凝胶层析法测蛋白质分子量精选文档
(整理)凝胶层析法测定蛋白质分子质量.
凝胶层析法测定蛋白质分子质量一、实验目的1.了解凝胶层析（Gel Chromatography）的原理及其应用。
2.通过测定蛋白质分子质量的训练，初步掌握凝胶层析技术。
二、实验原理凝胶层析又称凝胶排阻层析（Gel Exclusion Chromatography），凝胶过滤（Gel Filtration），渗透层析（Gel Permeation Chromatography）或分子筛层析（Molecular Sieve Chromatography）等。
它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。
凝胶层析技术被广泛应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等各种生物化学实验过程之中。
测定蛋白质分子质量也是它的重要应用之一。
凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状的颗粒物质。
用凝胶来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近似于球形）具有不同的排阻效应实现的。
即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，而后又被流出的洗脱液带走。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。
一些中等大小的分子介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。
这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0~100%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示，Kav 值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V）以及分离物本身的洗脱体积（Ve ）有关：Kav=（Ve-V）/（Vt-V）。
生物化学实验报告：蛋白质分子量的测定——凝胶层析法
实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法一、实验目的1.掌握凝胶层析的基本原理。
2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。
二、实验原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。
当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。
该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。
当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。
大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。
若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。
总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。
将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。
实质上Vt是由V o，Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。
Vg为凝胶本身的体积。
洗脱体积（Ve）与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。
它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。
凝胶层析法测定蛋白质分子量
凝胶层析法测定蛋白质的分子质量【实验原理】凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶的分子筛作用把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又称为分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。
凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。
但这种“过筛”与普通的过筛不一样。
将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱。
在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。
凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose）；人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶（商品名称为Sephadex）的各种交联凝胶，它们是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。
这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与分离物质分子的大小有相应的数量级。
