双光子显微镜的应用优势与维护要素

综 述
①中山大学中山医学院科研仪器中心 广东 广州 510080*通信作者：**************
作者简介：李娟，女，(1983- )，硕士，助理实验师，从事科研仪器共享服务与管理工作。

中国医学装备2021年12月第18卷第12期 China Medical Equipment 2021 December V ol.18 No.12
双光子显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜及双光子激发技术的一种新精密仪器。

在激光扫描显微镜的基础上，双光子显微成像技术以红外飞秒激光作为光源，受散射影响较小，易穿透样本，可深入组织内部非线性地激发荧光，减小激光对生物体的损伤，光毒性小且具有高空间分辨率，适合生物样品的深层成像及活体样品的长时间观察成像[1-2]。

双光子显微镜已成为生命科学各领域重要的研究工具，可在细胞甚至是亚细胞水平对活体动物的神经细胞形态结构、离子浓度、细胞运动、分子相互作用等生理现象进行直接的长时间成像监测，还能进行光激活染及光损伤等光学操纵，广泛应用于脑科学、免疫学、肿瘤、胚胎发育等生物医学相关研究。

通过阐述双光子显微镜的工作原理、样品前期准备、成像难点及设备使用及日常维护要点，梳理双光子激光共聚焦与其他同类成像类设备在成像原理、配置参数、成像特点及应用领域等方面的不同，为使用者提供更多实验方法参考，使之更好地服务于医学临床、教学和科研。

1 双光子显微镜成像技术原理、优势及应用范围1.1 双光子激发技术的基本原理
双光子激发理论由诺贝尔奖得主Goppert Mayer于
1931年提出，1961年得到了实验验证[3-4]。

该技术的基本原理是：在高光子密度情况下，荧光分子可同时吸收2个长波长的光子，其效果与使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子相同。

长波长的光受散射影响小于短波长的光，易穿透标本；长波长的近红外光对细胞毒性小于短波长的光。

此外，双光子激发要较高的光子密度，为不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器，激光具有高峰值能量及低平均能量，物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜焦点处的光子密度最高，故双光子激发只发生在物镜的焦点处，只有在焦点平面上才有光漂白及光毒性，所以双光子显微镜无需共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。

1.2 双光子显微镜成像技术的优势及应用范围1.2.1 光漂白及光毒性小且成像深度深
双光子显微镜因其独特的激发模式，比激光扫描共聚焦显微镜更适用于观察厚标本、活细胞或进行定点光漂白实验。

传统激光扫描共聚焦显微镜在荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描及共扼聚焦装置，光路中设置了两个针孔滤光，用以消除焦点平面以外的杂散光信号，故成像时需较强的激光以获得足够的图像信噪
[文章编号] 1672-8270(2021)12-0158-06 [中图分类号] R197.39 [文献标识码] A
The application advantages and maintenance of two-photon microscopy/LI Juan, ZHANG Lan-lan, WU Jue-heng//China Medical Equipment,2021,18(12):158-163.
[Abstract] T wo-photon microscopy is one kind of new technique that combines confocal laser scanning microscopy and two-photon nonlinear excitation technique, which has the advantages such as low phototoxicity, high temporal-spatial resolution, high signal-to-noise ratio and so on. And it has been widely applied in the relevant research field includes brain science, immunology, tumor, embryonic development and other biomedicine. But the two-photon microscopy is more complex in the operations. Aiming at the confusion of new users on equipment selection, this paper briefly introduced the working principle of two-photon microscopy, sample preparation, imaging difficulties and the key points of equipment use and daily maintenance. And this paper also compared the differences of imaging principle, configuration parameters, imaging features and application field between two-photon microscopy and other similar imaging devices. Author summarized the application characteristics and advantages of two-photon microscopy so as to provide references for clinical practice, teaching and scientific research of medicine.
[Key words] T wo-photon microscopy; Application comparison; Maintenance; Laser confocal scanning microscopy
[First-author’s address] Center of Research Instrument, Zhongshan School of Medicine, Sun Y at-sen University, Guangzhou 510080, China.
[摘要] 双光子显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新精密仪器，具有低光毒性、高时空分辨率、高信噪比等优点，广泛应用于脑科学、免疫学、肿瘤、胚胎发育等生物医学相关研究领域。

但双光子显微镜操作较复杂，对于新用户而言对设备的选用存在一定困惑。

通过阐述双光子显微镜的工作原理、样品前期准备、成像难点及设备使用和日常维护要点，梳理双光子显微镜与其他同类成像类设备在成像原理、配置参数、成像特点及应用领域等方面的区别，总结双光子显微镜的应用特点及优势，为从事医学临床、教学及科研提供参考。

