HPLC法测定氯化血红素片剂的含量
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取对照品 10 mg , 精密称定 , 置 500 mL 容量瓶 中 , 用 0. 1 molΠL 的 NaOH 溶解并稀释至刻度 , 精 密量取对照品的 5 mL 置 100 mL 容量瓶中 , 甲醇稀 释至刻度 。 3 标准曲线和线性范围[4]
取对照品 10 mg , 精密称定 , 置 500 mL 容量瓶 中 , 用 0. 1 molΠL NaOH 溶解至刻度 , 分别取此对 照品的碱液 1 、3 、5 、7 、10 mL 置 100 mL 容量瓶 中 , 用甲醇稀释至刻度 , 进样 20μL , 以浓度为横 坐标 , 峰面积为纵坐标 , 绘制标准曲线 , 用最小二 乘法进行线性回归 , 得线性方程为 y = 179857 x + 21101 = 0. 9998 ; 表明氯化血红素的浓度在 0. 2034 ～2. 034μgΠmL 范围内线性关系良好 。 4 检出限和定量限
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HPLCΠDAD 法测定氯化血红素片剂中氯化血红素 的含量 , 取得了满意的结果 。 1 实验部分 1. 1 仪器与试剂
Shimadzu LC10 Avp 高效液相色谱仪 , CTO210 Avp 检测器 , Class2VP 色谱工作站 , BP211D 电子天 平 ( Sartorius) , PB210pH 计 (sartorius) 。
氯化血红素是一种生物铁[2] , 作为缺铁性贫 血的天然补品及药物原料 , 它能被人体很好的吸 收 , 无毒副作用 , 是现代医学公认的防治缺铁性 贫血 、吸收率高 、效果好的生物铁源 , 无铁腥味 , 不刺激胃肠 , 具有较好应用开发前景 。
图1
目前国内文献报道氯化血红素的含量测定的 方法 , 大 多 采 用 紫 外 分 光 光 度 法[3] , 本 文 采 用
Shimadzu VP2C18 (150 mm ×4. 6 mm) , 流动相 : V (甲醇∶V (乙腈) ∶V (水) ∶V (醋酸) ∶V (吡啶) = 40. 0∶40. 0∶9. 0∶1. 0∶0. 6 ; 流速 1 mLΠmin ; 柱温 : 35 ℃; 检测波长 399 nm ; 进样量 : 20μL 。 2 溶液的制备 2. 1 供试品溶液的制备
甲醇 、乙腈为色谱纯 , 醋酸 、吡啶均为分析 纯 , 水为重蒸水 。
氯化血红素 ( Hematin Chloride) 对照品由 Fluka 公司提供 , 含量 > 98 % ; 氯化血红素片 ( 规格 30 mgΠ片 , 批号 : 020706 , 020707 , 020708) 由新疆华丰 源技术开发公司提供 ; 辅料 : 微晶纤维素 、硬脂酸 镁 、甘露醇等 。 1. 2 色谱条件及测定方法
参考文献[1 ] 李兴春源自 中国生化药物杂志 , 1993 , 4 : 59 [2 ] 于茂泉 , 宫爱君. 上海预防医学杂志 , 2004 , 16 (9) :
424 [3 ] 袁 曦 , 洪 清 , 陈 樱 , 中国药房 , 1994 , 5 (6) : 36 [4 ] 中国药典 (二部) . 2005. Ⅱ: Appendix(附录) VI D
分别供试品溶液和对照品溶液 。分别吸取供试品 溶液和对照品溶液 20μL , 注入色谱仪 , 记录色谱 图 , 按外标法以峰面积计算 , 即得 , 结果见表 1 。
表 1 样品含量测定结果 ( n = 3)
批号
含量测定 (标示量Π%)
020706
98. 67
020707 020708
98. 86 98. 42
取供试品 0. 250 g ( 约相当于氯化血红素 10 mg) , 精密称定 , 置 500 mL 容量瓶中 , 用 0. 1 molΠL
