毛细管电泳技术与药物分析

毛细管电泳技术与药物分析
毛细管电泳技术与药物分析
1.概述
毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)又称高效毛细管电泳(HPCE)或毛细管分离法(CESM)是以高压直流电场为驱动力，内径为25一100μm的弹性石英熔融毛细管柱内荷电粒子按其淌度(mobility)或迁移速度(migrationvelocity)的差异而实现分离的一类液相分离技术。

CE迅速发展于20世纪80年代中后期，可以说是经典电泳技术与现代微柱分离技术完美结合的产物，是分析科学中继气相色谱(gaschromatography)和高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)之后的又一重大进展，它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使细胞分析乃至单分子分析成为可能，并被认为是当代分析科学最具活力的前沿研究课题。

CE具有分离效能高、分析速度快、样品用量少、分析对象广，多模式化和环保等特点，已成为一种重要的分离分析手段，在生物、医药、化工、环保、食品等领域具有广阔的应用前景。

2.毛细管电泳在药物分析中的有关应用
毛细管电泳的药物分析大致可分为三部分：一是原药的定量，原药中杂质的测定、药剂的分析以及对它们的稳定性的评价等以药品质量管理为目的的测试方法。

二是对进入人体内的药物或代谢物的吸收、分布、代谢、排泄等体内动态的研究，即临床药物分析。

三是手性药物的分离分析。

采用CE作为药物分离的手段，首先需要判断分析对象的存在状态，以离子形态存在的样品，一般选择毛细管区带电泳(CZE)分离模式,而非离子状态的样品则选择MECC分离模式。

这两种分离模式都难以达到满意结果时，就有必要考虑在泳动电解液中加入一些能与样品产生相互作用的添加剂，如环糊精或有机溶剂。

在泳动电解液中添加适当的修饰剂使分离效果得到改善也是CE分析的主要特征之一。

手性化合物，是其化合物结构具有左右对称的性质。

它们的化学、物理性质非常相似。

手性化合物尤其是手性药物对映体的分离分析具有非常重要的意义，已成为分析化学领域中广泛研究的课题之一。

2.1. 毛细管电泳技术在中药分析中的应用
2.1. 1 中草药分析的重要意义
中草药分析即对中草药进行质量控制，是选择中草药中具有生理活性的主要化学成分作为标志物，建立其含量测定方法，评价药物的内在质量，衡量其产品质量是否达到要求和稳定。

中草药是中医防病治病的物质基础，也是中华民族独具特色，有潜在源头。

2.1.2 生物碱类
生物碱类成分广泛分布于植物如防己科、麻黄科和毛茛科等，是一类有显著生理活性的药物成分。

生物碱在缓冲体系中大多带有部分正电荷，一般可用毛细管区带电泳（CZE）模式，在一定的pH值下实现分离，有时可加入乙腈、甲醇等有机溶剂以改善电泳流和选择性。

2.1.3 蒽醌类
蒽醌类化合物结构中多有羟基和羧基，用CZE和胶束电动毛细管色谱（MECC）都能分析。

张艳等采用MECC分离模式测定瞿黄液中大黄素、大黄酚、大黄酸和大黄素甲醚的含量。

以对氨基苯磺酸为内标，缓冲液为0.05mol/L SDS、0.1mol/L Tris、0.03mol/L磷酸氢二钠（pH=8.2），温度为25℃，恒定电压25kV，检测波长254nm，结果表明该方法的精密度、线性关系和回收率均较好。

2.1.4 黄酮类
黄酮类成分的基本结构单元为4-苯基苯并吡喃酮。

其衍生物如甲基化产物，羟甲基化产物和糖苷广泛的存在于各种植物中。

黄酮类化合物一般不带电，多用MECC模式分离测定，也可以利用黄酮类化合物含有邻羟基，可与硼砂复合成带电粒子，再用CZE分离模式。

宋秀荣、杨更亮等用高效毛细管电法测定桑叶中的有效成分在熔硅毛细管（58.2cm×75μm，有效长度50.6cm）柱上，以0.02mol/L 硼砂混合缓冲液（pH=8.60）作电解质，电压为20kV，温度30℃，真空进样5s，于254nm处紫外检测，有良好的线性关系，r=0.998，槲皮素、紫槲皮苷和绿原酸的色谱峰达到完全分离。