[关键词] 双光子显微镜；应用对比；日常维护；激光扫描共聚焦显微镜DOI: 10.3969/J.ISSN.1672-8270.2021.12.038
李 娟① 张岚岚① 吴珏珩①*
双光子显微镜的应用优势与维护要素
综 述
比[5]。

激光扫描共聚焦显微镜采用短波长的可见光激光，能量连续激发，对活细胞的光漂白及光毒性效应较强，且短波长的激发光因散射影响，穿透标本深度有限。

双光子显微镜使用飞秒激光器，激发只产生于焦点附近，无需共焦小孔的光栅滤光作用，从而提高成像亮度及信噪比。

光漂白及光损伤仅局限于焦点附近，可减小或消除光漂白及光毒作用等的影响，使实验可在保持生物体活性的前提下长时间进行，其采用波长较长的近红外激光，能量脉冲式激发，比可见光在生物组织中的穿透力更强[6]。

根据相关研究，双光子显微镜成像技术在模式动物如猴、大小鼠、斑马鱼等的脑、脊髓、肝脏、肺等多个脏器的Z轴层切和时间序列多维活体成像，以及离体组织、厚组织切片样品与透明化组织器官的三维多色荧光成像方面具有优势[7-11]。

相对于传统激光扫描共聚焦显微镜110 μm的成像深度极限，双光子显微镜成像深度可达800 μm。

对于透明化样品，传统激光共聚焦和转盘式共聚焦等成像深度均＜500 μm，而双光子显微镜可实现8 mm厚度的样本三维成像。

双光子显微镜与传统激光扫描共聚焦显微镜的比较见表1。

1.2.2 活体成像分辨率高
双光子显微镜适合模式动物活体成像，但其与另
表1 双光子显微镜与传统激光共聚焦显微镜比较
表2 双光子显微镜与小动物活体成像系统在活体成像功能方面的比较
性能双光子显微镜传统激光共聚焦显微镜适合标本活动物、厚组织、活细胞贴壁细胞、组织切片
激发光近红外，长波长，可调(690～1300 nm)可见光，短波长，固定(400～700 nm)检测深度活体标本≤800 μm，透明化标本≤8000 μm
普通标本≤110 μm，透明化标本≤500 μm 激发模式点激发，天然光学切片效果
Z轴向激发，通过针孔排除非焦平面信号
光毒性小大热毒性高
低荧光染料需摸索条件，活细胞样品标记与共聚焦类似，活体样品通过转基因、病毒标记、免疫荧光标记、小分子探针标记等方法
成熟稳定常用物镜25×红外专用水镜、25×透明化试剂物镜
63×油镜、100×油镜
光学分辨率≤单光子
XY轴分辨率200 nm，Z轴分辨率500 nm
光谱技术无光谱拆分/荧光拆分
维护难度
高
相对低
功能双光子显微镜
小动物活体成像系统激发光近红外，长波长，可调(690～1300 nm)可见光，短波长，430～850 nm 成像模式二维、三维或时间序列动态成像2D生物发光/荧光成像、3D断层扫描及重建荧光标记模式转基因，病毒标记，免疫荧光标记，小分子探针标记、血管注射染料等
荧光素酶基因标记、荧光报告基因(GFP、RFP)
或荧光染料(包括荧光量子点)标记
成像分辨率XY轴分辨率200 nm,XY轴分辨率20 μm至1 mm
成像视野对角线0.3～0.72 mm
约23 cm×23 cm 活体成像深度≤800 μm
颅内3～4 cm 样品处理
复杂，需手术暴露成像部位
简单，无损
一种小动物活体光学成像技术，又称为小动物体内可见光成像技术(如IVIS Spectrum小动物活体成像系统)在成像原理、成像分辨率、成像视野和成像深度等方面具有较大区别，见表2。

小动物体内可见光成像包括生物发光与荧光两种技术[12]。

利用报告基因产生的生物发光、荧光蛋白质或染料产生的荧光可形成体内的生物光源，实现生物发光或荧光的活体动物无损二维及三维成像，并具备生物发光及荧光的绝对定量功能。

但体内可见光成像技术的空间分辨率较低，结构信息不足[13]。

使用可见光成像，分辨率约为20 μm至1 mm，因此，目前的小动物体内可见光成像系统多结合传统的形态学成像技术，如CT、MRI 及超声等使用，实现图像的重构和数据的可视[14]。