Ξ 基金项目 : 国家中小企业创新基金 (03C26216500444) 项目资助 作者简介 : 霍仕霞 (1983 - ) , 女 , 研究生 ; E2mail : yanming21cn @sohu. com、huoshixia1983 @163. com
第 27 2008
卷增刊 年5月
Chinese
分析试验室 Journal of Analysis
Laboratory
Vol. 27. 2008
Suppl -5
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10. 3 色谱柱的选择 试验中曾选用 YMC2pack ODS2C18 150 mm ×6. 0
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HPLC 法测定氯化血红素片剂的含量
霍仕霞1 , 闫 明 Ξ2 , 黄 毅3 , 张兰兰1 , 刘晓东1
关键词 : 氯化血红素 ; 高效液相色谱法 ; 二极管阵列检测器 ; 含量测定
氯化血红素[1] , 又名氯高铁血红素 , 氯化铁卟 啉 , 氯高铁原卟啉 IX , 高铁原卟啉 , 高铁血红素 等 。从牛血 、羊血及猪血中提取 , 分子式为 C34 H32 ClFeN4O4 , 其结构是一个铁鏊合物 , 性质较稳定 , 结构见图 1 。
(1. 新疆石河子大学药学院 , 石河子 832000 ; 2. 新疆维吾尔医药研究所 , 乌鲁木齐 830049 ; 3. 新疆维吾尔自治区药物研究所 , 乌鲁木齐 830002)
摘 要 : 建立高效液相色谱法测定氯化血红素片中的氯化血红素含量 。采用 Shimadzu VP2C18 (150 mm ×416 mm , 5μm) ; 流动相为 V (甲醇 、乙腈 、水 、醋酸) ∶ V (吡啶) = 4010∶4010∶1910∶110∶016 流速 : 1 mLΠmin ; 柱温 : 35 ℃; 检测波长 : 399 nm。氯化血红素在 012034～21034 μgΠmL 范围内呈良好的线性关系 , r = 019998 , 平均回收率为 96183 % , RSD = 1124 %。本方法可用于该制剂的质量控 制。
10 讨论 10. 1 检测方法的选择
目前国内文献报道氯化血红素的含量测定方 法 , 大多采用紫外分光光度法 , 本实验中采用 HPLCΠDAD 法易于监测氯化血红素中的有关物质 , 为质量标准的制定提供依据 , 故采用 HPLC 法 。 10. 2 溶剂的选择
因氯化血红素溶于碱 , 通过稳定性考察 , 在 碱性条件下 , 氯化血红素有降解产物生成 , 对不 同浓度 NaOH 进行考察 , 结果 0. 1 molΠL 的 NaOH 作为溶剂最佳 , 又考虑到氯化血红素在碱中的稳 定性差 , 故样品配制时 , 先用 0. 1 molΠL 的 NaOH 溶解 , 再用甲醇稀释至所需浓度进行测定 。
(4010∶4010∶1910∶110∶015) (4010∶4010∶1910∶110∶ 016) 的 3 种系统 , 证实第 3 种作为流动相分离效果 最好 , 所以确定以 V (甲醇) ∶V (乙腈) ∶V ( 水) ∶ V (醋酸) ∶V (吡啶) = 4010∶4010∶1910∶110∶016 为本 法的流动相 。
阴性对照溶液的制备 精密移取 0. 1 molΠL 的 NaOH 溶液 5 mL 置 100 mL 容量瓶中 , 甲醇稀释至 刻度 , 作为阴性对照溶液 , 在相同的色谱条件下 , 进样 20μL , 得色谱图见图 2 。
图 2 对照品 (a) 、供试品 (b) 、阴性对照 (c) 色谱图
9 氯化血红素片剂含量测定 精密量取供试品和对照品 , 按溶液制备项下
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第 27 卷增刊 2008 年 5 月
Chinese
分析试验室 Journal of Analysis
Laboratory
