甘蓝型油菜花柄遗传转化体系的创建

甘蓝型油菜花柄遗传转化体系的创建
刘洋;徐漫;赵德刚
【摘要】为获得转基因油菜植株,以甘蓝型油菜品种特选4号花柄为外植体,确定了不定芽分化最佳培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L,并进行了花柄外植体的转化试验,得到了抗卡那霉素(Kan)植株,并对影响转化的一些因素进行了研究.结果表明:卡那霉素对芽再生均具有很强的抑制作用,最佳筛选浓度为15 mg/L；花柄外植体在MS+3 mg/L 6-BA+1.0 mg/L2,4-D培养基上预培养72h时,经农杆菌(OD600≈0.4)侵染3 min后共培养2d,获得了抗卡那霉素并通过PCR鉴定和GUS 报告基因检测的转基因植株15株,遗传转化效率为5.19％.%In order to obtain transgenic rape plants, a transformation test was conducted taking the flower stalk of B. napus cultivar Texuan 4 as the explants, and Kan-resistant plant was obtained, some factors affecting transformation were studied. The results showed that the optimal adventitious buds induction medium was MS+6-BA3. 0 mg/L + NAA 0. 1 mg/L, and the optimal kanamycin concentration for screening was 15 mg/L. When flower stalk explants were precultured on the MS medium containing the combination of 1. 0 mg/L 2. 4D and 3 mg/L 6-BA for 72 hours,and then infected with A. tumefaciens (OD600 =0. 4) for 3 minutes and co-cultured for two days, 15 kanamycin resistance plants were obtained and passed PCR identification and GUS detection. The transformation frequency reached 5. 19%.
【期刊名称】《贵州农业科学》
【年(卷),期】2013(041)002
【总页数】5页(P1-5)
【关键词】油菜;花柄;外植体;遗传转化
【作者】刘洋;徐漫;赵德刚
【作者单位】贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学绿色农药与农业生物工程国家重点实验室培育基地,贵州贵阳550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学贵州省农业生物工程重点实验室,贵州贵阳550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学绿色农药与农业生物工程国家重点实验室培育基地,贵州贵阳550025;贵州大学贵州省农业生物工程重点实验室,贵州贵阳550025
【正文语种】中文
【中图分类】S565.403.2
油菜系十字花科芸薹属植物，分为白菜型（Brassica rapaL.）、芥菜型（Brassica juncea L.）和甘蓝型（Brassica napus L.）3种栽培种，其中，甘蓝型油菜在全球的种植面积最为广泛，芥菜型次之，白菜型最少。

目前，油菜作为四大油料作物之一，是全球种植面积第四大的转基因作物［1］，2010年，全球转基因油菜的种植面积占全球油菜种植总面积的23%，达到700万hm2［2］，并且逐年快速增加，2011年达到820万hm2，占全球转基因作物种植面积的5%［1］。

自1985年 Ooms等［3］首次利用农杆菌介导法获得转基因油菜以来，油菜转基因研究已在抗病、抗虫、抗除草剂、雄性不育、蛋白组分改良等多方面取得了突破性进展［4］。

农杆菌介导法是油菜遗传转化中最常用、转化率最高的方法之一，不同外植体包括茎段［5－6］、子叶［7－10］和胚轴［11－12］等均可作为遗传
转化的受体，其中，以子叶柄和下胚轴最为常见，用花柄为外植体的报道很少。

油菜是无限花序，蕾薹期可不断产生花芽，在花期花柄外植体很多，且离体油菜花柄具有高频率再生不定芽的能力［13－14］。

子叶柄和下胚轴要经过组织培养、等待种子萌发后才能取材，而花柄可以从大田直接取材，缩短了培养时间，操作也更加方便。

油菜遗传转化具有强烈的基因型依赖性［15－17］，目前，推广应用的转基因油菜体系大多是从加拿大春油菜栽培品种Westar等少数几个基因型上发展起来的，对于地方品种的应用仍需进行探索。