在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。
相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。
利用这种性质可分离不同M r的物质。
为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以V t(total volume)表示。
实际上V t是由V O，V t与V g三部分组成，：V t=V O+V t+V gV o称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相当于一般层析法中柱内流动相的体积；V i为内体积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相当于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；V g为凝胶本身的体积，因此V t-V o.等于V i+V g。
高等生化实验报告：蛋白质分子量的测定
试验一蛋白质分子量的测定—凝胶层析法一、原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有肯定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。
当混合物随流淌相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分别的技术。
该法设备简洁、操作便利、重复性好、样品回收率高。
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状构造、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的微小构造及筛孔的直径均匀全都，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。
当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流淌而发生移动。
大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再集中出来，故流程长，移动速度慢，最终被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分别。
假设分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。
总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和集中的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分别开来。
将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt 表示。
实质上Vt 是由Vo，Vi 与Vg 三局部组成，Vo 称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流淌相的体积；Vi 为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。
Vg 为凝胶本身的体积。
洗脱体积〔Ve〕与Vo 与Vi 之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi。
式中Ve 为洗脱体积，自参加样品时算起，到组分最大浓度〔峰〕消灭时所流出的体积；Kd 为样品组分在二相间的安排系数，也可以说Kd 是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的安排系数。
它只与被分别的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。
Kd 可通过试验求得，上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi。
凝胶层析法测定蛋白质分子量
凝胶层析法测定蛋白质分子量[原理]凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。
把含有不同大小分子的混合液，铺加在胶面上，让它流过凝胶柱。
由于凝胶具有网络结构，当混合液通过凝胶颗粒缝隙中时，溶液中的溶质凡是比网孔小的分子，都能自由进入颗粒内部，而比网孔大的分子则不能进入。
因此，在洗脱过程中，大分子物质必然先于小分子物质向下移行，先流出的是大分子物质，小分子物质后流出，从而达到分离的目的。
测定生物大分子的分子量是凝胶层析法的重要用途之一。
用于分子量测定的凝胶有交联葡萄糖、琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶等。
根据凝胶层析原理，对同一类型化合物的洗脱特征与组分的分子量有关。
流过凝胶柱时，按分子大小顺序流出，分子量大的走在前面。
实验研究表明，在凝胶分离范围之内，蛋白质分子量与洗脱位置之间存在线性对应关系。
洗脱体积Ve是该物质分子量对数的线性函数，可用下式表示：Ve =K1－K2 logMr式中K1与K2为常数，Mr为分子量。
测定方法有两种，一种是上柱样品中一次包括几个标准蛋白质，洗脱后分出相应的几个峰。
根据峰顶端对应的洗脱体积算出各标准蛋白质的Ve，这样一次过柱就可以制作标准曲线。