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的 NaOH 溶解并稀释至刻度 , 精密量取对照品的 5 mL 置 100 mL 容量瓶中 , 甲醇稀释至刻度 。 2. 2 对照品溶液的制备
取同一批号已测含量的样品 (批号 020707) , 按供试品制备项下制备供试品 , 称样量减半 , 在 线性范围内选取高 、中 、低浓度分别为 3 、5 、7 mg 3 个浓度 , 按供试品制备项下操作 , 进样量 20μL ,
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结果平均回收率为 96. 83 % , RSD = 1. 24 % ( n = 6) 。 8 空白对照实验
在选定色谱条件下 , 按 SΠN 为 3 时 , 对最低检 测限进行测定 , 得氯化血红素的检测限为 72 ngΠ mL ; SΠN 为 10 时 , 对最低检出限进行测定 , 得氯 化血红素的定量限为 164 ngΠmL 。 5 精密度试验 (重复性 、中间精密度) 5. 1 重复性
在相同操作条件下同一人在短时间内测定结 果的精密度 。配制 3 个不同浓度的供试品溶液 , 每 个浓度下取 3 份供试品 , 进行含量测定 , 结果 RSD 为 0. 22 %。 5. 2 中间精密度 (重复性 、中间精密度 、重现性)
分别不同日期 、不同的操作人员 、不同的设 备下测定氯化血红素片剂的含量 , 结果 RSD 分别 为 1. 56 %、0. 44 %、0. 28 %。 6 稳定性试验
取“2. 1”项下氯化血红素的对照品溶液 , 在配 制当天每隔 0 、1 、2 、4 、8 、10 h 进样 1 次 , 考察 日内差异 , RSD 为 1. 59 % ( n = 6) ; 并于配制后连 续 3 天进样 , 考察日间差异 , RSD 为 1. 79 % ( n = 4) 。 7 回收率实验
5μm ; ShimadzuVP2C18 150 mm ×4. 65 μm 和 YMC2 pack ODS2C18 150 mm ×4. 6 5μm 进行分离试验 。结 果 Shimadzu VP2C18 150 mm ×4. 65 μm 分离效果最 佳。 10. 4 流动相的选择
氯化血红素是一个含有两个羧基的酸性化合 物 , 因此流动相的选择对分离测定具有非常大的 影响 。比较了 V (甲醇) ∶V (乙腈) ∶V (水) ∶V (醋酸) ∶V (吡啶) 的比例分别为 4010∶4010∶1910∶110∶014)
取对照品 10 mg , 精密称定 , 置 500 mL 容量瓶 中 , 用 0. 1 molΠL NaOH 溶解至刻度 , 分别取此对 照品的碱液 1 、3 、5 、7 、10 mL 置 100 mL 容量瓶 中 , 用甲醇稀释至刻度 , 进样 20μL , 以浓度为横 坐标 , 峰面积为纵坐标 , 绘制标准曲线 , 用最小二 乘法进行线性回归 , 得线性方程为 y = 179857 x + 21101 = 0. 9998 ; 表明氯化血红素的浓度在 0. 2034 ～2. 034μgΠmL 范围内线性关系良好 。 4 检出限和定量限
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HPLCΠDAD 法测定氯化血红素片剂中氯化血红素 的含量 , 取得了满意的结果 。 1 实验部分 1. 1 仪器与试剂
Shimadzu LC10 Avp 高效液相色谱仪 , CTO210 Avp 检测器 , Class2VP 色谱工作站 , BP211D 电子天 平 ( Sartorius) , PB210pH 计 (sartorius) 。
氯化血红素是一种生物铁[2] , 作为缺铁性贫 血的天然补品及药物原料 , 它能被人体很好的吸 收 , 无毒副作用 , 是现代医学公认的防治缺铁性 贫血 、吸收率高 、效果好的生物铁源 , 无铁腥味 , 不刺激胃肠 , 具有较好应用开发前景 。
图1
目前国内文献报道氯化血红素的含量测定的 方法 , 大 多 采 用 紫 外 分 光 光 度 法[3] , 本 文 采 用
