生物化学实验@层析技术分离生物大分子(凝胶过滤)
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
注意：蓝色葡聚糖洗下来之后，还要用洗脱液（1-2倍床体积）继续 平衡一段时间，以备下步实验使用。
4、蛋白质混合样品的分离
吸去柱上端的洗脱液（切不可搅乱胶面）。打开出水口，使残 余液体降至与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用移液枪 吸取标准蛋白溶液0.5mL ，小心地绕柱壁一圈（距离胶面2mm）缓 慢加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，同时打开恒流泵 （开始收集！），开始记录！待溶液渗入胶床后，关闭出水口， 用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗脱液充满后 用3-5mL/10min的速度开始洗脱，同时用核酸蛋白检测仪测定 A280，自动收集器收集时间为10min每管。最后作出洗脱曲线 （由记录仪完成）。
层析技术公式
分配系数
Ve – Vo Kav=
Vt - Vo Vt——层析床总体积 Ve——洗脱液体积 Vo——外水体积 分子量大，全排出 分子量中 分子量小，进入内部
Ve= Vo Ve= Vo+ KavVi Ve= Vo+ Vi
Kav=0 0< Kav<1 Kav=1
二、各类凝胶的结构和性能
1.
葡聚糖凝胶（Sephadex）
SephadexG50、 SephadexG75、 SephadexG100、 2.琼脂糖凝胶（sepharose） Sepharose2B、4B、6B 3.聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel-p）
4.sephacryl (交联葡聚糖和双丙烯酰胺共聚）
凝胶层析分离蛋白质
本次试验分两次完成。 1、讲解技术原理，装柱练习，连接装置等。 2、上样分离，打印图谱等。
生物大分子制备方法基本设计思路
Hale Waihona Puke 流程：选材→破碎→抽提→浓缩→分离纯化 (各种层析技术） →检测纯度（电泳技术） 生化实验三大分离技术： 离心技术 层析技术 电泳技术
层析技术分离生物大分子
5、数据处理： 以A280为纵坐标，t为横坐标画出蓝色葡聚糖和蛋白质混合样品 的洗脱曲线。（电脑画出） 注意：实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用， 严禁将凝胶丢弃或倒入水池中。
复习与思考思考
SDS-PAGE和凝胶过滤分离蛋白质及测定分子量有何不 同？
实验流程及方法：
制备固定相（装柱） →平衡→上样→洗脱→ 收集→检测 实验所需设备: 层析柱;恒流泵;自动部分收集器;核酸蛋白检测仪; 电脑(记录仪)
实验操作
1、凝胶的溶胀
称取7g Sephadex G-75 于250 mL烧杯中加入洗脱 液100mL，置于室温溶胀2-3天，反复倾泻去掉细 颗粒，然后减压抽气去除凝胶孔隙中的空气，沸 水浴中煮沸2-3小时（可去处颗粒内部的空气以及 灭菌）。（此部分已经完成） 使用时在超声波中超声10分钟。
1、定义 层析分离是一个动态过程，它是由一个流动相 （移动着的气体或液体）对另一个固定相（不移 动的固体或液体）作相对连续移动，流动相里含 有要分离的混合物质，在移动过程中，各种物质 受到固定相不同程度的作用（如吸附、离子交换 作用）等，达到分离。 2、分类： 吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、 亲和层析、聚焦层析等。
一、凝胶层析原理
凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状 的颗粒物质。用凝胶层析来分离生物大分子主要是根据多 孔凝胶对近似于球形不同半径的生物大分子具有不同的排 阻效应实现的。即是依据分子量的不同来进行分离的。 大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外， 只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而小分子不被排阻，可 自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，一些中等大小的分 子介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的 孔隙，即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也 介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便 按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
5.Superdex（交联琼脂糖和葡聚糖共聚）
层析凝胶的选择
1. 型号 根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。 2. 凝胶用量计算 π r2h 干凝胶用量（克）=
膨胀度
还应增加10-20%
3.柱的直径与长度 根据经验，组别分离时，大多采用20-30cm长的层析柱。 分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm 范围内，长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间.
