胚胎干细胞及其培养建系
胚胎干细胞的培养
胚胎干细胞的体外培养胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES cell)也称ES细胞,是一种存在于着床前早期胚胎中的具有全能性的细胞。
全能性即分化发育成三个胚层的组织细胞的能力。
胚胎干细胞能在体外进行培养传代,保持未分化二倍体状态以及其全能性，具有形成嵌合体动物(chimeric animal)的能力。
胚胎干细胞最早由Evans和Kaufman(1981)两人以及Martin(1981)分别从小鼠早期胚胎中分离培养成功并建立细胞系。
由于其具有全能性,故广泛用于胚胎发育及胚胎工程方面的研究。
例如在培养液中加入不同的分化因子,可定向诱导其分化发育成心肌细胞、淋巴细胞以及神经细胞,甚至可用它培养出器官；可用不同的外源性基因转染胚胎干细胞,或在胚胎干细胞水平上进行基因敲除或基因打靶,经体外筛选后建立带有目的基因的细胞系或将筛选后带有目的基因的胚胎干细胞注射到宿主着床前胚胎内,并移植到假孕母体子宫腔内使之发育成个体。
从而建立转基因动物、基因敲除动物和基因打靶动物，研究基因在分化发育过程中的表达与调控以及制备人类疾病动物模型等。
由于胚胎干细胞在体外培养过程中极易分化和失去正常二倍体核型，进而失去全能性和丧失形成嵌合体动物的能力，故需要特殊的培养条件。
目前, 由于小鼠胚胎干细胞体外培养技术最为成熟，本文将以此为例，较详细地介绍胚胎干细胞体外分离培养和鉴定等实验技术。
一、胚胎干细胞体外培养原理胚胎干细胞体外培养的原则是: 在促进胚胎干细胞增殖的同时，维持其未分化二倍体状态。
胚胎干细胞一旦分化即失去其全能性，失去二倍体正常核型的细胞则会大大降低形成嵌合体(chimera)的能力，特别是进入种系形成生殖细胞的能力。
目前体外培养胚胎干细胞的方法归纳起来有二大类：有饲养层培养法和无饲养层培养法。
有饲养层培养法主要应用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系STO细胞作为饲养细胞；经丝裂霉素-C或γ-射线处理终止其分裂后制备成饲养单层(feeder layer)，将胚胎干细胞种植在这样的单层上。
胚胎干细胞的培养和调控
胚胎干细胞的培养和调控胚胎干细胞是一种具有极高生物学价值的细胞。
它的特点是可以无限制地自我复制，并能够分化成人体内的各种细胞类型，包括心脏细胞、神经细胞、肌肉细胞等。
这使得胚胎干细胞成为了治疗许多疾病的有力工具，例如肌萎缩侧索硬化症、帕金森病、白血病等。
为了能够将胚胎干细胞应用于实际医疗中，必须先要掌握胚胎干细胞的培养和调控方法。
第一部分培养胚胎干细胞胚胎干细胞的培养需要一定的条件，其中最重要的是营养基质和生长因子。
营养基质是指提供细胞培养所需营养物质的培养基，生长因子则是刺激细胞增殖、分化和细胞功能发挥的非细胞因子分子。
经过多年的研究，科学家们已经掌握了许多优化的胚胎干细胞培养方法，不断改进和创新。
胚胎干细胞的培养主要分为两种方式：一种是使用人类免疫缺陷病毒（HIV）携带的重编程因子，使成人普通细胞重新向胚胎干细胞转化，这种方法的优点在于可以避免使用和浪费胚胎，并且可以根据患者自身的细胞进行个性化治疗；另一种是从人类胚胎中提取胚胎干细胞，这种方法的优点在于可以获得自体造血干细胞以及每一个器官的种子细胞，但在实际应用中受到较多的道德和法律争议。
无论哪种方式，胚胎干细胞的培养本质相同，主要包括以下几个步骤：1. 种植选取营养基质，并将干细胞种植在营养基质中。
营养基质需要包含必需氨基酸、维生素和其他生命所需营养元素。
2. 培养维持培养基的稳定状态，将培养器置于恒温室内，控制培养环境的温度、湿度和CO2浓度等。
3. 复制控制胚胎干细胞的倍数，使其以匀速增长的状态进行培养。
此过程中，应将胚胎干细胞分离至新的培养基中，以保证细胞的数量和干细胞的稳定性。
4. 检测定期检测胚胎干细胞的状态，包括细胞分裂速率、分化程度和遗传特征等，以确保其基态的维持和无突变状态的可能。
第二部分调控胚胎干细胞胚胎干细胞的应用广泛，不仅包含了生物学研究的范畴，还拥有丰富的临床应用前景。
在这个方向上，胚胎干细胞的调控成为了必不可少的一环。
人naive胚胎干细胞培养体系总结
人naive胚胎干细胞培养体系总结
人naive胚胎干细胞（hESCs）是一种具有多能性的干细胞，具有无限增殖和自我更新的能力，可以分化成各种细胞类型。
以下是关于人naive胚胎干细胞培养体系的总结：
1. 培养基：人naive胚胎干细胞培养体系需要特殊的培养基，包括维生素C、维生素E、谷氨酰胺、非必需氨基酸、糖、脂肪酸、胰岛素、生长因子等。
其中，维生素C和维生素E是维持hESCs多能性的关键因子。
2. 细胞附着：人naive胚胎干细胞需要在特定的细胞附着物质上生长，这些物质包括胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等。
这些物质可以在培养基中添加或者在培养皿表面涂布。