因此，笔者等以贵州油菜产区主栽品种特选4号的花柄为外植体，研究了6－BA／NAA不同激素配比、卡那霉素筛选浓度、预培养时间等因素对不定芽诱导的影响，建立了高效再生转化体系，并用农杆菌介导法遗传转化植物表达载体pBin19LAT59－FLP获得转基因卡那霉素抗性植株，建立了高效的遗传转化体系。

1 材料与方法
1.1 外植体准备
油菜常规品种特选4号种子，由贵州大学油菜研究所林树春老师提供，种植于贵州大学转基因试验示范基地。

在大约4月中旬油菜盛花期，用剪刀将花茎整个剪下，用自来水冲洗30min，75%酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，0.1%升汞消毒10min，无菌水冲洗5次，于超净台上将花柄切至0.5cm左右切段，备用。

1.2 菌株与质粒
根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株为LBA4404，植物表达载体pBin19LAT59－FLP是在质粒pBin19基础上构建的，带有花粉特异启动子驱动的FLP重组酶外源基因清除系统，及CaMV35S启动子驱动的GUS、NPTⅡ融合基因。

其T－DNA部分见图1。

图1 植物表达载体的T－DNA结构Fig.1 The T－DNA structure of plant expression vector
1.3 不同处理对油菜花柄不定芽的诱导
1.3.1 不同激素组合取油菜特选4号的花柄切段，接入6－BA与NAA不同浓度
组合的培养基中培养，每10～15d继代1次，40d后统计每个外植体诱导的不定芽个数，计算外植体分化率＝（长芽外植体／外植体总数）×100%，选取不定芽
诱导率高的激素组合为花柄不定芽诱导的最适培养基。

1.3.2 不同卡那霉素浓度在通过1.3.1试验确定的花柄最适不定芽诱导培养基中加入不同浓度的卡那霉素（0，5mg／L，10mg／L，20mg／L，30mg／L，40mg ／L），培养40d后，统计愈伤诱导和芽苗分化情况，确定合适的卡那霉素筛选压。

1.3.3 预培养时间取油菜特选4号的花柄切段，放入预培养基 MS＋3mg／L 6－BA＋1.0mg／L2，4－D，预培养基参考沈奇等［18］和韩德俊等［19］确定，
分别培养0、24h、48h、72h、96h，然后放入通过1.3.1试验确定的花柄最适不定芽诱导培养基中，每10～15d继代1次，40d后统计每个外植体诱导的不定芽个数，计算外植体分化率＝（长芽外植体／外植体总数）×100%，确定最适预培
养时间。

1.4 油菜遗传转化方法
具体转化方法参考沈奇等［18］：挑取单菌落于50 mL YEP液体培养基（1%酵
母提取物＋1%蛋白胨＋0.5%NaCl）中，28℃震荡培养过夜，至农杆菌OD600
约为0.4时，4℃，6 000r／min，离心10min收集菌体，MS重悬液重悬收集的菌体。

将经过最适时间预培养的花柄受体材料在重悬液中浸泡3min，无菌纸吸干菌液，接种于共培养基中共培养2d 然后将外植体转接到脱菌培养基 MS＋3.0mg ／L 6－BA＋0.1mg／L NAA ＋6mg／L AgNO3 ＋250mg／L CEF中进行脱菌
培养，待绿色不定芽长出后切下，接入最适筛选培养基中进行筛选培养，10～15d 继代1次，40d后统计抗性芽率。

1.5 转基因植株的生根和移栽
不定芽长到1cm高后转入培养瓶中进行壮苗培养，待长出第3片叶后将不定芽转接到生根培养基 MS＋2.0mg／L IBA＋0.05mg／L NAA中进行生根培养，大约1个月根系生长发达后炼苗、移栽到花盆中，待幼苗长到5～6叶时移栽到大田中。