将已知的标准蛋白质走完后，再在已知标准混合样品中加入未知样品，过柱后出现的新峰就属于未知样品，测出未知样品的Ve，通过标准曲线找出对应的分子量。
这种方法叫做内插法。
另一种方法是一个标准蛋白过一次柱，经几次过柱后得到对应的Ve，画出标准曲线。
将已知的标准蛋白质走完后，再测未知样品Ve，求出对应的分子量。
这种方法叫做外插法。
本实验使用Sephadex G-75，采用内插法进行。
[方法和步骤]1、凝胶预处理（1）称取凝胶干粉12g，放入250mL烧杯中，加入过量的水，室温浸泡24h，或沸水浴浸泡3h。
（2）溶胀平衡后的凝胶用倾泻除去细颗粒。
其方法是用搅棒将凝胶搅匀（注意不要过分搅拌，以防止颗粒破碎），放置数分钟，将未沉淀的细颗粒随上层水倒掉，浮洗3～5次，直至上层没有细颗粒为止。
凝胶层析法测定蛋白质分子量
凝胶层析法测定蛋白质分子量一、实验目的1.了解凝胶层析的基本原理。
2.掌握利用凝胶层析法测定蛋白质分子量的实验技能。
二、实验原理凝胶层析(gel chromatography)是20世纪60年代发展起来的一种分离分析方法。
其法有许多同义词如凝胶过滤、分子排阻层析、分子筛层析、凝胶渗透层析等。
凝胶层析是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。
凝胶的孔隙犹如”筛眼”，当被分离的物质流过凝胶柱时，分子大于凝胶”筛眼”范围的物质完全被排阻，不能进入凝胶颗粒内部，只能随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此受到的阻滞作用小，流程短，流速块儿先流出层析柱；分子小于”筛眼”的物质则可完全深入凝胶颗粒的”筛眼”中。
因此受到的阻滞作用大，而且从一个颗粒的”筛眼”又进入另一个颗粒的”筛眼”，其流程长，流速也就慢，从层析柱中流出就较晚。
若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。
从流出先后次序的不同即可达到分离和纯化被分离物质的目的。
凝胶的这种特性又称为分子筛效应，洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量关系。
在一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积称为外水体积V0，不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为V0时，出现洗脱峰。
凝胶颗粒内部孔穴的总体积成为内水体积V i，能全部透入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为V0+V i 时，出现洗脱峰。
将分子筛分配系数定义为：K= V e / V i若生物大分子的分子为球形，其K 与生物大分子的相对分子质量间存在如下关系：K = －lgM r + c其中b 和c 为常数。
试验已证实这一关系的存在(排阻体积与相对分子质量的关系)。
目前常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶，其中最常用的是葡聚糖凝胶。
葡聚糖凝胶有不同的型号，用于分离不同相对分子质量大小的物质。
本实验用葡聚糖SephadexG—75分离胰岛素(M r 为6000)和牛血清白蛋白(M r为75000)。
凝胶过滤层析方法检测蛋白质分子量的原理
凝胶过滤层析方法检测蛋白质分子量的原理以《凝胶过滤层析方法检测蛋白质分子量的原理》为标题，写一篇3000字的中文文章凝胶过滤层析是一种常见的分子分析方法，用于测量物质分子量。
常用于检测蛋白质分子量。
凝胶过滤层析方法有助于化学和生物分子之间的相互作用以及研究分子大小的变化。
本文将阐述凝胶过滤层析检测蛋白质分子量的原理。
凝胶过滤层析是一种基于密度的分子分析方法。
该方法将样品加入非常浓缩的凝胶层，并在低压下过滤。
较小的分子可以通过凝胶而更大的分子则被滤波。
根据滤失的部分，可以推测出样品中分子的大小。
该方法最重要的特点是它可以检测出均一分子的情况，而其他分子的尺寸分析方法则无法实现此目的。
凝胶过滤层析可以用来测量蛋白质分子量。
在该实验中，研究者使用难溶性的聚苯乙烯凝胶，在某种pH和温度的环境中，将蛋白质进行溶解和混合，然后将它们加入凝胶层，并且在低压下进行过滤。
从最终收集的滤失液中检测到溶解物的体积，然后根据滤失液的量来推算出蛋白质分子量。
凝胶过滤层析可以制备多种蛋白质，包括低分子量的蛋白质和高分子量的蛋白质。
在此方法中，凝胶的分子比例（DC）可以用来确定受试蛋白质的种类，例如低DC的混合物可能包含低分子量的蛋白质。
此外，还可以利用凝胶过滤层析方法找出蛋白质的变性情况，从而识别蛋白质间的结构变化。
凝胶过滤层析方法有许多优点。
它可以检测出多种蛋白质，是一种高灵敏度的技术。
此外，它不依赖于某个特定的化学反应，可以快速，灵敏地检测各种蛋白质的分子量。
另外，凝胶过滤层析方法也可以用来检测各种其他复杂的分子，包括糖，多肽，抗体和小分子化合物，以及多种大分子组装体。
凝胶过滤层析是一种实用的研究和应用分子大小的方法，它可以用来快速检测出蛋白质和其他分子的分子量。
该方法为研究蛋白质的种类和变性提供了一种有效手段。
本文详细论述了凝胶过滤层析检测蛋白质分子量的原理，以及这种方法的优点和缺点。
凝胶过滤层析是一项日益重要的分析方法，可以帮助研究者更好地了解蛋白质的构造和作用，以及蛋白质分子量的变化。