3. 温度和气体：人naive胚胎干细胞需要在37℃恒温下培养，并且需要5％的CO2和95％的空气（细胞代谢必需的O2）以维持培养基的pH值。
4. 传代：当人naive胚胎干细胞在培养过程中密度过高时，需要进行传代以维持细胞的生长和多能性。
传代过程中需要用胰蛋白酶或EDTA处理细胞，以使其从附着物质上分离下来，然后进行稀释和重种。
5. 分化：人naive胚胎干细胞可以分化成各种细胞类型，包括神经细胞、心肌细胞、胰岛细胞等。
这些细胞可用于治疗各种疾病，如帕金森病、糖尿病等。
总之，人naive胚胎干细胞培养体系需要特殊的条件和技巧，但它们在医学研究和治疗中具有巨大的潜力。
人胚胎干细胞培养手册范本
干细胞之家操作指南运输和保存：人胚胎干细胞〔hESCs和PMEFi被装在含90％FCS和10％二甲基亚砜的冻存管中,hESCs4×105/管,可接种一个3.5cm培养皿〔或六孔板的一个孔,PMEFi4×106/管,可接种一块六孔板。
冻存管用干冰运输,收到后,hESCs投入液氮,PMEFi放入－80℃保存。
培养条件：温度：37±0.5℃CO2浓度：5.1±0.6％相对湿度：85-100%主要技术：1．细胞培养：当进行hESC培养时,总的培养原则必需遵守,所有的操作都应该在相应的细胞培养间和超净台内按无菌技术进行。
此外,通过安装空气处理和过滤设备减少空气颗粒制造一个相对洁净的空间。
当接触和细胞有关的一切试剂和材料时,应该带手套〔包括开冰箱门。
工作间在使用前后要用70％的异丙醇彻底消毒。
2．培养液和材料所有的培养液和试剂在使用前都要用0.2µm的滤膜过滤；培养瓶和TC材料在拿进培养间之前都应该用70％异丙醇消毒。
3．细胞处理为了便于操作,最好不要同时处理两个以上的标本。
操作时,在室温和低CO2的时间不要太长。
所有的细胞离心：室温,500－600g,5分钟。
干细胞之家培养液准备：MEF和hESCs培养液在无菌条件下进行,完成后用0.2µm的滤膜过滤。
当准备hESCs培养液时,保持一致性很重要。
如有可能,尽量使用相同的试剂。
使用满足于附录提供的血清替代品尤为重要。
生长因子应该最后添加,需要强调的是bFGF进行重悬时需要蛋白载体,在少量培养液中不要试图重悬它。
MEF培养液：hESCs培养液：冷冻培养液：90％FCS+10%二甲基亚砜, 0.2µm的滤膜过滤,4℃保存。
明胶准备：用超纯水配制0.1％明胶溶液,加热确保明胶完全溶解,使用前高压或0.2µm 的滤膜过滤。
明胶包被：干细胞之家://stemcell8接种细胞前,用0.1％明胶溶液包被培养皿,37℃至少30分钟,分别用1.5或4ml包被35mm或10cm培养皿。
[胚胎干细胞培养标准化操作规程]培养胚胎干细胞
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[胚胎干细胞培养标准化操作规程]培养胚胎干细胞胚胎干细胞培养标准化操作规程6/28/01目录一、细胞二、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代三、体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板体外分化方法四、移植细胞的准备细胞多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡1、表达绿色荧光蛋白的B5-ES细胞。
由Dr、 Nagy的实验室制备。
2、D3-ATCC; CRL-1934、我们得到时大约传了17代。
3、J1-由Dr、 Jaenish的实验室友情提供。
我们得到时大约传了7－9代。
4、J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr、 Jaenish的实验室友情提供。
5、表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr、 Nagy的实验室提供。
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有ESGRO的高糖培养基来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液。
分装在50ml FALCON管中，，贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS和ESGRO 加入450mlDMEM中制备培养基，μm滤膜过滤。
贮存于4℃。
注：一瓶DMEM是500ml。
贮存液马血清L-谷氨酰胺MEM NEAAHEPESβ-巯基乙醇PESTESGRO复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：1、从液氮中取出一管细胞；2、将冻存管置于37℃水浴中2分钟；3、将细胞转移到一15ml Falcon管中；4、加入5ml ES培养基；5、离心3分钟；6、弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7、接种在明胶包被的6孔或6cm组织培养皿；8、孵育。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化 ...