3、柱子质量的测定
吸去柱上端的洗脱液（切不可搅乱胶面，）。打开出水口，使残 余液体降至与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用移液枪吸取 0.25ml（5mg/ml）蓝色葡聚糖-2000液体，小心地绕柱壁一圈（距离 胶面2mm）缓慢加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，同时打开 恒流泵（开始收集！），开始记录！待溶液渗入胶床后，关闭出水口， 用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗脱液充满后用 35mL/10min的速度开始洗脱，自动收集器收集时间为10min每管。最后 作出洗脱曲线（由记录仪完成）。观察蓝色葡聚糖移动情况，若蓝线 平直，则装柱良好。
2、装柱
取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。 在柱中加入洗脱液（约1/3柱床高度），将凝胶浓浆缓 慢倾入柱中，待凝胶沉积1cm-2cm高度后打开出水口，流 速一般用3-5mL/10min（预先恒流泵调好，记录流速）。 胶面上升到柱上端1cm处则装柱完毕。 注意装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口，静置片 刻，待凝胶完全沉降，则接上恒流泵，用1-2倍床体积的 洗脱液平衡柱子，使柱床稳定。
4、蛋白质混合样品的分离
吸去柱上端的洗脱液（切不可搅乱胶面）。打开出水口，使残 余液体降至与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用移液枪 吸取标准蛋白溶液0.5mL ，小心地绕柱壁一圈（距离胶面2mm）缓 慢加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，同时打开恒流泵 （开始收集！），开始记录！待溶液渗入胶床后，关闭出水口， 用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗脱液充满后 用3-5mL/10min的速度开始洗脱，同时用核酸蛋白检测仪测定 A280，自动收集器收集时间为10min每管。最后作出洗脱曲线 （由记录仪完成）。
层析技术公式
分配系数
Ve – Vo Kav=
Vt - Vo Vt——层析床总体积 Ve——洗脱液体积 Vo——外水体积 分子量大，全排出 分子量中 分子量小，进入内部
Ve= Vo Ve= Vo+ KavVi Ve= Vo+ Vi
Kav=0 0< Kav<1 Kav=1
二、各类凝胶的结构和性能
1.
葡聚糖凝胶（Sephadex）
SephadexG50、 SephadexG75、 SephadexG100、 2.琼脂糖凝胶（sepharose） Sepharose2B、4B、6B 3.聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel-p）
4.sephacryl (交联葡聚糖和双丙烯酰胺共聚）
凝胶层析分离蛋白质
本次试验分两次完成。 1、讲解技术原理，装柱练习，连接装置等。 2、上样分离，打印图谱等。
生物大分子制备方法基本设计思路
Hale Waihona Puke 流程：选材→破碎→抽提→浓缩→分离纯化 (各种层析技术） →检测纯度（电泳技术） 生化实验三大分离技术： 离心技术 层析技术 电泳技术
层析技术分离生物大分子
5、数据处理： 以A280为纵坐标，t为横坐标画出蓝色葡聚糖和蛋白质混合样品 的洗脱曲线。（电脑画出） 注意：实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用， 严禁将凝胶丢弃或倒入水池中。
复习与思考思考
SDS-PAGE和凝胶过滤分离蛋白质及测定分子量有何不 同？
实验流程及方法：
制备固定相（装柱） →平衡→上样→洗脱→ 收集→检测 实验所需设备: 层析柱;恒流泵;自动部分收集器;核酸蛋白检测仪; 电脑(记录仪)
实验操作
1、凝胶的溶胀
称取7g Sephadex G-75 于250 mL烧杯中加入洗脱 液100mL，置于室温溶胀2-3天，反复倾泻去掉细 颗粒，然后减压抽气去除凝胶孔隙中的空气，沸 水浴中煮沸2-3小时（可去处颗粒内部的空气以及 灭菌）。（此部分已经完成） 使用时在超声波中超声10分钟。
1、定义 层析分离是一个动态过程，它是由一个流动相 （移动着的气体或液体）对另一个固定相（不移 动的固体或液体）作相对连续移动，流动相里含 有要分离的混合物质，在移动过程中，各种物质 受到固定相不同程度的作用（如吸附、离子交换 作用）等，达到分离。 2、分类： 吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、 亲和层析、聚焦层析等。
一、凝胶层析原理
凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状 的颗粒物质。用凝胶层析来分离生物大分子主要是根据多 孔凝胶对近似于球形不同半径的生物大分子具有不同的排 阻效应实现的。即是依据分子量的不同来进行分离的。 大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外， 只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而小分子不被排阻，可 自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，一些中等大小的分 子介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的 孔隙，即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也 介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便 按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
5.Superdex（交联琼脂糖和葡聚糖共聚）
层析凝胶的选择
1. 型号 根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。 2. 凝胶用量计算 π r2h 干凝胶用量（克）=
膨胀度
还应增加10-20%
3.柱的直径与长度 根据经验，组别分离时，大多采用20-30cm长的层析柱。 分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm 范围内，长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间.
3、柱子质量的测定
吸去柱上端的洗脱液（切不可搅乱胶面，）。打开出水口，使残 余液体降至与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用移液枪吸取 0.25ml（5mg/ml）蓝色葡聚糖-2000液体，小心地绕柱壁一圈（距离 胶面2mm）缓慢加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，同时打开 恒流泵（开始收集！），开始记录！待溶液渗入胶床后，关闭出水口， 用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗脱液充满后用 35mL/10min的速度开始洗脱，自动收集器收集时间为10min每管。最后 作出洗脱曲线（由记录仪完成）。观察蓝色葡聚糖移动情况，若蓝线 平直，则装柱良好。
2、装柱
取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。 在柱中加入洗脱液（约1/3柱床高度），将凝胶浓浆缓 慢倾入柱中，待凝胶沉积1cm-2cm高度后打开出水口，流 速一般用3-5mL/10min（预先恒流泵调好，记录流速）。 胶面上升到柱上端1cm处则装柱完毕。 注意装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口，静置片 刻，待凝胶完全沉降，则接上恒流泵，用1-2倍床体积的 洗脱液平衡柱子，使柱床稳定。