另一种激光片层扫描成像技术通过激发光路与检测光路垂直的设计，实现对样品单一层面照明，其光损伤小、光毒性及光漂白性小，同样适用于活体样品长时间成像[15]。

但光片显微镜一般配置低倍物镜，成像视野大，但分辨率不高。

近年来，光片荧光显微镜与超分辨技术结合成为成像热点模式，如受激辐射损耗-光片荧光显微镜(STED-SPIM)等，且光片显微镜从不同视角对整个样品成像后，需通过重组不同视角的信息来提高图像的分辨率，然后使用特殊的去卷积算法提高图像质
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表3 双光子显微镜与激光片层扫描显微镜比较
功能双光子激光共聚焦显微镜激光片层扫描显微镜激发光近红外，长波长，可调(690～1300nm)可见光，405～650nm
成像功能猴、大小鼠、斑马鱼等模式动物活体XYZT多维成像，离体组
织、厚组织切片样品和透明化组织器官的三维多色荧光成像
斑马鱼、果蝇、线虫、拟南芥、胚胎等的活体XYZT多维成
像，透明化的组织器官三维多色荧光成像
扫描模式点扫描成像面成像
成像速度≥1fps(512×512)≥50fps(1024×1024) 柱面镜法光片成像物镜25×、40×、60×2×～20×
成像视野对角线0.3～0.72mm对角线120μm至3.5mm
成像深度活体样品≤800μm，透明化样品≤8mm活体样品≥5mm，透明化样品≥10mm
量，图像容量大，对配套工作要求较高。

对比其他活体光学成像技术，双光子显微镜分辨率更高，其X、Y轴分辨率为200nm，Z轴分辨率为500nm，可用于细胞及亚细胞结构的多维成像。

如活体神经元树突及胶质细胞成像、神经元内钙离子动态的实时监测、胞内3D空间的光漂白(如光漂白后恢复及光漂白荧光损失实验)、光刺激(如光活化、光转化及化合物解笼锁实验)以及光损伤(如近红外标记)[16-18]。

此外，双光子显微镜可结合二次谐波成像技术，具有非线性光学成像所特有的高空间分辨率及高成像深度，成像过程中无能量吸收，可从根本上消除对样品的光毒性及光损伤。

可对活体动物的微血管、胶原纤维等组织进行无标记在体成像，对组织的结构对称性变化高度敏感，可用于对于某些疾病的早期诊断或术后治疗监测等研究[19]。

1.2.3 适合较大模式动物的活体深层成像
双光子显微镜镜下空间大，广泛应用于猴、大小鼠、斑马鱼等较大的模式动物的活体成像。

且可结合电生理技术、光遗传技术，广泛应用于麻醉、清醒或运行行为等生理状态下的动物脑科学神经相关研究，在单细胞、单树突精度上对神经元群体活动进行监控。

如结合膜片钳技术，对活体脑组组急性切片神经元进行双光子深层成像[20]；结合光遗传技术，实现视觉皮层同一神经元和神经元群体的稳定操控和长期多次重复记录[21]；对在健身球上移动的头部固定小鼠小脑进行成像，探讨觉醒状态和运动行为对胶质网络中钙离子的激发的影响[22]；结合多种疾病模型，探讨大脑皮层神经元及胶质细胞活性的改变及作用等[23]。

与双光子显微镜不同，多数激光片层扫描系统通过移动或旋转样品(或使光片从X、Y、Z方向扫过样品)进行3D成像，样品制备及载物形式独特，荧光标记的模式生物需包埋在低熔点琼脂糖中，或将样品围封在透明氟塑料管中。

受限于载物方式，激光片层扫描主要应用于斑马鱼、果蝇、线虫、拟南介等小型模式生物的活体观察成像。

在形态发育与胚胎形成、器官发育与细胞动力学、三维细胞培养等方面应用广泛。

双光子显微镜与激光片层扫描显微镜的比较见表3。

2 双光子显微镜成像的技术难点
双光子显微镜成像的实验步骤大概分为：样品前处理、样品固定、仪器操作及图像处理。

仪器操作相对简单，大致与传统激光共聚焦显微镜操作类似，用户经过培训一般可独立操作，其中样品的前期处理及固定是其成像的重难点。

2.1 厚组织样本成像难点
不同于激光共聚焦显微镜的组织切片样品或培养细胞样品可直接上机观察成像，双光子显微镜的样品需经过前处理才能上机观察，其中离体组织需用琼脂糖或生物胶固定在培养皿中，加磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)没过样品，保证样品不漂移，并能与物镜形成稳定的水介质接触，方可上机成像。

透明化组织样本前处理则较复杂，需通过使用化学试剂去除造成光散射及光吸收的组分，从而使组织内部光学特性均质及折射率均一，使深度3D组织成像成为可能。

Richardson[24]具体比较了不同透明化技术，透明化技术大致分为两种：基于有机溶剂的透明化法和水基透明法，其中水基透明化无毒，不会使样品发生大的形变且不会损伤浸入式的物镜，但透明化效果不好，仅适用于小样品且制样流程复杂，时程长达几周；溶剂透明化效果更好，但有一定毒性，会造成非特定设计的物镜损伤，并使样品缩小。