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）体外分化方法注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
小鼠胚胎干细胞(mES)、小鼠iPS细胞培养Protocol
小鼠胚胎干细胞（mES细胞）、小鼠iPS细胞培养ProtocolMEF细胞铺制：1. 在T25培养瓶中加入0.2%明胶，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱至少放置15min以上。
2. 吸除0.2%明胶，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。
一般地，一个T25培养瓶中加入5ml MEF完全培养液。
3. 按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用KM-r P3 MEF或CF-1 P3 MEF；小鼠iPS使用ICR-rP3 MEF，复苏MEF细胞若干支。
将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
4. 将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1 × 106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后至于37℃细胞培养箱。
24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。
5. 复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全培养液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液待用。
复苏：1. 将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中是之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml小鼠胚胎干细胞，小鼠iPS细胞完全培养液的15ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。
3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液2 ml，吹打悬浮。
4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免起泡。
5. 转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤以下是小鼠胚胎干细胞的培养实验步骤：1.准备培养基和细胞培养器材：-将培养基预热至37摄氏度。
-准备含有培养基的无菌试管、离心管和细胞培养板。
-洗手并戴上合适的培养操作手套。
2.预处理培养皿：-用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）将细胞培养板彻底洗涤，去除残留的培养基和细胞残留物。
-用0.1%胰蛋白酶溶液或0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞培养板上的细胞进行脱落。
-将细胞均匀地分布在预处理的培养皿中，使其形成单层细胞。
3.检查细胞数目和品质：-用显微镜检查细胞的形态和活力。
-用细胞计数计算细胞的数目。
-计算细胞的分裂倍增时间。
4.细胞传代：-按照需要的细胞密度将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿。
-用0.05%胰蛋白酶-EDTA将细胞从培养皿上脱落。
-投入适当比例的培养基到新的培养皿中，使其形成单层细胞。
5.制备小鼠胚胎纤维母细胞：-从小鼠胚胎体内收集纤维母细胞。
- 将纤维母细胞转移到含有DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）和10%胎牛血清的细胞培养皿中。
-培养纤维母细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中直至细胞接触起离皿表面。
6.制备和维持小鼠胚胎干细胞：-转接分裂期的小鼠胚胎干细胞到新的培养皿中。
-用无菌吸管或离心管的尖端轻轻挑取细胞克隆。
-将细胞克隆转移到含有mESC培养基（如DMEM、15%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和1×LIF（小鼠白细胞介素-6）的细胞培养板中。
