谷氨酸致脑缺血再灌注损伤中钙超载的信号转导机制

谷氨酸致脑缺血再灌注损伤中钙超载的信号转导机制
柳四新;何丹;余孝君;王家祺
【摘要】目的观察谷氨酸所致脑缺血再灌注的钙超载损伤,探究谷氨酸参与调控钙超载的分子机制.方法建立大鼠脑缺血再灌注模型以及体外培养小鼠的小脑颗粒神经元,随机分组:对照组(5只)、二甲基亚砜溶剂组(3只)、谷氨酸组(5只)、硝苯地平组(4只)、谷氨酸+硝苯地平组(4只)、TRPC1中和性抗体组(5只)、谷氨酸
+TRPC1中和性抗体组(5只).采用干湿重法测定大鼠脑水肿程度,采用激光共聚焦显微镜fura-2探针检测神经元细胞内Ca2+水平.结果在大鼠MCAO模型中,谷氨酸明显增加脑水肿(P＜0.05),硝苯地平显著抑制由谷氨酸引起的脑水肿(P＞0.05),而TRPC1中和性抗体无此效应(P＜0.05).在体外神经元培养中,谷氨酸显著增加细胞内Ca2+水平,而硝苯地平能降低由谷氨酸引起的神经元内Ca2+升高,差异有统计学意义(P＜0.05);TRPC1中和性抗体只能部分降低谷氨酸引起的神经元内Ca2+升高,差异无统计学意义(P＞0.05).结论谷氨酸在脑缺血再灌注中所致钙超载,主要通过L-型钙通道钙内流后激活钙库释放,最终导致脑水肿.钙库调控的TRPC1通道不参与谷氨酸所致的钙超载.
【期刊名称】《中国医药导报》
【年(卷),期】2016(013)007
【总页数】4页(P20-23)
【关键词】大脑中动脉栓塞;谷氨酸;细胞内Ca2+;L-型钙通道
【作者】柳四新;何丹;余孝君;王家祺
【作者单位】长沙市第一医院神经内科,湖南长沙410005;长沙市第一医院神经内科,湖南长沙410005;长沙市第一医院神经内科,湖南长沙410005;长沙市第一医院神经内科,湖南长沙410005
【正文语种】中文
【中图分类】R743.31
［Abstract］Objective To observe calcium overload in cerebral ischemia reperfusion injury caused by glutamic acid and investigate glutamic acid molecular mechanism involved in the regulation of calcium
overload.Methods Middle cerebral artery occlusion（MCAO）rats model and in vitro cultivation of cerebellar granule neurons in mice were built，random allocation:control without any treatment（n=5），DMSO solvent （n=3），Glu treated with 30 mmol/L glutamate（n= 5），L-calcium channel inhibitor nifedipine（n=4），30 mmol/L glutamate plus nifedipine （n=4），TRPC1 inhibitor（n= 5），30 mmol/L gulatmate plus TRPC1 inhibitor（n=5）.Brain hemisphere edema was detected with dry and wet weight method，and intracellular calcium concentration［Ca2+］was investigated with probe fura-2 by fluorescence confocal fluorescence microscopy.Results In MCAO model，glutamate significantly increased brain edema（P＜0.05），and L-calcium channel inhibitor nifedipine significantly decreased brain edema by gulatmate（P＜0.05），however，TRPC neutralizing antibody had no effect（P＜0.05）.In cultured neuron cell in vitro，enhance of（［Ca2+］）induced by glutamate was inhibited by nifedipine，however，L-calium cnannel in hibitor nifedipine
significantly decreased the rise of intracellular （Ca2+）caused by glutamic acid，the difference was statistically significant（P＜0.05），however，TRPC neutralizing antibody could only partly decrease the rise of intracellular（［Ca2+］）caused by glutamic acid，the difference was not statistically significant（P＞0.05）.Conclusion Calcium overload induced by glutamate toxicity in middle cerebral artery occlusion mainly activate calcium by L-calcium in calcium channel flow after the release and eventually lead to brain edema，but calcium library regulation of TRPC1 channel doesn't participate in calcium overload in cerebral ischemia reperfusion injury caused by glutamic acid.
［Key words］Middle cerebral artery occlusion；Glutamate；Intracellular ［Ca2+］；L-calcium channel
脑水肿的发生和发展是脑缺血再灌注的重要病理生理过程，有许多因素参与这一过程，主要与谷氨酸过高和钙超载相关［1-3］。