凝胶过滤层析实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶过滤层析的原理及操作步骤。
2. 掌握利用凝胶过滤层析法分离混合物中不同分子量蛋白质的方法。
3. 通过实验验证凝胶过滤层析法在蛋白质分离中的应用。
二、实验原理凝胶过滤层析法，又称分子筛层析法或凝胶过滤法，是一种根据分子大小进行分离的层析技术。
该技术利用凝胶的分子筛特性，将混合物中的不同分子量的物质分离。
凝胶是一种具有多孔结构的物质，孔径大小不一，当混合物通过凝胶层析柱时，大分子物质由于无法进入凝胶孔径，将直接通过层析柱；而小分子物质则可以进入凝胶孔径，从而在层析柱中停留较长时间，实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质混合物（含有已知分子量的标准蛋白质和未知分子量的蛋白质）- 凝胶层析柱（Sephadex G-75）- 洗脱液（磷酸盐缓冲液，pH 7.4）- 标准蛋白质（如牛血清白蛋白、卵清蛋白等）- 未知蛋白质样品2. 实验仪器：- 凝胶层析柱架- 凝胶层析柱- 量筒- 离心机- 分光光度计四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：将凝胶层析柱垂直放置于凝胶层析柱架上，用洗脱液平衡凝胶层析柱，直至洗脱液颜色清澈。
2. 加样：取一定量的蛋白质混合物，加入凝胶层析柱的顶部，用洗脱液冲洗，直至混合物完全进入层析柱。
3. 洗脱：用洗脱液缓慢冲洗层析柱，收集各部分洗脱液，分别测定其蛋白质含量。
4. 分离：根据洗脱液的蛋白质含量，绘制洗脱曲线，分析不同分子量蛋白质的分离情况。
5. 结果分析：根据标准蛋白质的分子量和洗脱曲线，推测未知蛋白质样品的分子量。
五、实验结果与分析1. 凝胶过滤层析柱平衡后，洗脱液颜色清澈，说明凝胶层析柱已准备就绪。
2. 洗脱过程中，标准蛋白质和未知蛋白质样品的洗脱曲线如下：- 标准蛋白质洗脱曲线：在洗脱曲线中，标准蛋白质的洗脱峰呈对称状，峰面积较大，说明分离效果较好。
- 未知蛋白质样品洗脱曲线：在洗脱曲线中，未知蛋白质样品的洗脱峰位置与标准蛋白质的洗脱峰位置不同，峰面积较小，说明分离效果较差。
生物化学实验报告：蛋白质分子量的测定——凝胶层析法
实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法一、实验目的1.掌握凝胶层析的基本原理。
2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。
二、实验原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。
当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。
该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。
当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。
大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。
若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。
总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。
将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。
实质上Vt是由V o，Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。
Vg为凝胶本身的体积。
洗脱体积（Ve）与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。
它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。
实验十七 蛋白质分子量测定
实验十七蛋白质分子量测定——凝胶过滤层析法一、目的：（1）初步掌握利用凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理。
（2）学习用标准蛋白质混合液制作V e，K av对1gM r的“选择曲线”以及测定未知蛋白质样品分子量的方法。
二、原理：凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又叫做分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。
凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。
但这种“过筛”与普通的过筛不一样。
将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
分离过程中的示意见图17-1。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。
凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶，后者的商品名称为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它是个有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水，其化学结构式如图17-2所示。