2.1.5 有机酸类
有机酸类成分解离后带负电荷，以CZE模式分析时，在中性成分后出峰，分
析时间较长。

王德先、赵敬湘等以10mmol/L的硼酸盐与19mmol/L的磷酸盐＋10%乙醇的混合液作为缓冲溶液，pH值在8.86的条件下，测定金银花中有效成分绿原酸的含量，结果绿原酸在0.236～2.008μg/ml范围内呈线形关系，绿原酸含量为2.32%，RSD=2.98%（n=5），效果较好。

2.1.6 皂苷类
皂苷类化合物不带电荷，一般采用MECC分离模式。

杨伟峰，赵维良用胶束毛细管电泳法在缓冲液为含20mmol/L硼酸、20mmol/L硼砂、60mmol/L胆酸钠和20%乙腈的混合溶液，电压20kV，柱温25℃，检测波长203nm，压力进样5s的条件下测定了西洋参中人参皂苷Rb1、Re的含量，Re的线性范围为0.38～
1.65mmol/L，Rb1为0.42～1.76 mmol/L。

加样回收率Re为97.2%，RSD为1.6%（n=5）；Rb1为97.7%，RSD为1.9%（n=5）。

2.1.7 多糖类
糖是生物体内普遍存在的一类重要的化学物质，是植物和动物的能量来源，在很多生命过程中起着重要的作用。

由于糖类多数解离程度十分微弱，且具有较强的亲水性，致使利用样品淌度差异的毛细管区带电泳和利用样品疏水性差异的胶束毛细管电动色谱都难以直接解决糖的分离问题，其次多数糖类不具备很强的紫外和荧光生色团，使分离后的检测有一定困难。

面对这些技术难题人们利用HPCE的特点开展了一些研究。

朱晓琳，马永建等利用多糖溶于水的特征，用水煮醇沉法提取粗多糖并分离单糖及双糖。

然后活性炭除去色素，并用Sevage法去除蛋白。

再加0.05mol/L硼砂溶液-1mg/mL磷酸二氢钾溶液（38:62）溶解进行柱前衍生化，可与多糖生成络合阴离子，在毛细管电泳中进行迁移，而且在200nm 波长处产生一定的吸光度。

在电压20kV，电流178μA，波长200nm，检测时间20min的条件下以苯甲酸0.4mg/100mL为内标物，运用毛细管电泳法测定了西洋参中的多糖。

结果4次进样的内标与多糖峰面积比RSD为1.94％，线性范围为10～40ng。

2.1.8 蛋白质多肽类
蛋白质、多肽类化合物在除等电点以外的pH值条件下带有电荷，因而可以用CZE分离模式进行分离测定。

谢立等对龙眼肉及其混淆品荔枝肉进行蛋白多肽
电泳鉴别，以石英毛细管75μm×60cm，300mmol/L硼酸盐缓冲液（pH=8.5），电压20kV，温度20℃，紫外检测波长200nm为条件，检测了龙眼肉及荔枝肉的酸性、中性、碱性三种提取液中的蛋白质多肽类成分，通过色谱峰时间和强度可明显的将龙眼肉和荔枝肉加以区别。

陈志良等以电解缓冲液为150mmol/L硼酸盐溶液（pH=8.5），电压为20kV，温度20℃，紫外检测波长200nm，重力进样，时间5s为电泳条件，检测了宁夏枸杞和枸杞果实的Tris–甘氨酸蛋白提取液、酸性蛋白提取液、碱性蛋白提取液三种提取液中的蛋白质类成分，结果发现在酸性提取液中，枸杞的果实在19.2min有一双重吸收峰，而宁夏枸杞的果实无此吸收峰。

在中性提取液中，宁夏枸杞的果实在16.0min有一双重吸收峰，而枸杞的果实无此吸收峰。

在碱性提取液中，宁夏枸杞的果实在17.8min有一个吸收峰，而枸杞的果实无此吸收峰。

可以看出两种枸杞果实的HPCE图谱存在显著差异，容易加以区别，可作为中药枸杞子的鉴别方法。

陈振德等以电解缓冲液为30mmol/L硼酸盐溶液（pH=8.5），电压为20kV，温度20℃，紫外检测波长200nm，重力进样，时间5s为电泳条件，对中药酸枣仁及其混淆品的蛋白质进行鉴别，结果发现酸枣仁及其混淆品的高效毛细管电泳的图谱有明显的差异，并且本方法操作简单，需要样品少，重现性好。