谷氨酸是中枢神经系统中最重要的兴奋性神经递质之一，是脑缺血再灌注损伤的重要致病原因，其主要与细胞内钙超载相关［4-5］，然而钙超载则因为细胞内复杂的钙通道而异常复杂，细胞内钙离子（Ca2+）本身也是细胞内重要的第二信使［6-8］，但具体分子机制尚未见报道。

瞬时感受器电位1型（TRPC1）是细胞膜上Ca2+库控-Ca2+通道
（Ca2+storeoperated Ca2+channels，SOCs）的主要组件，调节细胞内Ca2+库存储总量，Ca2+库存储总量减少能激活TRPC1介导Ca2+进入细胞内质网。

神经元中高表达Cav1.2和TRPC1［9-13］，然而具体参与脑缺血再灌注中谷氨酸
所致钙超载机制尚不明确。

本研究在大鼠脑缺血再灌注模型和体外培养的小脑颗粒神经元中，观察谷氨酸致脑缺血再灌注钙超载效应，并联合L-型钙通道抑制剂硝
苯地平和TRPC1中和性抗体，探讨谷氨酸引起细胞内Ca2+超载作用的分子机制，
为临床上脑缺血再灌注的病理生理学提供理论依据。

1.1 一般材料
健康雄性250～300 g SD大鼠［合格证号：SCXK（豫）2005-0001］；7 d龄
新生CD-1小鼠；谷氨酸、多聚赖氨酸、硝苯地平均购自于Sigma公司，马血清、DMEM培养液和胰蛋白酶购自于Gibco公司，荧光探针fura-2购自于Invitrogen公司。

TRPC1中和性抗体购自于Santa Cruz公司。

1.2 脑缺血再灌注模型的建立与脑水肿测定
SD大鼠，术前禁食12 h。

对照组（5只），手术暴露，分离颈总动脉、颈内动脉，采用改良Longa线栓法经颈内动脉栓塞大脑中动脉2 h，栓塞大脑中动脉2 h后
拔出栓塞线再灌注24 h［3］。

谷氨酸组（5只）在脑缺血再灌注模型建立前20 min采用侧脑室注射的方法注射30 mmol/L谷氨酸，二甲基亚砜（DMSO）溶剂组（3只），L-型钙通道抑制剂硝苯地平组（4只）和TRPC1中和性抗体组（5只）处理方式相同；谷氨酸+硝苯地平组（4只）、谷氨酸+TRPC1中和性抗体组（5只）均在谷氨酸处理前15 min给予侧脑室注射处理。

脑水肿的测定采用经典的干湿重法，含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%，断头取缺血半脑和对照半脑称湿重后转移至真空100℃恒温箱中，48 h后称量为干重。

1.3 神经元原代培养
CD-1小鼠小脑颗粒神经元原代培养方法。

取出生7 d的CD-1小鼠，断头后小心剥离小脑颗粒神经元，接种于24孔板和96孔板及多聚赖氨酸孵育4 h的盖玻片上，无血清DMEM培养基37℃，5%CO2培养箱24 h。

换成含10%马血清的DMEM培养基。

1.4 细胞内Ca2+水平的检测
采用成熟分化的神经元细胞于盖玻片上，采用Ca2+荧光探针fura-2（1∶1000）孵育30 min，应用共聚焦显微镜（OLYMPUS）成像，激发光550 nm，发射光
340 nm 和380 nm，间隔20 s激光扫描一次，至刺激因素处理开始共观察15 min，检测45个循环。

采用340 nm/ 380 nm比值计算细胞内Ca2+水平动态变化。

1.5 统计学方法
所有数据采用SPSS 17.0统计学软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示。

计量资料组间采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 脑缺血再灌注中谷氨酸所致脑水肿
在脑缺血再灌注模型中，对照组的缺血半脑含水量明显高于对照半脑（P＜0.05）。