这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。
在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。
相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。
利用这种性质可分离不同分子量的物质。
为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以V t（total volume）表示。
葡聚糖凝胶过滤法测定蛋白质的分子量
实验二十 葡聚糖凝胶过滤法测定蛋白质的分子量目的要求学习用葡聚糖凝胶过滤法测定蛋白质的分子量。
实验原理葡聚糖凝胶（Sephadex ）过滤法测定蛋白质分子量的原理，主要是依据这种凝胶具有分子筛作用，一定型号的凝胶具有大体上一定大小的孔径。
在一定的凝胶柱内，凝胶孔隙所占的体积成为内水体积V i ，凝胶颗粒间的自由空间所占的体积称为外水体积V 0。
当样品流经凝胶柱时，大于孔隙的大分子完全不滲入到凝胶内部，只需V 0体积的洗脱液便可将其由一端洗脱到另一端；相反，如果样品体积小于孔隙，则需要V 0＋V i 体积的洗脱液，才能将它们由一端洗脱到另一端。
中等分子（分子大小在上述两种极限之间）所需洗脱液体积介于两者之间，V e ＝V 0＋K d V i （0<K d <1）。
K d 为分配系数，它表示一种物质在孔隙内的滲透程度，相当于这种物质在孔隙内所占体积和孔隙总体积的比值。
e d i V V K V -=如果假定蛋白质分子近于球形，同时没有显著的水合作用，则不同大小分子量的蛋白质，进入凝胶筛孔的程度不同，其洗脱体积决定于分子大小。
当蛋白质分子量在10000～15000时，蛋白质在葡聚糖凝胶柱上层析的洗脱体积和分子量的对数呈直线关系。
若用已知分子量的标准蛋白质在一定型号葡聚糖凝胶柱上层析，精确测其洗脱体积，并以洗脱体积V e 对分子量的对数logM W 作图，可获得一条标准曲线。
未知分子量的蛋白质在相同条件下层析，根据其洗脱体积即可在标准曲线上求得分子量。
本方法测分子量设备简单，结果处理方便，因此应用较广泛。
但本方法仅适用于轴比相近似为球状蛋白，对轴比大的纤维蛋白不适用；对含量大于5%的糖蛋白因有较大水合作用，三个不同大小分子组份上柱洗脱曲线示意图测得分子量偏高；对含铁蛋白测定数据偏低。
由于V e 与柱的大小有关，如果用V e /V 0对logM W 作图，同样可得一线性关系的标准曲线，且可消除柱的大小和吸附效应的误差。
蛋白质分子量测定：凝胶过滤层析法
蛋白质分子量测定：凝胶过滤层析法蛋白质分子量测定：凝胶过滤层析法一、目的：（1）初步掌握利用凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理。
（2）学习用标准蛋白质混合液制作Ve，Kav对1gMr的“选择曲线”以及测定未知蛋白质样品分子量的方法。
二、原理：凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又叫做分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。
凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。
但这种“过筛”与普通的过筛不一样。
将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
分离过程中的示意见图17-1。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。
凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶，后者的商品名称为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它是个有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水，其化学结构式如图17-2所示。
这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。
在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。
相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。
利用这种性质可分离不同分子量的物质。
为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt（total volume）表示。
实验四 凝胶过滤法测定蛋白 质分子量
五实验注意事项
凝胶要充分溶胀 上柱时凝胶不能有气泡和断层现象 上样时防止凝胶表面被破坏 ，不要滴加 洗脱时速度不能过快，同时防止冲动凝 胶表面（ml/2-3min） 在上不同样品时，凝胶柱床要冲洗干净。
当被分离的物质其分子小于网状凝胶的网孔 时，则分子就进入凝胶内部。洗脱时就会从 一个凝胶颗粒出来而进入另一凝胶颗粒。则 分子所经过的流程较长，如果分子大于凝胶 网孔时，则分子不能进入凝胶网孔而从凝胶 颗粒之间的空隙流出，流程较短。 分子越大 流程越短 最先出来 分子越小 流程越长 最后出来
被分离的物质的分子量的对数（lg）与其 洗脱体积成反比 lgM
分子越大流程越短最先出来分子越小流程越长最后出来被分离的物质的分子量的对数lg与其洗脱体积成反比lgmvev三实验操作方法凝胶溶胀平衡蓝葡聚糖的洗脱体积标准曲线制作cytc牛血清蛋白卵清蛋白一次上样洗脱测定其各蛋白质的ve未知样品测定上样洗脱测定其ve四
