biochemistry 水解酶催化不对称碳碳键生成反应

水解酶催化的不对称C-C键生成反应
Abstract
本文综述了水解酶对三种类型的有机化学反应的不对称催化效果，分别是Aldol缩合，Michael加成和Mannich反应。

这三种反应中Aldol缩合可以使用的酶催化剂种类较多，使用多种脂肪酶，蛋白酶和核酸水解酶均可以达到非常好的转化率和立体选择性。

一般的转化率都在80%以上，ee%都能达到70%以上。

而Michael加成反应和Mannich反应的水解酶催化不对称反应的研究起步较晚，文献报道过的较少，对于Mannich反应主要集中于应用SGP 作为催化剂效果较好。

而对于Mannich反应，文献报道的是AMA的催化效果最佳，能够达到80%的转化率，88%的ee值和92/8的dr值。

Keywords水解酶C-C键不对称Aldol缩合
Introduction
水解酶是能够催化水解反应发生的酶的总称，在生物体中一般被用以催化酯类，醚类，缩醛（也就是糖类）和肽键的水解。

[1]因为其高稳定性，较好的底物兼容性，极高的催化效率和对有机溶剂较好的耐受性，这种酶被广泛应用于工业合成。

而且人们近几年发现这种酶具有多功能催化作用，即除了水解反应，水解酶还能高效的催化多种碳碳键形成反应，而碳碳键生成又是有机合成和方法学研究中极其重要的一个环节。

[2, 3]因此水解酶在这一领域中的催化反应应用被广泛研究。

同时，生物体合成的酶除了具有高反应催化活性外，一般都具有手性的催化中心，因此所催化诱导的反应往往都是不对称反应，往往可以以极高的手性选择性引导潜手性中手性化，从而生成对映体超过量值（enantiomeric excess，ee%）极高的手性产物。

在这些不对称合成反应中，酶催化不对称C-C键生成反应就更为重要了。

[4]所以本文着重综述了近几年来水解酶催化的不对称C-C键合成反应，并把这些反应分为以下几类来分类论述：1.水解酶催化的Aldol缩合反应。

2.水解酶催化的Micheal 加成反应。

3.水解酶催化的Mannich反应。

本文主要综述对比了不同的水解酶对上述反应催化的反应机理，反应溶剂，产率和ee%。

1.水解酶催化的不对称Aldol缩合反应
Aldol反应在有机合成中对C-C键的合成非常重要，其整体的反应机理展示于图（1）。

[5]而且，因为生物体中有众多控制新陈代谢的糖类或有糖结构的物质，这类物质往往可通过不对称的Aldol缩合反应获得，因此这类反应经常被认为是自然合成某种结构分子的途径。

[6]有很多水解酶对这种不对称Aldol缩合有较高的催化活性，如脂肪水解酶，蛋白水解酶，核酸水解酶。

本文接下来综述它们的催化性能。

图（1）Aldol缩合反应机理
1.1.脂肪水解酶催化的不对称Aldol缩合反应
脂肪水解酶在（lipase）生物体中用于催化长链三甘油酯的水解，同时也是有机合成中最为常用的一类，因为它除了能水解酯基以外也能催化C-C键合成，因而经常被用于催化Knoevenagel缩合，Aldol缩合，Michael加成，Henry反应等。

[7]这里介绍它催化的Aldol不对称缩合反应。

在2008年，Wang的课题组发现并报道了第一例脂肪水解酶催化的Aldol缩合反应。

他们发现来自猪胰脏（PPL）、来自毛霉菌（MJL和MML）和来自南极假丝酵母可以催化丙酮和取代的苯甲醛生成对映选择性的产物。

[8]（展示于表（1），1-6）。

酶
来源&缩写溶剂反应温度
o C
时间
h
产率
% %
代表物引文
猪胰脏脂肪酶
PPL
丙酮30 72-144 96.4 43.6 2 [8]
爪哇毛霉脂肪酶
MJL
丙酮30 24 14.5 12.9 1 [8]
南极假丝酵母脂
肪酶CAL-B
丙酮30 24 2.3 9.4 1 [8]
米黑毛霉脂肪酶
MML
丙酮30 24 9.8 9.6 1 [8]
米黑毛霉脂肪酶
MML
丙酮-水30 24 9 9 1 [9]
南极假丝酵母脂
肪酶CAL-B
丙酮-水30 24 2 9 1 [9]
其中，PPL展现出了最高的催化效率，反应经过144h后产率达到96.4%，同时也能达到最大的ee%，但是要控制水的浓度为1%。