Shimadzu VP2C18 (150 mm ×4. 6 mm) , 流动相 : V (甲醇∶V (乙腈) ∶V (水) ∶V (醋酸) ∶V (吡啶) = 40. 0∶40. 0∶9. 0∶1. 0∶0. 6 ; 流速 1 mLΠmin ; 柱温 : 35 ℃; 检测波长 399 nm ; 进样量 : 20μL 。 2 溶液的制备 2. 1 供试品溶液的制备
甲醇 、乙腈为色谱纯 , 醋酸 、吡啶均为分析 纯 , 水为重蒸水 。
氯化血红素 ( Hematin Chloride) 对照品由 Fluka 公司提供 , 含量 > 98 % ; 氯化血红素片 ( 规格 30 mgΠ片 , 批号 : 020706 , 020707 , 020708) 由新疆华丰 源技术开发公司提供 ; 辅料 : 微晶纤维素 、硬脂酸 镁 、甘露醇等 。 1. 2 色谱条件及测定方法
参考文献[1 ] 李兴春源自 中国生化药物杂志 , 1993 , 4 : 59 [2 ] 于茂泉 , 宫爱君. 上海预防医学杂志 , 2004 , 16 (9) :
424 [3 ] 袁 曦 , 洪 清 , 陈 樱 , 中国药房 , 1994 , 5 (6) : 36 [4 ] 中国药典 (二部) . 2005. Ⅱ: Appendix(附录) VI D
分别供试品溶液和对照品溶液 。分别吸取供试品 溶液和对照品溶液 20μL , 注入色谱仪 , 记录色谱 图 , 按外标法以峰面积计算 , 即得 , 结果见表 1 。
表 1 样品含量测定结果 ( n = 3)
批号
含量测定 (标示量Π%)
020706
98. 67
020707 020708
98. 86 98. 42
取供试品 0. 250 g ( 约相当于氯化血红素 10 mg) , 精密称定 , 置 500 mL 容量瓶中 , 用 0. 1 molΠL
Ξ 基金项目 : 国家中小企业创新基金 (03C26216500444) 项目资助 作者简介 : 霍仕霞 (1983 - ) , 女 , 研究生 ; E2mail : yanming21cn @sohu. com、huoshixia1983 @163. com
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10. 3 色谱柱的选择 试验中曾选用 YMC2pack ODS2C18 150 mm ×6. 0
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HPLC 法测定氯化血红素片剂的含量
霍仕霞1 , 闫 明 Ξ2 , 黄 毅3 , 张兰兰1 , 刘晓东1
关键词 : 氯化血红素 ; 高效液相色谱法 ; 二极管阵列检测器 ; 含量测定
氯化血红素[1] , 又名氯高铁血红素 , 氯化铁卟 啉 , 氯高铁原卟啉 IX , 高铁原卟啉 , 高铁血红素 等 。从牛血 、羊血及猪血中提取 , 分子式为 C34 H32 ClFeN4O4 , 其结构是一个铁鏊合物 , 性质较稳定 , 结构见图 1 。
(1. 新疆石河子大学药学院 , 石河子 832000 ; 2. 新疆维吾尔医药研究所 , 乌鲁木齐 830049 ; 3. 新疆维吾尔自治区药物研究所 , 乌鲁木齐 830002)
摘 要 : 建立高效液相色谱法测定氯化血红素片中的氯化血红素含量 。采用 Shimadzu VP2C18 (150 mm ×416 mm , 5μm) ; 流动相为 V (甲醇 、乙腈 、水 、醋酸) ∶ V (吡啶) = 4010∶4010∶1910∶110∶016 流速 : 1 mLΠmin ; 柱温 : 35 ℃; 检测波长 : 399 nm。氯化血红素在 012034～21034 μgΠmL 范围内呈良好的线性关系 , r = 019998 , 平均回收率为 96183 % , RSD = 1124 %。本方法可用于该制剂的质量控 制。
10 讨论 10. 1 检测方法的选择