实
验
四
凝胶过滤法测定 蛋白质分子量
一、 实验目的与要求
掌握凝胶过滤法分离蛋白质的原理 掌握凝胶过滤法测量蛋白质分子量的原 理 掌握凝胶过滤法分离蛋白质的基本操作 技术
二、实验原理
用于凝胶过滤的凝胶主要有： 葡聚糖凝胶—sephadex 琼脂糖凝胶—sepharose 聚丙烯酰胺凝胶—polyacrimide Gel 凝胶为不溶于水的颗粒状高聚物。颗粒 为三维网状结构。
Ve/V0
三、实验操作方法
凝胶溶胀 装柱 静置
平衡
测定外水体积（V0）
（蓝葡聚糖的洗脱体积）
标准曲线制作
（ cytc、牛血清蛋白、卵清蛋白） (一次上样洗脱测定其各蛋白质的Ve)
未知样品测定
（上样洗脱测定其Ve）
凝胶柱层析分析蛋白质分子量大小
三. 仪器和试剂
柱层析装置 2008 (恒流泵 层析柱 收集器 主机 记录仪等5件套)
分 子实 生验 物 学
四. 操作步骤 装柱：凝胶溶胀后，湿法装柱，以柱床 均匀、无气泡表面平整为佳 系统平衡：连接各装置，用缓冲液洗涤 柱子，并打开检测器，使检测器稳定 上样：分别加标准分子量蛋白质和1ml 血清。 洗脱、记录 结果计算及分析
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2008
二. 实验原理 — 凝胶层析
当某组分的Ka=0时(即Ve=Vo)，说明该组分完全不进入 凝胶颗粒微孔，洗脱时最先流出 若某组分的Ka=1(即Ve=Vo+Vi)时，说明该组分可自由 地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，洗脱时，最后流出 Ka在0-1之间的组分，洗脱时Ka值小的先流出 ，Ka值 大的后流出。在限定的条件下，Vi和Vo都是恒定值 在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用。当洗脱液的 体积等于Vo+Vi时，所有组分都应该被洗脱出来，即Ka 的最大值为1。然而在某种情况下Ka值会大于1。这种反 常现象说 明这一层析过程不是单纯的凝胶层析，其中可 能还夹杂有吸附或离子交换等过程
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二. 实验原理
名称 吸附层析法 分配层析法 分离原理
离子交换层析法
凝胶层析法
固定相是固体吸附剂，组份在 吸附剂表面吸附力不同,疏水力 或静电引力 各组份在流动相和静止液相 （固相）中的分配系数不同， 溶解度 固定相是离子交换剂，各组份 与离子交换剂亲和力不同，离 子间结合力 固定相是多孔凝胶，各组份的 分子大小不同，因而在凝胶上 受阻滞的程度不同，排阻效应
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注意事项 要通过实验合理调整流速、检测器和记录仪的 灵敏度，和记录仪的走纸速度，才能获得良好 的洗脱曲线 若峰有重叠，宜加长柱子，降低流速 若峰间距离过大，峰过宽，宜缩短柱子，加快 流速，降低走纸速度 峰过高，可减少加样量，或降低检测器和记录 仪的灵敏度 峰过低则需加大灵敏度，或加大加样量。
凝胶过滤层析测定蛋白质相对分子质量
凝胶过滤层析测定蛋白质的相对分子质量小组：1 班级：生工1005 学号：020******* 姓名：朱同辉一、实验目的1.了解凝胶过滤层析分离生物分子及测定蛋白质相对分子质量的基本原理2.掌握凝胶过滤层析的基本操作技能二、实验原理凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术，同时也是常用的测定蛋白质相对分子质量的方法。
本实验采用的交联葡聚糖凝胶SephadexG—75的分级范围是3000~80000，相对分子质量在此范围内的蛋白质和其他大分子能够用这种凝胶分离开。
当蛋白质溶液加到层析柱上端并用洗脱剂进行洗脱是，相对分子质量大的蛋白质进入凝胶网孔程度小，所受阻力校，先从层析柱中被洗脱下来：相对分子质量小的蛋白质进入凝胶网孔的程度大，后被洗脱。
从样品上柱开始到某种分子被洗脱下来为止的洗脱液体积称为该分子的洗脱体积（Ve）,在层析条件完全相同的情况下，Ve与相对分子质量的对数（logM）之间存在线性关系。
在测定目标蛋白质相对分子质量之前，先测定几种已知相对分子质量的标准蛋白的洗脱体积Ve，以logM对Ve作图将得到标准曲线。
在同样的条件下测定样品蛋白的Ve，从标准曲线上即可求得相对分子质量。
三、实验步骤1.凝胶溶胀根据层析柱体积确定凝胶的用量，称取SephadexG—75干粉，加过量蒸馏水室温充分膨胀一天，或沸水浴中溶胀3h。
溶胀过程中注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。
待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒，最后凝胶经减压抽气除去气泡，即可准备装柱。
2.装柱与平衡将层析柱垂直固定，连接好底部流出导管，加入缓冲液排除底部空气，关闭出口。
将凝胶上面过多的溶液倾出，调节凝胶稠度在70%左右，沿玻棒往层析柱中加入凝胶基质，让其自然沉淀形成柱床，沉降后的凝胶床面应距离层析柱的顶端5cm左右，连接洗脱缓冲液、恒流泵与层析柱上端。
用2~3倍柱体积的洗脱液通过层析柱使柱床平衡，流速控制在0.5mL/min左右。