另外，他们还模拟了整个过程的反应机理。

（展示于图（2））。

整个反应机理可以理解为：首先丙酮被Asp-His的二分体和氧负离子固定，然后His残基从丙酮的活泼甲基上捕获一个质子并将其脱去，形成烯醇阴离子。

然后，形成的烯醇负离子再亲核进攻另外一个被活化的醛。

生成新的碳碳键后，整个分子从氧负离子洞中释放。

图（2）PPL催化丙酮和芳香醛不对称Aldol缩合反应机理图
1.2.蛋白水解酶催化的不对称Aldol缩合反应
蛋白水解酶（Proteases）在生物体中用于水解肽键。

蛋白酶是一种具有高度空间和位置选
择性的催化剂，所以比较稳定易于使用，通常在温和的反应条件下能够催化简单的分子反应。

自从Klibanov等发现蛋白酶可以在有机溶剂中长时间保持活性，这种酶在有机反应中的催化作用被广泛关注。

[6]2010年，Wang的组发现了来自猪胰脏的胰蛋白酶，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶可以用于p-硝基苯甲醛与丙酮的Aldol缩合反应。

催化的温度，溶剂产率，非对映选择性（dr），对映选择性（ee%）案列数和参考文献展示于表（2）1-3。

其中胃蛋白酶作为天冬氨酸水解酶展现了极高的催化活性，反应中间体受酶的手性活性位点的空间结构影响非常大，从而展现出了良好立体选择性。

如叔丁醇，乙醇和水这种质子溶剂的存在对催化过程起到促进作用。

在23%含水量（V水/V水+丙酮）条件下121小时后产率达到93%。

当含水量下降至10%时，非对映选择性从ee%=66%降到45%，反应速率在前120h中几乎保持不变。

在2011年，Gotor课题组测试了不同浓度的蛋白酶对水解酶催化过程的促进作用。

他们把碱性蛋白酶-CLEA固定在地衣芽孢杆菌上。

他们发现，碱性蛋白酶可以促进p-硝基苯甲醛和丙酮的缩合反应，以24%的产率和7%的ee%得到(R)-β-羟基酮。

当溶剂中有水掺杂的时候，手性选择效果稍有增强，ee%能达到11%。

同时温度的上升能帮助提高反应产率，最优温度下产率能提高到68%，在45o C下和20%水含量的丙酮中反应。

（表（2）4）
酶
来源&缩写溶剂反应温度
o C
时间
h
产率
% %
引文
胃蛋白酶
Persin
丙酮-水30 120 89 45 [9]
胃蛋白酶
Persin
丙酮-水30 24 18 11 [9]
胰蛋白酶
Trypsin
丙酮-水30 24 23 19 [9]
碱性蛋白酶
Alcalase
丙酮-水45 48 68 13 [10]
木瓜凝乳蛋白酶
CHY
乙腈/缓冲溶液30 120 12 14 [11]
猪胰脏蛋白酶
PPT
丙酮-水30 46 28 16 [12]
蜂蜜曲霉蛋白酶
AMP
乙腈-水30 192 20 32 [13]
Zhi组在2012年和2013年同样研究了p-硝基苯甲醛的不对称Aldol缩合的酶促反应，并发现了某些蛋白酶能展现出不同的催化活性，包括木瓜凝乳蛋白酶，猪胰脏胰蛋白酶，蜂蜜曲霉素朊酶。

（表（2）5,6）少量水的存在是催化效率保持的关键，而且几乎所有的酶促反应都可以在室温下进行。

在2011年，Zhi组报道了芳香醛和环状酮的反应，这个反应是在BLAP酶（地衣芽孢杆菌蛋白酶）的催化下进行的，产率能达到92%，dr值从32/68到95/5，ee%值从22到大于99%。

溶剂系统是水：DMSO=0.15，V/V的溶液。

作为一种依赖于Ca2+的蛋白酶，地衣芽孢杆菌蛋白酶在EDTA的存在下几乎失去催化能力，而且这种酶的催化能力也能够被丝氨酸蛋白酶抑制剂彻底抑止，如苯甲基磺酰氟（PMSF），因此可以确定不对称Aldol反应催化进程是在BLAP的活性位点上进行的。