目前国内文献报道氯化血红素的含量测定方 法 , 大多采用紫外分光光度法 , 本实验中采用 HPLCΠDAD 法易于监测氯化血红素中的有关物质 , 为质量标准的制定提供依据 , 故采用 HPLC 法 。 10. 2 溶剂的选择
因氯化血红素溶于碱 , 通过稳定性考察 , 在 碱性条件下 , 氯化血红素有降解产物生成 , 对不 同浓度 NaOH 进行考察 , 结果 0. 1 molΠL 的 NaOH 作为溶剂最佳 , 又考虑到氯化血红素在碱中的稳 定性差 , 故样品配制时 , 先用 0. 1 molΠL 的 NaOH 溶解 , 再用甲醇稀释至所需浓度进行测定 。
(4010∶4010∶1910∶110∶015) (4010∶4010∶1910∶110∶ 016) 的 3 种系统 , 证实第 3 种作为流动相分离效果 最好 , 所以确定以 V (甲醇) ∶V (乙腈) ∶V ( 水) ∶ V (醋酸) ∶V (吡啶) = 4010∶4010∶1910∶110∶016 为本 法的流动相 。
阴性对照溶液的制备 精密移取 0. 1 molΠL 的 NaOH 溶液 5 mL 置 100 mL 容量瓶中 , 甲醇稀释至 刻度 , 作为阴性对照溶液 , 在相同的色谱条件下 , 进样 20μL , 得色谱图见图 2 。
图 2 对照品 (a) 、供试品 (b) 、阴性对照 (c) 色谱图
9 氯化血红素片剂含量测定 精密量取供试品和对照品 , 按溶液制备项下
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第 27 卷增刊 2008 年 5 月
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的 NaOH 溶解并稀释至刻度 , 精密量取对照品的 5 mL 置 100 mL 容量瓶中 , 甲醇稀释至刻度 。 2. 2 对照品溶液的制备
取同一批号已测含量的样品 (批号 020707) , 按供试品制备项下制备供试品 , 称样量减半 , 在 线性范围内选取高 、中 、低浓度分别为 3 、5 、7 mg 3 个浓度 , 按供试品制备项下操作 , 进样量 20μL ,
— 228 —
结果平均回收率为 96. 83 % , RSD = 1. 24 % ( n = 6) 。 8 空白对照实验
在选定色谱条件下 , 按 SΠN 为 3 时 , 对最低检 测限进行测定 , 得氯化血红素的检测限为 72 ngΠ mL ; SΠN 为 10 时 , 对最低检出限进行测定 , 得氯 化血红素的定量限为 164 ngΠmL 。 5 精密度试验 (重复性 、中间精密度) 5. 1 重复性
在相同操作条件下同一人在短时间内测定结 果的精密度 。配制 3 个不同浓度的供试品溶液 , 每 个浓度下取 3 份供试品 , 进行含量测定 , 结果 RSD 为 0. 22 %。 5. 2 中间精密度 (重复性 、中间精密度 、重现性)
分别不同日期 、不同的操作人员 、不同的设 备下测定氯化血红素片剂的含量 , 结果 RSD 分别 为 1. 56 %、0. 44 %、0. 28 %。 6 稳定性试验
取“2. 1”项下氯化血红素的对照品溶液 , 在配 制当天每隔 0 、1 、2 、4 、8 、10 h 进样 1 次 , 考察 日内差异 , RSD 为 1. 59 % ( n = 6) ; 并于配制后连 续 3 天进样 , 考察日间差异 , RSD 为 1. 79 % ( n = 4) 。 7 回收率实验
5μm ; ShimadzuVP2C18 150 mm ×4. 65 μm 和 YMC2 pack ODS2C18 150 mm ×4. 6 5μm 进行分离试验 。结 果 Shimadzu VP2C18 150 mm ×4. 65 μm 分离效果最 佳。 10. 4 流动相的选择
氯化血红素是一个含有两个羧基的酸性化合 物 , 因此流动相的选择对分离测定具有非常大的 影响 。比较了 V (甲醇) ∶V (乙腈) ∶V (水) ∶V (醋酸) ∶V (吡啶) 的比例分别为 4010∶4010∶1910∶110∶014)