elisa原理及实验操作

夹心 ELISA
直 接 夹 心
双抗夹心 双抗原夹心
双抗夹心ELISA，待检抗原必须包括两个或者两个以上的表位，否则检测抗体无法与待检抗 原结合，例如半抗原和小分子抗原都是不能用双抗夹心ELISA检测的。 双抗原夹心ELISA 中任何类似的免疫球蛋白都可以被检测出，而间接ELISA 中使用的二抗一 般只能识别IgG，因此双抗原夹心ELISA比间接ELISA也更灵敏。
碱性包被液如碳酸盐用的较多，尤其是在小分子和载体蛋白的偶联物的包被，其主 要的优势在于碱性环境可以使蛋白更容易的与板子结合。
包被量：0.1-1ug/孔
2. 洗涤
每次洗涤次数不少于3次，每次洗涤最好能浸泡30s，洗完晾干或拍干。
洗液： PBST、TBST、PBS
3. 封闭
让大量不相关的蛋白填充无目的蛋白的空隙，从而ห้องสมุดไป่ตู้除elisa后续步骤中物质的吸附。 封闭液：0.05%-0.5% BSA，10%小牛血清，1%明胶，5%脱脂奶粉
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受高温天气影响，酶的活性降低。
试剂使用时已超出有效期。 温育时间不够。
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恒温箱温度达不到37℃。
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加样量不足；移液时抽吸排放过快，有气 泡、或吸头内残留液体过多。
谢谢！
1.ELISA原理及分类 2.间接ELISA操作步骤 3.简述几条ELISA重复性差的原因及解决方法
间接 ELISA
间接ELISA 中与包被好的抗原结合的不是酶标抗体，而是非酶 标的，再引入二抗（酶标）与一抗特异性结合，最后加入底物显色 并判读结果。 二抗一般为多抗，一个一抗分子上可以结合多个二抗分子，同 时一个二抗分子上可以标记上多个酶分子，所以当待测抗体为多抗 时（可以由多个一抗分子与抗原结合），信号经过两步放大，提高 灵敏度。 检测抗体的效价、血清的效价、单克隆抗体的筛选以及在临床 诊断中检测标志性抗体。
步骤及注意事项
1. 包被
• 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团 与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、 等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分 子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。IgG对聚苯乙烯等固相具 有较强的吸附力，其联结多发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均 采用直接吸附法。 • 不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。 包被DNA：板先经紫外线照射；先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被；用 亲和素先包被载体。 • 脂类物质：在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹 干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。
包被液：
pH 9.6 碳酸盐缓冲液 pH 7.2 磷酸盐缓冲液 pH 7-8 Tris缓冲液
包被缓冲液的选择要依靠你所包被的物质而定,没有绝对的选择,但有一个原则就是 要尽可能的保持包被物的活性不被损失.目前常用的包被缓冲液有PBS,CBS,tris盐缓冲 液,咪唑缓冲液等,一般来说,缓冲液的pH要大于蛋白质的pI,以保持其活性.
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加酶时污染
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恒温箱温度过高 整个操作时间过长、造成反应时间不同 （第一孔与最后一孔反应时间相差很 悬殊）。气温高时更明显。
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洗板次数不够
按试剂要求，不可任意减少洗板次数
显色浅，灵敏度低
序号 原因 解决方法 所有组分都应当在4℃冷藏，未使用完的 板条要密封保存。。 过期试剂不可以使用。 严格按照说明书操作。 注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在 37±0.5℃。尽量避免频繁开关恒温箱 门。 经常注意水箱中合适的水位。 在保证水不没过酶标板的前提下，使水位 尽量高，以保证反应温度。 经常校正移液器。注意吸头要与移液器吻 合。移液不宜过快，排放要完全。
优点：由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法
达 到高的敏感度。
分类：直接 elisa、间接 elisa、夹心 elisa、竞争抑制 elisa
直接 ELISA
• 亲和纯化的单抗包被在酶标板上，封闭后加入酶标分型二 抗，最后加底物显色即可。 • 这种ELISA中只经过了一步信号放大（酶的放大），所以其 灵敏度不是很高，另外其测定的对象也非常有限，只能测 定酶标记的分子。 • 可用于检测抗原和抗体。
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假阳性多，本底高甚至花板
序号 1 2 原因 试剂过期 加样时污染 解决方法 过期试剂不能使用 注意更换吸头。尽可能避免污染。 对先加样后加酶的操作，加酶时要注意吸 头不要接触标本，造成污染。当可能 造成污染时，一定要更换吸头，切忌 侥幸心理。 注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在 37±0.5℃。 在尽可能短的时间内完成操作。 尽量不要堆积多块板子操作（尤其手工操 作时）。
间 接 夹 心
将一种种属来源的特异性抗体包被于固相载体上（作为捕 获抗体），封闭，加入待检抗原，温育，洗涤后加入另一种种属来 源的特异性抗体（非酶标，作为检测抗体），最后加入酶标二抗 （特异性识别检测抗体：增加体系特异性）。
竞争抑制 ELISA
直 接 竞 争 抑 制
间 接 竞 争 抑 制
洗涤过程就可以洗掉被竞争下的 酶标抗体，最后加底物显色。最 终显色的结果与待检原（或抗体） 量成反比。 用途：只有一个抗原表位的物质（多肽、小分子物质、小 分子激素等）、乙肝标志物（e抗原不稳定）等。
ELISA 原理及实验操作
ELISA 简介
• 酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)，简称ELISA，基础是抗原 或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
原理：受检标本（测定抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
加入酶反应 的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本 中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
4. 一抗孵育
一抗稀释时混合均匀，样品加孔底部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
5. 酶标二抗
常用酶：HRP，AP。
6. 显色 7. 终止
问题
重复性不好
1 加样量多少不一，操作时间长短不一。 重复同一样品时，加样量与加样时间相同； 同时注意移液器的校准。加样后应该 将酶标板放置在微量振荡器上，充分 混合；标本保证一致、无污染；尽可 重复实验的操作人员不同，操作习惯不同。 能由同一名操作人员操作。 尽可能模拟相同的反应条件。 反应时间、温度等不相同。 加入标本后没有混匀。 标本不同（被混淆或者处理不同）