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凝胶层析法测蛋白质分子量精选文档TTMS system office room 【TTMS16H-TTMS2A-TTMS8Q8-蛋白质分子量的测定——凝胶层析法一、实验目的1.了解凝胶层析的原理及其应用。
2.通过测量蛋白质分子质量，初步掌握凝胶层析技术。
3.了解洗脱曲线、选择曲线的意义，并学会绘制洗脱曲线、选择曲线。
二、实验原理（一）蛋白质分子量的测定蛋白质是生命过程中最重要的物质之一 , 近年来已成为生命科学领域的研究热点[1]。
分子量是蛋白质的主要特征参数之一, 当发现一种新的蛋白质时, 首先应准确测定其分子量。
蛋白质分子量的测定方法有多种, 如渗透压法、光散射法、超速离心法、凝胶层析法及聚丙烯酰胺凝胶电泳等[2-4]。
（二）凝胶层析法层析法，又称色层分析法或色谱法（Chromatography），在1903-1906年由俄国植物学家首先提出。
虽然近年来质谱技术日益成熟,灵敏度、精确度也为各种方法之首，但是目前在实验室中测量蛋白质分子量应用比较广泛的还是凝胶层析等方法[5]。
凝胶层析法（gel filtration），又叫凝胶过滤法、凝胶渗透色谱法(GPC )、排阻色谱法、凝胶过滤色谱法(GFC)、分子筛层析法（molecular sieve chromatography）等[6]，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。
凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。
但这种“过筛”与普通的过筛不一样。
将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱。
在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
由于其分离条件温和、样品回收率高、实验的重复性高、设备简便经济等特点，是目前最广泛使用的生化物质的分离方法之一，是所有色谱技术中最简单、条件最温和的方法，且完全是基于样品的分子量大小来进行分离的。
虽然其分离效果不及高效液相色谱，但可作为一种初步的分离手段使下一步的纯化达到更好的效果[7]。
（三）凝胶凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，其内部具有很微细的多孔网状结构。
常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成凝胶是葡聚糖（dextran，商品名为SePhadex），凝胶型号不同，孔隙度不同，但都不溶于水。
这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。
在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。
相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。
利用这种性质可分离不同分子量的物质。
（四）测量方法凝胶过滤层析, 是一种分离不同大小分子的分配层析, 被分离物质的分子在溶剂和限定孔径的凝胶固定相中被分配, 混合物随流动相流经层析柱时, 各种物质同时进行着垂直向下的运动和无定向的扩散运动, 混合物中各物质因相对分子质量的大小不同而被分离, 这种方法操作简便, 费用较低, 重复性好[8]。
因其能像筛子一样筛分不同大小的分子，因此又称为“分子筛”。
其具有许多良好的性能，因此在蛋白质的分离分析中被广泛采用。
经过不少人的实际应用和完善，该方法已经变成一种可靠的测定高分子分子量的方法[9]。
将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt（total volume）表示。
Vt由三部分组成，即Vt=Vo+Vi+Vg。
Vo称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相当于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相当于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；Vg为凝胶本身的体积。
而洗脱体积（Ve，elution Volume）与Vo及Vi之间的关系为：Ve=Vo+Kd·ViVe是自加入样品时起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；本实验凝胶层析柱中填充的是交联葡聚糖，含有蛋白的溶液通过管柱时，大分子的蛋白呈正态分布连续首先流出，会形成一个蛋白峰[10]。
Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数，只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关。
Kd可通过实验求得：Kd=（Ve- Vo）/Vi上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（带颜色为佳，便于观察，如血红蛋白、印度黑墨水等，分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等）通过实际测量求出；Vi可由g·WR求得（g 为干凝胶重，单位为克；WR为凝胶的“吸水量”，以毫升/克表示）。
因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实验得知某一物质的洗脱体积Ve，就可算出它的Kd值。
