。
该法主要应用于某些分子量不大的物质的分离提纯，个别的如羟基磷灰石也适用于生物大分子的分离提纯，应用范围比较广。
分离原理：固定相是固体吸附剂，吸附剂是多孔性微粒物质表面有吸附中心。
样品组分与流动相竞争吸附中心。
各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留时间不同和实现分离。
吸附介质根据其在不同色谱分离技术中的吸附机理主要可分为凝胶过滤介质, 离子交换树脂, 疏水色谱分离介质, 亲和色谱分离介质, 金属鳌合色谱分
离介质, 分配色谱分离介质。
按其材质可分为无机和有机两大类。
固定相：固定相通常是强极性的硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂。
活性硅胶最常用。
流动相：弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。
应用：对于极性，结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。
缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象。
亲和膜色谱
亲和膜色谱以膜为亲和载体，偶联亲和配基，选择性地吸收目标物质。
亲和膜色谱是在亲和色谱的基础上发展起来的，是现代膜分离技术与亲和色谱技术的结合。