1.3.核酸水解酶催化的不对称Aldol缩合反应
从桔青霉素中提取的核酸水解酶p1是一类Zn依赖性的内切核酸酶。

这类酶由270个氨基酸砌块组成，内含两个二硫键。

他能切断单链RNA和某些DNA形成5-单核苷酸。

[14]在2011
年，Zhi组发现了核酸水解酶p1同样能够催化环状酮的不对称Aldol缩合反应，并且这种反应能够在有机相条件下进行。

（展示在图（3）中）有些条件，比如反应中间体，底物比率，酶载体，水浓度和温度对这种催化反应均有影响。

反应的对映选择性ee%达到99%，非对映选择性dr值更是能达到大于99/1（anti/syn），尽管即使在最优条件下产率也较低。

图（3）核酸水解酶催化的酮与醛反应的不对称Aldol缩合反应
在2014年，Lin组发现环己酮的Aldol缩合也可以被桔青霉素的核酸水解酶催化（如图（4））。

在EDTA的存在下催化反应受到抑制，或者在酶不存在的条件下反应是不发生的。

最终在最优条件下在没有有机溶剂存在时，产率达到95%，dr为大于99/1，ee%=82%，当底物为靛红衍生物和环状酮时。

[15]
图（4）核酸水解酶催化的酮活泼甲基与环状酮反应的不对称Aldol缩合反应
2.水解酶催化的不对称Micheal加成反应
Micheal加成是共轭加成的一种，在新C-C键形成的方法学中至关重要。

一般指的是α,β-不饱和羰基化合物和碳负离子的反应。

在Micheal加成反应中引入酶的多功能催化自从1980年代就收到关注：Kitazume等在那时已经发现水解酶有能力催化Micheal加成的能力，一般是在缓冲溶液中硫醇和胺类对三氟代α,β-不饱和羰基化合物反应。

[14]最近十年发现有很多水解酶可以被应用于Micheal加成，但是成功的获得不对称合成结果的却很少。

在2010年，Zhi组报道了第一例水解酶催化的不对称C-C Michael加成，反应如图（5）所用的底物种类分布很广泛，从1,3-二羰基化合物和环己烯反应，到芳香和杂环芳香硝基乙烯和环己烯反应，都是在水存在的有机相中反应的。

[16]实验结果显示，脂肪水解酶展现出了高效的催化活性并且具有较好的对映选择性。

一种可以循环使用的TILM脂肪酶（固定的从嗜热真菌中提取的脂肪酶）确定为最为高活性的催化剂。

并且，这种催化剂能够兼容多种芳香环上的取代基和多种α,β-不饱和羰基化合物的衍生物，反应条件依然是有水的情况下，产率达到85%，ee%=82%。

图（5）环己烯酮和乙酰丙酮在水解酶催化下不对称的Micheal加成反应
3.水解酶催化的不对称Mannich反应
Mannich反应是一种原子经济的多化合物共同反应的增碳反应，其反应大致机理展示于图（5）中。

尽管有些酶催化的Mannich反应已经被报道过了，但是同样缺少在不对称合成方向上的应用。

在2012年，Zhi组发现并报道了第一个水解酶催化的不对称三组分Mannich 反应。

通过使用水解酶typeXIV，从灰色链霉菌（SGP）中发现在水掺杂的乙腈中反应。

部分的条件控制实验显示SGP天然的特殊折叠形状对反应的立体选择性至关重要，例如，当反应应用尿素变性过的SGP参与反应时，反应产率仍然高达87%然而ee值仅有8%。

而且，在25mM Cu2+或Ag+存在的情况下，SGD催化反应的选择性会被彻底破坏。

在正常情况下，反应的最高产率达到92%，最好的对映选择性达到88%ee非对映选择性达到92/8。

（具体展示于表（4）1）。

最近，Zhi组又报道了另一个水解酶催化的不对称Mannich反应。

用的是酰基转化酶I（酰
酶缩写溶剂反应温度
o C
时间
h
产率
% anti/syn %
引文
SPG 乙腈-水30 94-168 89 40/60–92/8 33–88 [14] AMA 乙腈-缓冲溶液30 96-192 18 43/57–90/10 23–89 [16] Conclusion
本文综述了水解酶对三种类型的有机化学反应的不对称催化效果，分别是Aldol缩合，Michael加成和Mannich反应。

这三种反应中Aldol缩合可以使用的酶催化剂种类较多，使用多种脂肪酶，蛋白酶和核酸水解酶均可以达到非常好的转化率和立体选择性。

一般的转化率都在80%以上，ee%都能达到70%以上。

而Michael加成反应和Mannich反应的水解酶催化不对称反应的研究起步较晚，文献报道过的较少，对于Mannich反应主要集中于应用SGP 作为催化剂效果较好。

而对于Mannich反应，文献报道的是AMA的催化效果最佳，能够达到80%的转化率，88%的ee值和92/8的dr值。

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