-在体外细胞培养中维持小鼠胚胎干细胞的自我更新和增殖。
7.细胞培养的常规维护：-定期更换新鲜的培养基。
-检查细胞的形态和活力。
-定期传代细胞，以保持其细胞数目和活力。
-控制培养基和细胞的污染。
以上是小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤，实验过程可能因研究目的和实验室的要求而有所不同。
为了保证实验的准确性和可重复性，建议在实验过程中随时记录和保留实验数据，并使用正确的实验操作和生物安全规范。
胚胎干细胞的培养原理和方法
胚胎干细胞的培养原理和方法胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESCs）的培养是一个复杂且精细的过程，涉及到多个步骤和原则。
以下是胚胎干细胞培养的基本原理和方法：一、培养原理1.多能性维持：胚胎干细胞具有高度的多能性，即它们有能力分化成体内任何类型的细胞。
培养过程中的一个关键点是维持这种多能性，防止细胞分化。
2.培养环境： ESCs需要特定的培养环境，包括合适的温度、pH值、湿度和气体组成（如CO₂水平）。
3.营养和生长因子：培养基需要包含必要的营养物质和生长因子，以支持细胞的生长和多能性维持。
这些生长因子通常包括利钠、胰岛素以及特定的细胞因子。
二、培养方法1.获取胚胎干细胞：通常从早期胚胎（如囊胚）的内细胞团中分离得到。
2.培养基准备：培养基通常包含高葡萄糖DMEM （Dulbecco's Modified Eagle Medium）、胎牛血清（FBS）或者定义的血清替代物、L谷氨酸、非必需氨基酸、抗生素等。
3.生长因子添加：例如添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）来维持多能性。
4.共培养系统：有时使用“给养层”（Feeder Layer）的方法，即在胚胎干细胞下方培养一层辐射灭活的成纤维细胞，以提供必要的支持和营养。
5.无给养层培养：也可使用定义清晰的培养基，不依赖给养层，减少异种蛋白的污染。
6.培养条件控制：保持恒温（通常为37°C）和特定的CO₂水平（通常为5%）。
7.细胞传代：由于ESC会不断增长，需要定期进行传代，避免过度生长和分化。
8.观察和评估：定期检查细胞形态和生长情况，评估是否保持了未分化状态。
三、注意事项1.避免分化：细胞培养过程中要特别注意防止胚胎干细胞的非计划性分化。
2.遗传稳定性：长期培养可能会导致遗传改变，因此要定期检查细胞的染色体和遗传稳定性。
3.伦理问题：胚胎干细胞的研究和应用常伴随着伦理争议，特别是关于胚胎的使用。
这些方法和原则是胚胎干细胞培养的基本框架，但实际操作中可能会根据研究目的和具体条件有所调整。
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。
我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。
细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。
一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。
具体步骤一、ES培养基在LIF存在的条件下维持细胞培养。
二、EB培养基使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
1. 分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）。
2. 纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50 ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15 ml管中离心3分钟。
3. 用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液4. 一个15 cm的细菌培养皿接种4～5x106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。
5. 2天后更换培养基，将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。
弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6. 用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。
1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
7. 形成胚状体需要4天时间。
在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。
这一天被认为是第2步和第3步的分界。