1.6 转基因植株的鉴定
1.6.1 GUS蛋白组织化学染色取植株的叶片切成薄片，放入1.5mL离心管，加入200μL GUS染液（100mmol／L Tris－HCl pH 7.5，50mmol／L NaCl，
2mmol／L K3Fe（CN）6，8%甲醇（V／V），500 mg／LX－Gluc），抽真空
3min，37℃反应12h，分别用15%、45%、75%、100%的酒精脱色，显微镜下观察并拍照。

1.6.2 PCR分子检测基因组DNA的提取方法采用CTAB法（参考《分子克隆实验指导第三版》），用 FLP 引物（FLP－F：5′－GGGGTACCCAAGTCGACCAATGCCACAATTTGGTATA TTATG－3′ FLP－R：5′－CCGATCGAGTTATATGCGTCTATTTATGTAGG－3′）扩增约1.2kb的目标带。

扩增条件为94℃预变性10min，94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸
1min，30个循环，72℃延伸10min。

反应结束，取2μL反应产物进行琼脂糖凝
胶电泳检测。

1.7 培养基和培养条件
试验过程中所用基本培养基均为MS培养基。

再生过程中的培养基为MS培养基
添加不同浓度的激素和6mg／L AgNO3，转化过程中的脱菌、筛选、生根培养基均添加250mg／L头孢霉素和适量浓度的卡那霉素。

所有培养基均加入30g／L
蔗糖和0.8%琼脂，pH调至5.8。

培养条件为温度25℃，光照时间16h／d，光强2 500lx。

2 结果与分析
2.1 不同处理对油菜花柄不定芽诱导的影响
2.1.1 不同激素组合激素的选择与浓度配比是影响油菜不定芽再生的关键因素之一，特选4号花柄外植体在添加不同浓度的6－BA／NAA组合的培养基上分化不定芽的情况（表1）。

在6－BA
3.0mg／L＋NAA 0.1mg／L时，外植体分化率最高，达62.3%。

当6－BA浓度继续升高到5.0mg／L、NAA浓度仍为0.1mg／L时，外植体玻璃化程度高，分化率下降，仅为30.7%。

当6－BA浓度为3.0mg／L时，随着NAA浓度的上升，外植体分化率下降。

当NAA高达0.6mg／L时，产生不
定根，当NAA高达0.9mg／L时，外植体分化率低至6.5%，并产生大量不定根。

综合考虑，外植体分化率和平均每个外植体诱导的不定芽数2个指标，确定特选4号花茎外植体不定芽诱导最适激素配比为6－BA 3.0mg／L＋NAA 0.1mg／L。

2.1.2 不同卡那霉素浓度卡那霉素（Kanamycin，Kan）对油菜细胞有强烈的毒害作用，低浓度便可抑制油菜细胞的再生。

试验表明，在不定芽诱导最适培养基（MS＋6－BA 3.0mg／L＋NAA 0.1mg／L）上，随着卡那霉素浓度的逐步增加，出芽率和出绿芽率逐步下降（表2），当卡那霉素为5mg／L时，再生绿芽率为33.9%；当卡那霉素为10 mg／L时，再生绿芽率仅为20.3%；卡那霉素浓度从
10mg／L升高到 20mg／L，再生绿芽率骤减到2.1%。

综合考虑，选取卡
那霉素15mg／L为筛选浓度。

为避免低水平的选择压力导致的非转化体逃逸问题，在抗性芽生根后，通过GUS蛋白组织化学染色或基因组PCR等方法进一步检测
转化植株。

在试验中观察到，从花柄再生的不定芽中绿色的芽抗卡那霉素能力强，能够长成成苗；而白色的不定芽抗卡那霉素能力弱，在后面进一步筛选过程中会发生白化、畸形，最终很难长成成苗。

表1 不同激素组合（6－BANAA 的培养基诱导油菜花柄外植体的分化率Table 1 Differentiation rate of explants induced from flower stalk of B.napus on media with different proportion of 6－BA and NAA注：外植体分化率＝长芽外植体数／总外植体数×100%。