2.2 毛细管电泳在临床分析中的应用
临床药物分析是对进入人体内的药物或代谢物的吸收、分布、代谢、排泄等体内动态的研究。

毛细管电泳具有很高的分离效率，所以能够用于药物在生物体液内的检测。

可以仅做简单的前处理后，直接将生物体液注入毛细管内分析。

但是毛细管电泳用于临床分析时，灵敏度不够的现象比较突出，所以超微量进样的同时也要求高灵敏度的检测方法。

同时，萃取、浓缩等常用的前处理方法在CE 分析中也发挥着重要的作用。

用胶束电动毛细管电泳法可测定血样中肝素含量，用于临床药物监控。

用CE可系统地分析血样、尿样和胃液中29种中枢神经系统药物。

以自制碳纤维盘电极柱端安培检测法可测定尿样中异丙嗦的含量。

金琦芸等建立了用固相萃取高效毛细管电泳同时分离分析尿中20种碱性药物与毒物的方法。

尿样以oasis小柱提取，以多沙普伦为内标，150mm。

比磷酸盐+20%甲醇(pH 2.38)为缓冲液。

毒物
最低检测浓度为15~80μg/L。

结果表明本法分离效率高，可用于多种类别的药、毒物的分析，增加检出几率，减少漏检。

为了进行硫代反义寡核昔酸药物癌泰得的药代动力学研究，张鬼等建立了毛细管凝胶电泳测定血浆中癌泰得含量的方法。

样品经强阴离子交换柱除去血浆中的蛋白和油脂，通过反相柱脱盐，再通过渗滤膜除去残留盐分后，以长度为24个碱基的寡核苷酸作为内标，采用毛细管凝胶电泳测定血浆中癌泰得的含量。

2.3 毛细管电泳在药物残留分析中的应用
随着生活水平的不断提高，药物在环境以及食品中的残留问题得到了越来越多的关注。

因此对药物残留分析尤其是兽药在动物性食品中的残留分析提出了更高的要求。

目前，药物的残留分析有多种方法，其中高效液相色谱法应用最广。

但是它存在两方面问题:一，色谱柱容易污染，再生困难，某些色谱固定相比较昂贵，色谱柱寿命短;第二，由于样品中成分比较多，分离困难，且分析时间长，分离效率比较低。

而毛细管电泳具备分离效率高，色谱柱便宜，分析速度快等优点，要求的样品前处理相对简单，适合于药物残留分析。

但是也存在检测灵敏度低的缺点，需要寻找合适的提高检测灵敏度的方法。

Oka等对食品中四环素类抗生素的毛细管电泳法测定做了综述。

张兰等和陈天豹等分别用毛细管电泳一紫外检测法同时测定了螂鱼和蜂蜜中的四环素、金霉素、土霉素、多西环素及氯霉素的含量。

刘波静用毛细管电泳法成功检测了固相萃取后牛奶中的四种抗生素，其检出限为10~20μg/L。

2.4 毛细管电泳在手性药物分析中的应用
手性化合物，是其化合物结构具有左右对称的性质。

它们的化学、物理性质非常相似。

手性化合物尤其是手性药物对映体的分离分析具有非常重要的意义，已成为分析化学领域中广泛研究的课题之一。

这是因为手性药物的两个对映体具有不同的药理和毒理作用。

如人体必需的氨基酸具有L(S)体氨基酸才可能被吸收。

近几十年来，手性化合物的药害事故屡见报道，医药品中比较有名的药害是酞咪多啶酮(Thalidomide)，1957年由联邦德国吕南特尔化学公司首先生产，作为镇静剂应用于临床，此后的几年中，发现许多服用这种药物的早期孕妇，其婴儿
有严重的畸形现象，1961年被禁止使用。