三、ITSFn培养基在最少量培养基中选择神经前体细胞1. 胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基。
2. 并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3. 保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。
4. 观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。
当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。
胚胎干细胞的培养及其影响因素
胚胎干细胞的培养及其影响因素前言胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）是一种高度未分化的、具有发育多潜能性的细胞，可在体外培养扩增、遗传操作，在适当条件下可诱导分化为多种组织细胞，还可与受体胚胎发生嵌合，形成嵌合体，为细胞分化、胚胎发育、肿瘤发生、药物鉴定等方面的深入研究提供了理想的细胞模型，为组织工程、细胞移植、基因治疗等开创了取之不尽、用之不竭的细胞资源。
1981年Evans 和Kaufman 将延迟着床的小鼠囊胚接种在经丝裂霉素C处理的STO（一种已建系的鼠胚成纤维细胞）上，获得了增殖而未分化的内细胞（inner cell mass,ICM ），后经传代克隆，第一个建立了小鼠ES细胞系［1］。
由于小鼠的胚胎干细胞较易发生分化，昆明种属更是如此，成功分离和克隆胚胎干细胞的关键是一方面要促进其分裂增殖，一方面要最大限度抑制其分化。
体外生长的细胞直接生长在培养液中，培养液是细胞分离培养中重要的因素[9]。
胚胎干细胞对体外培养环境的要求更为严格，其很小的变化都会影响胚胎干细胞的增殖和分化。
本课题研究了三种不同培养液对小鼠胚胎干细胞生长的影响，为今后胚胎干细胞建系工作提供一定参考依据。
研究内容与方法1. 材料1.1 实验动物昆明白小鼠。
1.2 主要试剂：PMSG;HCG;DMEM培养液；、无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液；杜氏磷酸盐缓冲液（PBS液）；0.25% 胰酶-ETDA混合液；丝裂酶素C（Mitomycine,Sigma）；胎牛血清（FCS，浙江生物制品厂）；新生牛血清（NBS，天津生物制品厂）；白血病抑制因子；干细胞生长因子；牛胰岛素。
[2]2 小鼠胎儿成纤维细胞的原代培养[3][4][5]2.1 胚胎的获取昆明雌性小鼠选择阴道口粘膜色淡红、略湿润的性成熟母鼠，孕马血清（PMSG）16：00腹腔注射10U，48小时后腹腔注射HCG10U，即与雄鼠按1：1合笼交配。
次日10：00观察母鼠阴道栓有无，阴道口见阴栓（乳白色或淡黄色蜡状物）即记为妊娠0.5 d，并做标记，同时雌雄分笼喂养。
人胚胎干细胞分离培养与纯化
人胚胎干细胞
1.原代培养及纯化
复苏冷冻的胚胎，用G1.3、G2.3序贯培养法培养至囊胚。
将扩张囊胚移入链霉蛋白酶中，在光镜下观察，在透明带即将完全消化溶解之前移出，用DPBS或DMEM-F12液充分洗涤后种植到灭活的鼠胚胎成纤维细胞上。
种植后每隔12 h观察孵出囊胚的贴壁、增殖情况和分化倾向，种植后约36～48 h后换液，随后每天半量换液或根据培养孔内细胞代谢情况予以换液。
原代克隆生长10～14 d时进行初次传代，前5 代细胞采用机械法，即用拉细的玻璃毛细管将细胞团块刮出，再用1 ml注射器针头在体式显微镜下将克隆分散成适当团
块，重新接种到预先种有饲养层的培养皿中，每日换液。
待hES细胞生长稳定后换用0．05％dispase消化细胞，37℃作用3～5 min，吸管轻轻吹打成约含30--50个细胞的小团块，传代培养，每日换液。
2.原代培养及纯化
将hES细胞培养于60mm组织器官培养皿中。
培养皿事先用含有0.1％白明胶包被及加入1 x 106个经放射性照射的MF1鼠胚胎成纤维细胞。
hES细胞用Thomson细胞培养液于37℃、5％二氧化碳培养箱内进行培养至细胞克隆增大，未分化的干细胞克隆在7-10 d左右被轻轻切割成6-8小块，转移到三个培养皿中再进行培养。
胚胎干细胞培养标准化操作规程(SOP)
一、细胞多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。
由Dr. Nagy的实验室制备。
2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。
3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。
我们得到时大约传了7－9代。
4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。
5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。
