全程服务（六）流式细胞仪周期检测

全程服务（六）流式细胞仪周期检测
大家总是想让自己的实验数据有不动声色的高级感，流式细胞仪检测就是细胞生物学的必备高级技能。

周期实验是检测药物、基因或蛋白对细胞周期影响的一种检测方法，具体要怎么做呢？且听我道来。

实验原理
细胞周期（Cell Cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。

细胞周期分为间期与分裂期两个阶段。

表1 细胞周期
细胞周期特征
间期G1期DNA合成前期
S期DNA合成期
G2期DNA合成后期
分裂期M期有丝分裂前、中、后、末期
G0期分裂结束后暂时离开细胞周
期
流式细胞仪用PI染色法检测细胞周期。

由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N) ,而 G2/ M期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N) ,而S期的DNA 含量介于二倍体和四倍体之间。

PI可以与DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。

因此,通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1/G0 期，S期和G2/M期，获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过软件计算各时相的细胞百分率（如图1所示）
图1 流式周期检测图说明
技术应用
检测异倍体的肿瘤细胞，检测药物、基因或蛋白等对细胞周期的影响。

实验步骤
1. 细胞收集：
取对数生长期的细胞，按1×106cells/ ml以1 ml接种24孔板或2 ml接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，用常规胰酶消化并收集于离心管中，然后用PBS洗涤细胞2-3次，制备成单细胞悬液。

2. 细胞固定：
1000 rpm离心5 min，收集细胞沉淀，弃上清，用PBS洗涤两次后加入250 µl PBS使细胞重悬，再逐滴加入750 µl预冷的无水乙醇（-20℃），使其终浓度为75% 4℃放置过夜固定。

3. 细胞标记：
a) 次日，取出已固定的样品，1000 rpm离心5 min，弃上清，用
1 ml的PBS洗涤两次，加入300 ulRNase A（200 ug/ml溶于PBS ）重悬，37℃消化30min。

b) 加入100 ul溴化乙锭（PI，50ug/ml）工作液，4℃避光孵育30min。

4. 流式分析：
转至流式检测管用流式细胞仪检测，PI用488nm氩离子激光器激发，由630带通滤光片接受，通过FSC/SSC散点图收集细胞，排除粘连细胞和碎片后分析PI荧光直方图上细胞各周期的百分率。

吉玛周期检测实例
由以下检测结果可以得出，siRNA干扰实验组相比比空白和阴性对照组处于S期的细胞数量降低，而处于G1期的细胞数量增加，可见细胞复制受到了阻滞。

图2周期检测
（B，空白细胞组；NC阴性对照组；siRNA干扰组：某基因的干扰序列处理组）。