30 mmol/L谷氨酸所致缺血半脑脑水肿严重，其含水量高达85.69%（P＜0.05）。

L-型钙通道抑制剂硝苯地平联合谷氨酸组的缺血半脑含水量显著低于谷氨酸组的缺血半脑含水量（P＞0.05），而TRPC1中和性抗体联合谷氨酸组的缺血半脑含水
量与谷氨酸组的缺血半脑含水量相当（P＜0.05）。

硝苯地平和TRPC1中和性抗
体缺血半脑含水量与对照半脑含水量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

见表1。

2.2 细胞内Ca2+水平
采用Ca2+荧光探针fura-2在共聚焦荧光倒置显微镜检测，荧光图见图1。

其结
果显示，在无任何处理的对照组中，细胞内Ca2+水平无明显变化。

而30
mmol/L谷氨酸处理组，则在给予谷氨酸刺激时间点开始，细胞内Ca2+水平明显上升，在早期上升幅度大约为90%，差异有统计学意义，后期细胞内Ca2+水平
逐渐降低，10～15 min恢复至基线细胞内Ca2+水平。

0～10 min之间的细胞内Ca2+水平，谷氨酸处理组与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

见
图2。

2.3 谷氨酸所致钙超载与L-型钙通道
采用L-型钙通道抑制剂硝苯地平联合谷氨酸，细胞内Ca2+水平变化与对照组结果相似，差异无统计学意义（P＞0.05），而与谷氨酸组比较差异有统计学意义（P ＜0.05）。

见图3。

2.4 谷氨酸所致钙超载与TRPC1通道
采用TRPC1中和性抗体联合谷氨酸，细胞内Ca2+水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），而与谷氨酸组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

见图4。

研究表明，脑缺血再灌注、脑卒中和老年性痴呆是常见的中枢神经系统疾病，具有高致残率和高致死率，严重威胁人类生活质量。

缺血再灌注所致的水肿，常因冰法脑疝或者引起严重的中线结构移位，成为脑缺血再灌注所致损伤在短期内发生死亡的首要原因［14-16］。

细胞源性是脑水肿最常见也是最严重的致病因素。

谷氨酸毒性作用易造成神经元不同程度的损伤和死亡，而神经元不可再生特性决定了使用药物治疗和预防谷氨酸毒性作用的重要性［4-5，17］。

谷氨酸是中枢神经系统重要的兴奋性神经递质。

谷氨酸可以通过与NMDA谷氨酸受体结合，引起细胞内Ca2+增加造成钙超载［6，18］，然而具体相关Ca2+通道尚未明确。

细胞内Ca2+超载具有多种原因，需要从细胞内Ca2+调节研究入手。

细胞内
Ca2+以Ca2+波形式传播，而Ca2+波的形成依赖于内质网钙库的释放和再充。

调节细胞内Ca2+波以及钙库释放和再充主要是 SOCs和L型Ca2+通道［8］。

TRPC1是细胞膜上SOCs的主要蛋白，与小窝蛋白结构相关，共同发挥调节细胞内外Ca2+的调节作用。

尤其是调节细胞内Ca2+库存储总量，Ca2+库存储总量减少能激活TRPC1介导Ca2+进入细胞内质网。

结果显示，L-型钙通道参与调控谷氨酸的钙超载，最终致脑水肿。

谷氨酸可能是通过活化细胞膜表面的Gluk2受体，激活细胞膜上的L-型钙通道，从而细胞外Ca2+进入细胞内，从而介导了细胞内钙库的RYR受体，RYR受体活化后释放钙库中的大量Ca2+，细胞内Ca2+瞬
间释放增加，导致细胞内钙超载［2，19］。

本研究应用谷氨酸处理制作脑缺血再灌注钙超载的动物模型和细胞模型，分别应用L-型钙通道抑制剂硝苯地平和TRPC1中和性抗体，从细胞维度和动物维度均证实L-型钙通道主要参与过高谷氨酸所致的钙超载和脑水肿病理生理过程中，而TRPC1并无相似效益，这为临床上治疗脑缺血再灌注中的脑水肿和钙超载提供新的治疗策略和理论依据。

