色谱分离技术

亲和色谱

亲和色谱是专门用于纯化生物大分子的色谱分离技术，它是基于固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和能力的不同来进行相互分离的。亲和色谱的显著特点：

具有其他分离技术所不能比拟的高选择性，且色谱过程操作条件温和，能有效地保持生物大分子高级结构的稳定性，活性样品的回收率也比较高。

所以亲和色谱被广泛用于酶、治疗蛋白、抗体、核酸、辅助因子等生物大分子以及细胞、细胞器、病毒等超分子物质的分离与纯化。

特别是对分离含量极少而又不稳定的活性物质最有效，经一步亲和色谱即可提纯几百至几千倍。

亲和色谱的基本过程：

把具有特异亲和力的一对分子的任何一方作为配基，在不伤害其生物功能情况下，与不溶性载体结合，使之固定化，装入色谱柱，然后把含有目的物质的混合液作为流动相，在有利于固定相配基和目的物质形成络合物的条件下进入色谱柱。目的物质被吸附，杂质直接流出。变换过柱溶液，使配基与其亲和物分离，获纯化的目的产物。

亲和色谱分离中经常采用的生物亲和关系

①酶：底物、底物类似物、抑制剂、辅酶、金属离子；

②抗体：抗原、病毒、细胞；

③激素、维生素：受体蛋白、载体蛋白；

④外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞；

⑤核酸：互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白；

⑥细胞：细胞表面特异蛋白、外源凝集素。

亲和色谱操作中的洗脱方法

在亲和色谱洗脱操作中，洗脱方法有两类，即普通洗脱法和专一性洗脱法。

普通洗脱法：与其他色谱分离方法一样，可以通过改变溶剂或缓冲液的类型，改变缓冲液的pH和离子强度，改变洗脱温度，以及添加促溶剂等措施进行洗脱。

专一性洗脱法：是指溶液中的配基、抑制剂或半抗原等物质与亲和层析剂上的配基，同时对生物活性物质产生竞争性的结合，从而达到洗脱的目的。一般说来，专一性洗脱可以获得很高的分辨能力。

但是，专一性洗脱剂的价格都比较昂贵，所以常与普通洗脱条件配合作用。

离子交换色谱

离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。

离子交换色谱的分离原理：

离子交换色谱（IEC）以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。

离子交换色谱的固定相：

离子交换色谱常用的固定相为离子交换树脂。目前常用的离子交换树脂分为三种形式，一是常见的纯离子交换树脂。第二种是玻璃珠等硬芯子表面涂一层树脂薄层构成的表面层离子交换树脂，第三种为大孔径网络型树脂。它们各有特点，例如第二种树脂有很高的柱效，但它的柱容量不大；第三种树脂适用于非水溶液中物质的分离，因为它们的孔径和内表面积大，不需要用水溶胀，便可满意地使用。

按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。阳离子交换树脂上具有与样品中阳离子交换的基团。阳离子交换树脂又可分为强酸性和弱酸性树脂。强酸性阳离子交换树脂所带的基团为磷酸基（一），其中和有机聚合物牢固结合形成固定部分，是可流动的能为其他阳离子所交换的离子。

阴离子交换树脂具有与样品中阴离子交换的基团。阴离子交换树脂也可分为强碱性和弱碱性树脂。

阴离子交换树脂属强碱性，它是由有机聚合物骨架和一季胺碱基团所组成，它带有正电荷。而与相反的是可以移动的部分，它能被其它阴离子所交换。

离子交换色谱的流动相：

离子交换色谱的流动相最常使用水缓冲溶液，有时也使用有机溶剂如甲醇，或乙醇同水缓冲溶液混合使用，以提供特殊的选择性，并改善样品的溶解度。

离子交换色谱所用的缓冲液，通常用下列化合物配制：钠、钾、被的柠檬酸盐，磷酸盐，甲酸盐与其相应的酸混合成酸性缓冲液或氢氧化钠混合成碱性缓冲液等。

离子交换色谱主要是用来分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛地应用于无机离子的分离，而且广泛地应用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离。

凝胶色谱

凝胶色谱是基于溶质分子的流体力学体积大小进行分离的。在凝胶介质颗粒内部, 含有十分丰富的多分散性微孔。较小的分子能够进入更多的或者全部的微孔, 较大的分子只能进入部分微孔甚至完全排斥于孔外, 因而不同大小的分子流经凝胶柱时小分子被保留而大分子首先被排除, 凝胶孔起到筛分物质质点大小的作用。

根据构成凝胶的物质的极性不同, 可以分为亲水性凝胶和疏水性凝胶两大类。亲水性凝胶具有“筛分”无机盐的能力。一般认为凝胶色谱分离无机盐的机理除了体积排除效应以外, 还存在诸如离子排斥、物理吸附、两性离子交换等次级效应, 这种次级效应给无机盐的分离带来好处。SCN- 就是一个十分典型的离子, 它在凝胶中存在比较明显的吸附趋向, 分配系数往往大于1，从而有利于与其它无机盐的分离。也有学者认为SCN-离子在凝胶中能格外保留的原因还可能在于水化度及水化过程的热力学性质变化。

凝胶色谱不同于离子交换, 高价阳离子或形成络合物的离子不致被牢固地滞留于凝胶介质中, 因而即使长期使用也无需用化学试剂再生, 使用寿命比离

子交换树脂更长, 这是一种比较理想的溶剂净化手段。

凝胶色谱有许多其他色谱所不具备的特点。例如由于它的分离主要并不依赖于相互作用力, 所以对流动相要求不高, 不需要使用梯度淋洗, 实验操作比较

简单, 重复性好。

吸附色谱

吸附色谱法是指混合物随流动相通过吸附剂时，由于该吸附剂对不同物质有不同的吸附力而使混合物分离的方法。该法主要应用于某些分子量不大的物质的分离提纯，个别的如羟基磷灰石也适用于生物大分子的分离提纯，应用范围比较广。

分离原理：固定相是固体吸附剂，吸附剂是多孔性微粒物质表面有吸附中心。样品组分与流动相竞争吸附中心。各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留时间不同和实现分离。

吸附介质根据其在不同色谱分离技术中的吸附机理主要可分为凝胶过滤介质, 离子交换树脂, 疏水色谱分离介质, 亲和色谱分离介质, 金属鳌合色谱分

离介质, 分配色谱分离介质。按其材质可分为无机和有机两大类。

固定相：固定相通常是强极性的硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂。活性硅胶最常用。

流动相：弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。

应用：对于极性，结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。

缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象。

亲和膜色谱

亲和膜色谱以膜为亲和载体，偶联亲和配基，选择性地吸收目标物质。亲和膜色谱是在亲和色谱的基础上发展起来的，是现代膜分离技术与亲和色谱技术的结合。