三、实验器材1．试剂（1）标准蛋白质：蓝色葡聚糖-2000（200KD），牛血清清蛋白（67KD），胰凝乳蛋白酶原（），CytC（），均为分析纯。
（2）洗脱液：L Tris-HCl-KCl,O定容至100ml取 KCl 20ml, Tris 25ml, ,再加H2（3）Sephadex G-752.器材（1）层析柱：柱管×50cm（2）紫外分光光度计（3）部分收集器（4）刻度试管四、实验步骤1.凝胶的选择与处理：本实验使用Sephadex G-75凝胶。
商品凝胶一般是干燥的颗粒，使用前需在欲使用的洗脱液中充分溶胀。
即在沸水浴中，将悬浮于洗脱液中的凝胶浆逐渐升温至近沸，一般1～2h即可完成[11]。
根据层析柱的体积和所选用的凝胶，膨胀后床体积计算所需凝胶干粉的重量，然后倾入过量的洗脱液中，室温吸水膨胀。
凝胶颗粒最好大小均匀，这样流速稳定，结果较好。
2.装柱：本实验所用层析柱的规格为×50cm。
（1）将层析柱垂直装好，在柱内先注入1/4～1/5的水，出口处接上一根长约，直径2㎜细塑管，塑管另一端固定在柱的上端约45㎝处。
然后打开机器，排出气泡。
（2）随着下面水的流出，上面不断加凝胶，使形成的凝胶床面上有凝胶的连续下降。
（3）当凝胶沉积到柱的顶端约6㎝处，可停止装柱。
（4）用眼睛观察柱内凝胶是否均匀，有否“纹路”或气泡。
若层析柱不均一，必须重新装柱。
3.加样：加样之前先吸去柱管内的上清液，然后加样。
等到所加的样与凝胶界面相平时，连接恒压瓶、层析柱、部分收集器等装置。
4.洗脱：待上述工作做好之后，开始洗脱。
洗脱时应严格控制流速，以3—4分钟收集3ml液体为宜。
然后用部分收集器按每管3mL收集洗脱流出液，各收集管于280nm处检测A280值。
5.洗脱曲线、标准曲线的制定（1）按上述步骤依次加入蓝色葡聚糖-2000（200KD）、牛血清清蛋白（67KD）、胰凝乳蛋白酶原（）和CytC（），然后用50 mmol/l的KH2PO4-K2HPO4缓冲液溶液洗脱。
待上一个样品在管柱中行进约1/3时再加下一个样。
用部分收集器收集流出液体，然后用紫外分光光度计于280nm 处测定每管A值，以管号或者洗脱体积为横坐标，A值为纵坐标绘出洗脱曲线。
根据洗脱峰位置量出每种蛋白质的洗脱体积Ve。
然后以蛋白质分子量的对数（1gM）为横坐标，Ve为纵坐标，作出标准曲线。
为了结果可靠，应以同样条件重复1-2次，取Ve的平均值作图。
五、实验结果1.洗脱曲线：本实验共依次加入4种分子量已知的蛋白质，分别为A:蓝色葡聚糖-2000（200KD）、B:牛血清清蛋白（67KD）、C:胰凝乳蛋白酶原（）和D:CytC（）。
每3—4分钟收集3ml液体为一管，共收集了25管，每管在280nm处测得的吸光度值A值（即OD值）见表1：表1：每管洗脱液对应的OD值因此，以管号为横坐标，OD值为纵坐标绘制的洗脱曲线见图1：由表1算得4种样品的洗脱体积分别为:Ve(A:蓝色葡聚糖)=(3+×3=Ve(B:牛血清清蛋白）=×3=Ve(C:胰凝乳蛋白酶原）=×3=Ve(D:CytC)=×3=2.标准曲线：以蛋白质分子量的对数（1gM）为横坐标，Ve为纵坐标，作出标准曲线。
表2:各样品洗脱体积和lgM值图1：加入的4种分子量已知的蛋白质的洗脱曲线，由上图可知：分别在第4、8、15和21管时出现峰值。
图2：加入的4种分子量已知的蛋白质的标准曲线六、分析讨论蛋白质是生命过程中最重要的物质之一 , 早已成为生命科学领域的研究热点。
而分子量是蛋白质的主要特征参数之一,故准确测定其分子量意义重大。
凝胶层析法在蛋白质分子量的测定方面，虽然不及聚丙烯酰氨凝胶电泳的灵敏度及准确度高，但因其操作简便、试剂价格较为便宜等优势而受到人们欢迎。
影响分子量测定准确性的因素众多，有一定的局限性。
如缓冲液的pH 值、凝胶的型号、加样时间间隔、顺序，以及收集洗脱液的操作等等都会对实验结果产生影响。
缓冲液的pH值在6-8时，所得的标准曲线的线性较为良好，本实验所用的缓冲液的pH值为，在该范围之内，故在其他操作良好的情况下所得的线性较为良好。
凝胶的型号对分离的准确性产生影响。
比如Sephadex G-100 和Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱, 前者可在前期去除相对分子质量较大的杂蛋白，而后者的分离范围只有1000-30000。
我们的目标蛋白相对分子质量在左右, 故用Sephadex G-100或者Sephadex G-75 可得到较好的分辨率。
加样时间间隔、顺序对结果准确性的影响。
本实验采取加入单一样品的方法，按分子量由大到小加入，并且待上一个样品基本上快要走出柱管时才加下一个样。
分子量大的样品不能进入凝胶内部，在凝胶颗粒之间的缝隙流出，因此速度最快。
从大到小加样，可以保证前一个样品基本上被分离出来，确保了会出现峰值，能得出较为准确的洗脱体积。
分光光度计使用波长为280nm时，是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长。
故本实验测定蛋白质的分子量使用280nm。
七、注意事项1.加样时按分子量由大到小加入，以便于出现峰值和计算洗脱体积。
2.洗脱液的pH值应在6-8得范围内，以保证标准曲线的良好线性。
3.加样之前应赶出管柱内的气泡，并在整个操作过程中都要保证不产生气泡，否则洗脱速度很慢并且结果也不准确。
4.收集洗脱液的速度应严格控制在每3—4分钟收集一管液体（约3m）。
5.分光光度计使用波长为280nm。
6.实验结束，及时清洗整理实验用品，经指导老师同意后才能离开实验室。