Note：Differentiation rate of explants＝
number of explants with buds／total number of explants×100%.激素组合／（mol／L）Combination接种外植体数／个Number of inoculated explants
长芽外植体数／个Number of explants with buds外植体分化率
／%Differentiation rate of explants 6－BA 1.0＋NAA 0.1 211 54 25.6 6－BA 2.0＋NAA 0.1 204 97 47.5 6－BA 3.0＋NAA 0.1 207 129 62.3 6－BA 4.0＋NAA 0.1 209 68 32.5 6－BA 5.0＋NAA 0.1 202 62 30.7 6－BA 3.0＋NAA 0.2 200 56 28.0 6－BA 3.0＋NAA 0.3 213 30 14.1 6－BA 3.0＋NAA 0.9 201 13 6.5
表2 不同卡那霉素浓度油菜花柄切段的芽再生外植体Table 2 Shoot regeneration of flower stalk cuttings of rape treated with different concentration of kanamycin注：出芽率＝总出芽外植体数／接种外植体×100%，出绿芽率＝（出绿芽外植体数／接种外植体）×100%。

Note：Budding rate＝budding number／number of explants×100%，Green budding rate＝green budding number／number of explants×100%.浓度／（mg／L）Concentration接种外植体数／个Number of inoculated explants出芽外植体Budding explants出芽外植体数／个出芽率／%reen buds出绿芽外植体数／个出绿芽率／%出绿芽外植体Explants with g 0 366 234 63.9 200 54.6 5 345
161 46.7 117 33.9 10 355 121 34.1 72 20.3 20 327 48 14.7 7 2.1 30 321 25 7.8 0 0 40 354 15 4.2 00
2.1.3 预培养时间外植体经过合适时间的预培养后，体积变大、更加粗壮，再生频率提高，参考沈奇等［18］和韩德俊等［19］的预培养基成分，选用 MS＋3mg
／L 6－BA＋1.0mg／L 2，4－D为预培养基，结果（表3）发现，油菜品种特选
4号在该培养基下培养72h时，不定芽率达到80.3%，随着预培养时间增加，不
定芽诱导率下降。

表明，72h是最适合的预培养时间。

2.2 油菜转基因植株的鉴定
表3 不同预培养时间油菜花柄的不定芽率Table 3 Rate of adventitious buds of flower stalk with different pre－culture time注：出芽率＝（出芽数／外植体数）×100%.Note：budding rate＝budding number／number of explants×100%.预培养时间／h Pre－culture time外植体数／个Number of explants出芽数／个Budding number出芽率／%Budding rate 0 126 76 60.3 24 141 89 63.1 48 135 92 68.1 72 132 106 80.3 96 121 73 60.3
通过上述试验，确定油菜花柄遗传转化的最适合预培养时间为72h，卡那霉素筛选浓度为15mg／L，不定芽诱导最适培养基为 MS＋6－BA 3.0mg／L＋NAA 0.1mg／L。

在试验过程中共处理289个花柄切段，共获得抗性植株15棵，取移栽到田间的抗性芽顶端叶片进行GUS蛋白组织化学染色（图2），转化率为
5.19%。

以GUS染色阳性植株基因组为模板，通过引物FLP－F和FLP－R扩增得到1.2kb的特异性FLP片段（图3）。

图2 油菜花茎转基因植株再生及GUS组织化学染色Fig.2 Transgenic plant regeneration from flower stems of B.napus and the histochemical staining of GUS gene expressionA，花茎不定芽诱导；B，不定芽生根；C，移栽成活的植株；D，抗性植株GUS叶片染色。

A，adventitious bud inducted from flower stems of B.napus；B，rooting of adventitious bud；C，the survival transplanted plants；D，GUS histochemical staining of plants with resistance.
图3 油菜花柄转基因植株的PCR检测Fig.3 PCR analysis of transgenic
B.napusM，100bp marker；2，以质粒DNA为模板扩增FLP基因；1、3、4、5抗性植株DNA模板扩增FLP基因。