为了研究该药物左右旋体对妊娠的影响，1979年Blashke等人把左右旋体分离后，分别投喂妊娠中的小白兔，发现(S)异构体具有强烈的致畸作用。

这一研究，进一步唤醒了人们对异构体化合物的重视。

为了能准确地了解药效和安全用药，发展和建立简单、快速的手性药物对映体的分离分析方法，并应用于临床研究和医药质量控制，显得日益迫切。

此外，具有手性中心的杀虫剂和除草剂对映体的分离分析同样具有重要意义。

高效液相色谱、气相色谱、毛细管电泳等是常用的手性药物分离方法。

在手性分离中毛细管电泳具有以下优点：很高的分离效率使具有较小分离选择系数的对映体也可以达到满意的分离；可供选择的分离模式多且变换简单，手性选择试剂直接加入载体电解质中，容易通过选用不同的手性选择试剂和改变背景电解质的组成提高分离选择性；手性选择剂的消耗量很少，运行成本较低。

近年来，毛细管电泳在手性分离方面发展十分迅速。

2.4 毛细管电泳在药物制剂成分中的分析
CE特别适用于多组分药物制剂的测定，如：严健等建立了毛细管电泳测定复合维生素B片中维生素Bl、维生素B2、烟酞胺含量的方法。

邹定等用石英毛细管在15min内分离常用感冒药苯丙胺醇、咖啡因、对乙酞氨基酚、异丙安替比林、非那西丁、茶碱、苯巴比妥、马来酸氯苯那敏、阿司匹林、那可丁、布洛芬、双氯酚酸钠和水杨酸，缓冲液为pH 9.0的0. 02mol/L硼酸钠一磷酸氢二钠和0.1mol/L 胆酸钠液，214nm检测，以乙基一对甲苯基巴比妥酸为内标，可对其中9个成分进行定量测定。

泰诺、复方感冒片、复方儿童感冒咳嗽糖浆等制剂中的对乙酸氨基酚、盐酸伪麻黄碱、氢澳酸美沙芬、马来酸氯苯那敏和防腐剂苯甲酸钠，可在石英毛细管上得到分离。

杂质的分析和检测对药物质量控制具有很重要的意义。

Sabbah等用
50mmol/L磷酸缓冲液(pH 2.5)，分离和测定了钾通道阻止剂(3，4一二氨基吡啶和4一氨基吡啶)的所有杂质，且所有己知有关物质均可在0.05%水平检出。

李永民等用毛细管电泳方法分离四环素和它的主要杂质4一差向四环素，脱水四环素，4一差向脱水四环素和2一乙酰基一2一脱酰胺四环素，相对次要的杂质氯四环素和
脱甲四环素也能被分离。

所得结果与HPLC方法进行了比较，表明该方法完全适合于四环素的纯度控制分析。

3 展望
毛细管电泳在中药的分析方面应用上已越来越多，既可结合质谱技术建立药物的指纹图谱，又可进行多种有效成分或指标成分定量，还可用于体内药物分析，开展有效成分研究，将成为中药分析的有力工具。

HPCE技术在生命科学、生化药物和化学药物研究方面，也已较为成熟，可选择多种模式，适用于从无机离子到中性物质，从各类小分子、有机化合物、手性分子到天然大分子的分离分析，应用范围广泛，特别适合于含复杂成分的大量样品的快速分析，其分离效率高于HPLC数十倍。

另外，随着基因组学、蛋白组学、药物基因学以及糖组学成为生命科学的研究热点，毛细管因其分离速度快、效率高、样品用量小等特点也将更多更深入的应用于蛋白质分离、糖分析、DNA测序、手性分离、单细胞分析等领域。

目前，国际上毛细管电泳研究侧重于应用，但方法本身的完善和发展也同样热火朝天。

其中建立新的分离模式和联用技术最为突出。

一般而言，新方法的发展研究难度大，但近些年却有不小的进展，比如建立了阵列毛细管电泳（CAE），亲和毛细管电泳(ACE)，芯片式毛细管电泳(CCE)等。

CCE是一种微型化的超速电泳技术，其研究可能会进一步推开。

CAE的当前目标是实现高速的DNA测序。

联用技术是解决毛细管电泳定性问题的最佳方法，在这方面，最令人兴奋的例子是CE-MS，它已可测定5-10个红细胞中血红蛋白。

此外，CE-NMR也已提出并实现。

发展新的联用技术可能是CE研究中的重大方向之一。