【相关文献】
［1］Vaarmann A，Kovac S，Holmstrm KM，et al.Dopamine protects neurons against glutamate-induced excitotoxicity［J］. Cell Death Dis，2013，10（4）：e455.
［2］王超，韩博，丁晓洁.七叶皂苷钠对大鼠脑缺血再灌注损伤SOD的影响［J］.中国医药导报，2007，4（6）：18-19.
［3］Yan X，Jiang E，Gao M，et al.Endogenous activation of presynaptic NMDA receptors enhances glutamate release from the primary afferents in the spinal dorsal horn in a rat model of neuropathic pain［J］.J Physiol，2013，591（Pt7）：2001-2019.
［4］Park SY，Jung WJ，Kang JS，et al.Neuroprotective effects of iso-cubebene against glutamate-induced damage in the HT22 hippocampal neuronal cell line ［J］.Int J Mol Med，2015，35（2）：525-532.
［5］Borisova T，Nazarova A，Dekaliuk M，et al.Neuromodulatory properties of fluorescent carbon dots：effect on exocytotic release，uptake and ambient level of glutamate and GABA in brain nerve terminals ［J］.Int J Biochem Cell Biol，2015，59：203-215.
［6］李亮，龙俊，王知非.Apelin-13对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织脑源性神经营养因子及受体表达的影响［J］.中国医药导报，2014，11（4）：22-24.
［7］Han F，Fukunaga K.Beta-amyloid accumulation in neurovascular units following brain embolism［J］.J Pharmacol Sci，2009，111（2）：101-109.
［8］Bernard-Marissal N，Sunyach C，Marissal T，et al.Calreticulin levels determine onset of early muscle denervation by fast motoneurons of ALS model mice
［J］.Neurobiol Dis，2015，73：130-136.
［9］Domínguez-Alonso A，Valdés-Tovar M，Solís-Chagoyán H，et al.Melatonin stimulates dendrite formation and complexity in the hilar zone of the rat hippocampus：participation of the Ca/Calmodulin complex［J］.Int J Mol Sci，2015，16（1）：1907-
1927.
［10］Sun X，Zhong J，Wang D，et al.Increasing glutamate promotes ischemia reperfusion induced ventricular arrhythmias in rats in vivo［J］.Pharmacology，2014，93（1-2）：4-9.
［11］宋程光，杨鑫，闵连秋，等.原花青素对2型糖尿病局灶性脑缺血大鼠脑组织信号转导及转
录激活因子1的影响［J］.中国医药导报，2014，11（9）：33-36.
［12］Brassai A，Suvanjeiev RG，Ban EG，et al.Role of synaptic and nonsynaptic glutamate receptors in ischaemia induced neurotoxicity［J］.Brain Res Bull，2015，112C：1-6.
［13］Tai C，Hines DJ，Choi HB，et al.Plasma membrane insertion of TRPC5 channels contributes to the cholinergic plateau potentialinhippocampalCA1pyramidalneurons［J］. Hippocampus，2011，21（9）：958-967.
［14］Weiss JL，Hui H，Burgoyne RD.Neuronal calcium sensor-1 regulation of calcium channels，secretion，and neuronal outgrowth［J］.Cell Mol Neurobiol，2010，30（8）：1283-1292.
［15］Ansari S，Azari H，McConnell DJ，et al.Intraluminal middle cerebral artery occlusion （MCAO）model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice［J］.J Vis Exp，2011，8：51.
［16］Li H，Wang X，Zhang N，et al.Imaging of mitochondrial Ca2+dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s：mitochondrial
Ca2+uptake and cytosolic Ca2+availability via the endoplasmic reticulum store［J］.Cell Calcium，2014，56（6）：457-466.
［17］王璐茜，张翔宇，耿若君，等.一氧化氮对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响［J］.新乡医学院学报，2010，27 （6）：559-561.
［18］Yang L，Yang ZM，Zhang N，et al.Neuroprotective effects of vitexin by inhibition
of NMDA receptors in primary cultures of mouse cerebral cortical neurons［J］.Mol Cell Biochem，2014，386（1-2）：251-258.
［19］Takagi Y，Harada J，Chiarugi A，et al.STAT1 is activated in neurons after ischemia and contributes to ischemic brain injury［J］.J Cere Blood Flow Metab，2002，22（11）：1311-1318.。