M：100bp marker；2，PCR amplified FLP genes from plasmid DNA as template；1，3，4，5：PCR amplified FLP
genes from plants with resistance.
3 结论与讨论
建立高效的植物再生体系是建立农杆菌介导的遗传转化体系的基础，基因型和激素配比对油菜再生频率的影响均达到极显著水平，激素的影响大于基因型，且两者之间存在显著的互作效应［15，20－21］。

该试验以油菜品种特选4号花柄为外植体，研究了6－BA、NAA不同激素浓度配比、预培养时间对其不定芽再生频率的影响，发现以MS＋3mg／L 6－BA＋1.0mg／L 2，4－D为预培养基预培养3天后放入MS＋6－BA 3.0mg／L＋NAA 0.1mg／L不定芽分化培养基上培养，能够获得80.3%的不定芽诱导效率。

因此，花柄是诱导油菜再生的一种很好的外植体。

卡那霉素（Kanamycin，Kan）是油菜遗传转化中最常用的筛选剂之一，对油菜
细胞有强烈的毒害作用，低浓度便可抑制油菜细胞的再生，如果对卡那霉素耐受则更有利于油菜遗传转化。

沈奇等［18］利用贵州油菜材料特选4号、贵杂母本AB、黄籽、恢复118下胚轴进行遗传转化时，发现选用10mg／L卡那霉素时，再生
绿芽率仅为1%；石淑稳等［22］报道，当用10mg／L卡那霉素时，下胚轴产生绿芽的切段比率仅为4.17%。

该试验中，我们选用10mg／L卡那霉素时，再生绿芽率为20.1%。

说明，花柄耐卡那霉素能力可能比下胚轴强，当然这也可能和基
因型有关。

从该试验中，也可以看出尽管花柄比较耐受卡那霉素，但卡那霉素对花柄不定芽诱导率影响仍然很大，不添加卡那霉素时，不定芽诱导率在60%左右，
添加10mg／L卡那霉素时，再生绿芽率降为20.1%，为获得更高的油菜遗传转化效率，应该选择对植物无伤害或者伤害小的其他筛选标记基因。

目前，以甘蓝型油菜无菌苗的下胚轴和子叶（柄）为受体进行遗传转化最为多见。

沈奇以贵州甘蓝型油菜特选4号下胚轴为受体材料，获得了8%的遗传转化效率。

陈松等［23］以油菜品种宁油12号子叶柄为外植体，转化油酸脱饱和酶基因（fad2），获得了5.04%的转化效率。

何业华等［24］以湘油15子叶柄为外植
体，转化TA29－Barnase基因，获得了8.8%的转化效率。

一些特殊遗传材料，
如植物雄性不育系和自交不亲和系等，获得种子比较困难，而用下胚轴或子叶（柄）为外植体进行遗传转化时，需要较多的种子。

油菜是无限花序，只要温度等条件适宜就能不断开花，花期长，花数目多。

尽管以油菜花茎为外植体，建立了高效的再生体系［19］，但花茎外植体一旦与农杆菌共培养以后，很快会褐化死亡，其再
生潜力无法表现［6，13］。

因此，对雄性不育系和自交不亲和系等特殊转化材料可以用花柄代替无菌苗的下胚轴和子叶（柄）。

该试验以甘蓝型油菜花柄为外植体，建立了高效再生体系，在农杆菌介导的遗传转化研究中发现，花柄有较强的卡那霉素耐受能力，也比花茎更耐受农杆菌的伤害，获得了5.19%的遗传转化率，证明花柄也是油菜遗传转化中一种很好的受体材料。

该研究转化的基因表达载体含有花粉特异启动子Lat59驱动重组酶FLP基因表达
的外源基因清除元件gene－deletor，获得的转基因植株可用于花粉中外源基因
清除效率的分析，为油菜安全转基因技术研究提供了基础材料。

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