二、一般培养——维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
培养基ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。
分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS 和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。
贮存于4℃。
注：一瓶DMEM 是500ml。
贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTESGRO复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
胚胎干细胞培养操作规程
胚胎干细胞培养操作规程胚胎干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，具有无限的增殖能力和多能性分化潜能，对于组织再生和疾病治疗具有重要的应用价值。
为了进行胚胎干细胞的培养和扩增，下面给出一份胚胎干细胞培养操作规程。
1. 实验前准备：a. 清洗培养器具：用无菌水洗净培养皿、玻璃器皿和刷子。
b. 预热培养液：根据实验需要预热胚胎干细胞培养基和所需的其他培养液，以确保适宜的温度。
2. 细胞除菌：a. 必要时，用无菌棉签将细胞悬液接种到新的培养皿中。
b. 将枪头含有70％乙醇的吸管对准培养皿，喷洒乙醇并晾干。
c. 将培养皿放置在超净工作台内，进行进一步的消毒和清洁操作。
3. 细胞接种：a. 取出细胞悬液，并与培养基按照比例混合。
b. 将胚胎干细胞悬液均匀地接种到预先涂覆有明胶或者植物凝胶的培养皿上。
c. 确保培养皿中的细胞接种均匀且不过于密集，以便细胞能够自由生长。
4. 细胞培养：a. 将被接种的培养皿置于培养箱中，在37℃和5% CO2的条件下培养。
b. 每天检查和观察细胞的状态和生长情况，观察细胞的形态和数量。
c. 根据需要，定期更换新鲜的培养基。
5. 细胞分离：a. 当细胞达到足够密度时，可使用胰蛋白酶等酶来进行细胞的分离。
b. 向培养皿中加入足够的酶液，并将其均匀地涂抹在细胞上。
c. 在温度适宜的条件下，观察细胞的分离情况，并在适当的时间停止酶的作用。
6. 细胞传代：a. 轻轻将细胞悬液转移到新的培养皿中，避免细胞团的形成。
b. 加入新的培养基，使细胞能够继续生长和分化。
c. 定期观察和记录细胞的生长情况，监测细胞的纯度和分化状态。
7. 储存和保存：a. 使用液氮分装装置将细胞悬液分装到液氮管中。
b. 储存液氮管在液氮罐中，确保细胞的存活和完整性。
c. 定期检查和更新细胞的库存记录，确保细胞的有效使用和管理。
通过以上的操作规程，可以进行有效的胚胎干细胞的培养和扩增工作，为进一步的研究和应用奠定基础。
胚胎干细胞的培养体系综述
胚胎干细胞的培养体系综述摘要：综述胚胎干细胞培养基、有饲养层培养体系和无饲养层培养体系的主要成分，以及无血清胚胎干细胞培养基。
胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESCs，简称ES或EK细胞。
）胚胎干细胞是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺种分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。
无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。
胚胎干细胞研究在美国一直是一个颇具争议的领域，支持者认为这项研究有助于根治很多疑难杂症，是一种挽救生命的慈善行为，是科学进步的表现。
而反对者则认为，进行胚胎干细胞研究就必须破坏胚胎，而胚胎是人尚未成形时在子宫的生命形式。
关键词：胚胎干细胞培养体系培养基1、培养基的主要组成ES细胞培养液的组成是在基础培养基上添加血清、IIF、巯基乙醇，L一谷氨酰胺等成分，并使用饲养层细胞或条件培养基(CM)。
常用的基础培养基为含高糖(4500mg／L)和谷氨酰胺的DMEM。
由于ES细胞来源于分裂增殖非常活跃的早期胚胎细胞，维持其生长代谢所需的营养要充足。
高糖的DMEM可以提高ES细胞的增殖速度，同时又能提供饲养层细胞生长所需的能量。
ES细胞对谷氨酰胺要求较高，它是细胞合成蛋白质与核酸所必需的，由于谷氨酰胺在溶液中易分解，所以使用前须重新加入。
』3一巯基乙醇除了对胚胎细胞的分裂增殖有促进作用外，还可还原血清中的含硫化合物，防止过氧化物对ES细胞的损害。
添加的血清为胎牛血清(FCS)和小牛血清。
血清含有丰富的营养成分，在促进ES细胞增殖方面起到很好的作用，并对ES 细胞的贴壁生长、集落形态有重大影响。
此外它可能含有一些未知的促ES细胞分化的因子，也可能含有微量的血红蛋白和内毒素，会干扰ES细胞的生长。
