鹅掌楸转录组研究及抗寒基因发掘

鹅掌楸转录组研究及抗寒基因发掘
鹅掌楸（Liriodendron chinense Sarg.）属于木兰科鹅掌楸属,是中国特有植物。

鹅掌楸自然分布于我国南方地区海拔1000米的山地林中。

在对其进行引种栽培的过程中,由于抗寒性问题,导致很难在北方地区种植与应用。

目前,尚未开展鹅掌楸的抗寒性分子机制和种质资源的抗寒性评价方面的研究。

本研究通过高通量测序技术,建立鹅掌楸转录组信息库,筛选鹅掌楸不同条件下抗寒相关的差异表达基因,为从基因水平上研究鹅掌楸提供基础信息。

同时结合生理指标测定,对鹅掌楸种质资源从生理水平到基因水平开展抗寒性综合分析,从而发掘其优质资源,更好地开展鹅掌楸种质资源保存与生产利用服务,并为分子遗传育种提供理论依据。

本研究主要得到以下结论:一、开展抗寒性生理指标测定,鉴定出抗寒种源鹅掌楸不同种源的各抗寒生理指标均表现出明显的季节变化。

具体为,鹅掌楸冬季枝条顶芽中的丙二醛含量、可溶性蛋白质含量、SOD活性、可溶性糖含量、脯氨酸含量均高于秋季枝条顶芽,相对电导率和含水量均低于秋季枝条顶芽。

根据测量的生理指标数据,计算出鹅掌楸4个种源的隶属函数值作为抗寒性的综合评价值,对4个鹅掌楸种源的抗寒性进行了综合排序:安徽>浙江>贵州>云南。

对各抗寒生理指标与隶属函数值进行相关性分析,结果显示,相对电导率、含水量均与隶属函数值呈显著性负相关;脯氨酸含量与隶属函数值呈显著性正相关,在今后的鹅掌楸抗寒性评价时,上述指标可以被用作较好的评价指标。

二、建立了鹅掌楸枝条顶芽转录组文库通过转录组测序获得总片段数（clean
reads）为89 832 100条,总碱基数为11.4Gbp,GC含量为46.42%。

其中片段长度大于20个碱基的百分比为96.05%,GC%值为46.75%,说明转录组测序可以用于后续分析。

获得了162092个非冗余Unigene片段,序列信息达到88714395bp,片段大小从201-16808bp不等,N50长度为719bp,N90长度为242bp。

对鹅掌楸转录组Unigene进行功能注释,在162092个Unigene中,1.69%的Unigene在各数据库中均成功注释,28.92%的Unigene至少在一个数据库中成功注释,这为后续准确获得目的基因提供了便利,同时为从基因水平上研究鹅掌楸的低温响应机制奠定基础。

对鹅掌楸两个转录组信息进行差异表达基因筛选,云南种源对比安徽种源,根据差异基因筛选条件qvalue<0.005并且|log2（foldchange）|>1,筛选出611个显著性差异表达基因,其中351个基因上调表达,260个基因下调表达。

对差异表达基因进行GO富集分析,将注释的Unigene分成生物过程和分子功能2个大类27个小类。

其中,执行鹅掌楸生物过程功能的差异表达基因有512条,共注释到13个分类中;执行分子功能有570条差异表达基因,共注释到14个分类中。

对筛选出的差异表达基因进行KEGG富集分析,共有422个差异表达基因在102个KEGG代谢通路上富集。

在差异表达基因最富集的20条代谢通路中,脂肪酸降解（Fatty acid degradation）、精氨酸和脯氨酸代谢（Arginine and proline metabolism）涉及到植物抗寒性变化的生理代谢活动,可能与植物的低温适应性有关。

三、运用数字基因表达谱技术筛选出抗寒相关的差异表达基因采用数字基因表达谱技术,
对表达谱的21个样本进行测序,每个样本均获得0.5G以上的clean bases,每个样本比对到转录组参考序列上的测序获得序列数量均达到该样本测序获得序列总数的90%以上。

通过对获得的7个表达谱数据库按照试验目的进行两两组合,分为七个小组,进行差异基因表达分析。

发掘出了鹅掌楸这一物种在不同种源、不同季节、不同低温处理条件下差异表达的一大批基因,并将差异表达基因分别在GO数据库和KEGG数据库中进行功能富集分析。

研究发现,差异表达基因注释到了一批与植物的冷调节相关的代谢通路上,这些代谢通路主要分为三类:一是冷调节信号传导,主要包括植物激素信号传导（Plant hormone signal transduction）、钙信号通路（Calcium signaling pathway）和MAPK信号转导途径（MAPK signaling pathway）;二是光合作用,包括光合作用天线蛋白（Photosynthesis antenna proteins）和光合作用（Photosynthesis）;三是抗寒生理代谢,包括脂肪酸代谢（Fatty acid metabolism）、不饱和脂肪酸的生物合成（Biosynthesis of unsaturated fatty acid）、精氨酸和脯氨酸代谢（Argnine and proline metabolism）、过氧化物酶体（Peroxsiome）、淀粉和蔗糖代谢（Starch and sucrose metabolism）和β-淀粉酶代谢（Beta-amylase metabolism）等。

同时,发现了鹅掌楸的一大批与冷调节相关的差异表达基因,并结合前人的抗寒基因转录组研究进展,根据基因功能注释信息筛选出了包括注释为AP2,WRKY,MYB,NAC,zinc finger protein,heat shock等在内的26个差异表达Unigene,将候选基因在GenBank中重新进行Blastx同源性比对,获得了上述基因的准确信息。

不同种源抗寒生理指标的差异可能与鹅掌楸基因在一些抗寒生理代谢通路
上的差异表达有关。

四、通过荧光定量试验验证抗寒基因对所选与抗寒相关的26个Unigene进行实时荧光定量PCR检测,选用优化反应体系,分别对待测样品和18SrRNA内参基因做定量PCR,试验数据采用2^-ΔΔCt法进行相对表达量的计算。

7个组合的两组数据的相关性在0.79-0.91之间,可见基因的表达情况与转录组测序的结果表现出一致性,说明转录组测序的结果是准确可靠的。