实验二细菌的革兰氏染色实训指导书

实验二细菌的革兰氏染色

【目的要求】

1. 掌握细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤

2.掌握革兰氏染色法的步骤和关键点

3.识别细菌的革兰氏染色结果

【材料和用品】

1.菌种：培养18小时至20小时的枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。

2.染料：草酸铵结晶紫液、革兰氏碘液、95%乙醇、番红复染液。

3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、拭镜纸、火柴、无菌生理盐水、吸水纸、香柏油、二甲苯等。

【实验内容与方法】

1.涂片

取两块载玻片，各滴加一小滴无菌的生理盐水（或蒸馏水）于载玻片中央，用接种环以无菌操作从大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。同样方法从枯草牙孢杆菌或金黄色葡萄球菌的斜面上挑取少许菌苔涂片于另外的载玻片上。

注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。

2.干燥

室温自然干燥。

3.固定

涂面朝上，在火焰过2~3次。

此操作全过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。

4.初染

滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1~2min，水洗。

5.媒染

用革兰碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。

6.脱色

用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色，立即水洗，时间大约为30s左右。

7.复染

用番红染液复染约2min，水洗。

8.镜检

将标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置，微调细调节器使物像清晰。之后换油镜观察，在低倍镜或高倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加1~2滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，调节照明使视野的亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止，仔细观察并记录观察到的结果。

菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。

9.混合涂片染色

按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌或大肠杆菌和金黄色葡萄菌作混合涂片、染色、镜检进行比较。

10.油镜用后的处理

（1）上升镜筒（或下降载物台），取下载玻片。

（2）用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的拭镜纸擦去残留的二甲苯。

切忌用手或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响观察。

【实验报告】

按实验目的的要求完成实验内容和实验报告，报告要求：

1. 列表简述3种细菌的染色结果（说明各菌的形状、颜色和革兰染色反应）

2.分别绘出观察到的细菌形态图

【实验结果讨论】

1.在进行细菌制片时应注意什么？

2.你的革兰染色结果与课本（或网上资料）中所述是否一致？哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？