但高浓度的血清并不利于ES 细胞生长。
不同批次的血清对促进ES细胞生长具有不同的效果。
每个ES细胞系依赖于建系时所用的血清批次，若更换血清，则应以该细胞系为供试细胞，在含有待测血清的培养基上进行传代培(8～10代)和克隆测试，测试合格的血清只适用于该细胞系，若用于其它ES细胞系,则仍可能出现不同的效果。
胚胎干细胞的培养与应用
胚胎干细胞的培养与应用随着科学技术的不断进步，胚胎干细胞已经成为了当今医学研究的热门话题。
那么，什么是胚胎干细胞呢？胚胎干细胞是从受精卵发育而来的一类全能分化干细胞，具有极高的发展潜能和可塑性，能够不断分化为各种不同类型的细胞。
在医学上，胚胎干细胞被广泛应用于组织修复、疾病治疗等方面。
一、胚胎干细胞的培养1. 胚胎干细胞的提取胚胎干细胞的来源主要是人类受精卵和早期胚胎组织。
实际上，胚胎干细胞的提取违反了一些伦理原则，因为需要拆卸一个活生生的胚胎。
因此，在国际上，提取胚胎干细胞的过程和规范都有非常严格的要求。
2. 胚胎干细胞的培养和分化提取到的胚胎干细胞需要进行培养，以维持其生长和发育。
目前，利用培养基、小鼠胚胎等条件进行体外培养的方法比较常见。
培养基中含有不同浓度的各种细胞因子，可以促进胚胎干细胞不断分化为不同类型的细胞。
目前，科学家们已经成功培育出一些实验用的胚胎干细胞系，并利用这些细胞系进行了一些基础研究和实验。
二、胚胎干细胞的应用1. 组织修复胚胎干细胞具有不同类型的分化潜能，能够分化为各种类型的细胞，如心肌细胞、神经细胞、肝细胞等。
这些细胞可以重新修复和再生人体各种组织和器官，包括心脏、脑部、肝脏等。
因此，利用胚胎干细胞实现组织修复已成为医学领域的重要研究方向。
2. 疾病治疗利用胚胎干细胞进行疾病治疗是另一个重要的应用领域。
某些细胞如神经细胞等无法自我修复，其损伤导致的疾病无法治愈。
此时，胚胎干细胞通过分化成相应类型的细胞，能够重新修复并替代受损细胞，从而实现治疗。
例如，利用胚胎干细胞治疗糖尿病、帕金森病等疾病的研究已经有了一些初步进展。
三、胚胎干细胞研究面临的挑战和展望1. 伦理问题胚胎的提取和胚胎干细胞的研究一直是一个伦理和道德问题争议的焦点。
因此，正确认识和解决这些问题，将有助于推动胚胎干细胞研究的发展。
2. 法律法规目前，国际上对胚胎干细胞培育和应用的法律法规比较不一致，这也给胚胎干细胞研究和应用带来了一定的不确定性和局限性。
胚胎干细胞培养标准化操作规程（SOP）
胚胎干细胞培养标准化操作规程（SOP）一、细胞多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。
由Dr. Nagy的实验室制备。
2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。
3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。
我们得到时大约传了7－9代。
4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。
5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。
二、一般培养——维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
培养基ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。
分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS 和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。
贮存于4℃。
注：一瓶DMEM 是500ml。
贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTESGRO复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
胚胎干细胞培养与应用
第四步：合子形成。雌雄原核融合形成合子(受精卵)。
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4．动物排出卵子的成熟程度不同，有的可能是 次级卵母细胞，如猪、羊等；有的可能是初级卵 母细胞，如马、犬等，但它们都要在输卵管内进 一步成熟，当达到减数第二次分裂的中期时，才具 有与精子受精的能力。
分化。对它可以进行冷冻保存，也可以进行遗传改造。
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3、来源：早期胚胎囊胚的内细胞团
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内细胞团：
内细胞团（未分化的细胞）具有很强的分化能力，可 以进一步分裂、分化，形成组织和器官，再逐步发育成个 体。
这些细胞被认为具有全能性，称为胚胎干细胞。
答案 培养液成分
盐类：无机盐和有机盐 营养物质：氨基酸、核苷酸 调节物质：维生素、激素 特有物质：动物血清
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三、胚胎移植
1、胚胎移植成功与否的两个重要条件 （1）同种动物之间进行胚胎移植易于成功。这里的“同种”是指“
同物种”。 （2）供、受体生理状态要相同，为此必须做到：
第三，受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排 斥反应，这为胚胎在受体内的存活提供了可能。 第四，供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联 系，但移入受体的供体胚胎的遗传特性，在孕育过程 中不受任何影响。
5．胚胎早期培养过程中有两次用到了显微镜进行检 查：
①在进行卵母细胞成熟培养前，要抽取卵母细胞第30页，此课件共56页哦
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（1）受精的标志和受精完成的标志分别是什么？
受精的标志是卵黄膜和透明带的间隙出现两个极体； 受精完成标志是雌雄原核融合为合子。
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数是具有贴附能力的细胞(如成纤维细胞、子宫内皮细胞等)
无饲养层培养体系
饲养层细胞分泌的因子难以支持某些ES 细胞的增殖。ES 细胞
也可在无饲养层细胞的环境中建立和维持 ,培养液中添加L IF 因子或使用能分泌L IF 的细胞制备条件培养液均 可
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胚胎干细胞系 不仅是研究细胞分 化的模型,也是研究 某些前体细胞起源 和细胞谱系演变较 理想的精实品课件 验体系。
常用的检测指标有碱性磷酸酶、 OCT24 、细胞特异性表面抗原 (SSEA2l) 等。
测定胚胎干细胞的体内分化能 力是通过制备嵌合体来完成的。
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5.培养
有饲养层培养体系
胚胎干细胞是动物个体发生过程中具有全能性的原始细胞, 维持ES 细胞的不分化状态由细胞内一些结构蛋白和多肽因子进 行内源性调控。体外培养的ES 细胞,接种在饲养层细胞上培养 时可以长时间保持ES 细胞的原初特性。用作饲养层的细胞多
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2.ICM的获取
从着床前的胚泡中分离内细胞团,是 从早期胚胎建立ES 细胞系的先决条件
直接分离法 免疫外科法 延迟着床法
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3.内胚团的离散
分离ICM 时可用吸管将 其从滋养层细胞上转移到胰蛋 白酶微滴中,大约3～5 分钟 ICM 细胞彼此解离。
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4.胚胎干细胞的鉴定
胚胎干细胞具有全能性，可以自我
更新并具有分化为体内所有组织的 能力。
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胚胎干细胞的特点
全能性
无限扩增性 精品课件 遗传稳定性
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1.是生产转基因动物的高效载体
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2.用于疾病治疗
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胚胎干细胞用来克隆治疗技术路线
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1.胚胎采集
分离具有发育全能性的ES 细 胞,要求选择合适阶段的胚胎。采卵 时一般取囊胚。
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*****·***
干细胞 (stem cells, SC)
是一类具有多向分化潜能
和自2 我复制能力的原始的未分化
细胞，是形成哺乳类动物的各组
织器3 官的原始细胞。
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→ 按分化潜能： 按发育状态：
全能干细
胚胎
胞
干细胞
多能干细
成体
胞
干细胞。
单能干细
胞
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当受精卵分裂发育成囊胚 时，内层细胞团（Inner Cell Mass）的细胞即为胚胎干细胞。