不同的组织样品需根据实际情况透明化处理，缺乏透明度将导致很难得到高信噪比的图像。

2.2 活体成像实验难点
由于光散射，目前的双光子显微镜活体成像深度≤1mm[25]。

器官的可视化仅限于浅表组织如皮肤，其他脏器的在体成像一般需手术暴露成像部位，尤其腹腔内的组织需进行较大的外科暴露手术，手术中易感染导致炎症细胞浸润，从而影响实验结果，对于需数天长时间观察成像的实验，对手术操作的要求更高。

术后出血、感染、死亡等问题的出现，使实验的
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失败率很高。

同时活体成像由于受到呼吸及心跳影响，还需选择合适的麻醉方式及成像部位的固定方式，尽量减少抖动对成像的影响。

此外，正置双光子显微镜一般配置红外水镜，且物镜角度不可调节。

活体成像过程中，会因稳定性不足造成样品与物镜间的水缺失而丢失成像焦面。

脑部由于远离心脏，且颅骨位置相对其他脏器，较容易固定和成像。

脊髓和腹部脏器更容易受到呼吸及心跳的活动的影响，固定难度较大。

需特定的金属环、金属支架等进行固定，目前市场上除了小鼠头部固定适配器器已有商业化产品，其他固定适配器均需根据具体实验自制或定制。

3 双光子显微镜成像技术与其他成像技术比较
尽管双光子显微成像技术具有多种优势和宽泛的应用范围，但与其他同类成像技术相比，仍存在以下不足。

3.1 多色成像易串色
双光子显微镜虽可用于观察常规玻片样品及培养细胞，但不能取代传统激光扫描共聚焦显微镜。

一方面，传统共聚焦成像分辨率更具优势，另一方面，激光共聚焦显微镜更适合多色成像，而双光子显微镜一个激发光很可能激发多个荧光而导致串色。

3.2 活体成像实验流程复杂
双光子显微镜在活体光学成像方面的分辨率较高，可观察亚细胞结构。

但其成像视野及成像深度不及小动物活体成像，且小动物活体成像系统可实现活体动物的无损成像，而双光子显微镜活体成像的实验前期样品处理手术及样品固定步骤复杂，脑部成像需磨薄颅骨，其他如肝脏、肺、脂肪、淋巴结等软组织脏器则需通过手术暴露成像部位，活体成像时，还需要良好的麻醉及特定的脏器适配器固定，以抑制因呼吸及心跳导致的图像抖动问题。

3.3 成像速度不高
双光子显微镜使用低量子效率(quantum efficiency，QE)的光电倍增管(photomultiplier tube, PMT)点扫描成像，成像速度不高。

如一个完整的透明化鼠脑使用25×物镜成像，在常见的1 fps成像速度下，耗时极长。

所以目前双光子显微镜的透明化样品成像一般只扫描小部分区域而非整个样品。

而激光片层扫描显微镜因其成像视野大及成像速度快，对于无需高倍成像的透明化样品更合适。

3.4 维修成本高
双光子显微镜使用红外飞秒脉冲激光器，成本昂贵。

其他配件如25×红外水镜和25×透明化试剂专用物镜同样价格不菲。

尤其放置于平台共享的设备用户多且使用频率高，导致设备损耗较快，如何规范操作并密集维护，是保障该设备稳定运行的重要因素。

4 双光子显微镜的维护
因共享率高，而设备配件普遍维修成本昂贵，设备的维护对于为维持设备的良好性能，提高设备的共享效能就显得非常重要。

中山大学中山医学院公共技术平台2016年配置一台正置双光子显微镜(Olympus FVMPE-RS)，面向校内外开放共享，年使用机时超千小时。

根据双光子激光共聚焦仪器特点和实际使用情况，仪器保养和维护重点为激光器、物镜、检测单元、荧光光源等。

4.1 激光器维护
(1)保持实验室内环境清洁及环境温湿度的稳定，环境温度保持在21 ℃左右。

(2)开启激光器前，需先开启激光器水冷机，待水冷机温度下降至稳定状态后，再开启激光器。

避免频繁开关。

(3)保持激光器水冷机出、入风口通风顺畅，每月拆洗或更换水冷机进风口灰尘过滤网，提高散热性。

(4)循环水的水质及水温会影响激光器的使用寿命，需每隔3个月更换激光器水冷机的循环水。

更换时先关闭激光器电源，再关闭水冷机，用导流管将水冷机内的脏水排出，再重新加入灭菌的去离子水或专用的致冷液。

(5)每半年清洗或更换水冷机过滤器滤芯。

(6)每年进行激光器例行保养，测试各条激光谱线的功率并出具测试报告。

如功率低于正常范围需维护至正常值。

(7)留意激光器内部湿度情况，相对湿度＞15%将影响激光稳定性，需更换激光器专用干燥剂。

(8)配备UPS，以备突然停电等情况对激光器的影响。

4.2 物镜维护
(1)双光子显微镜专用25×水镜(N.A1.05,WD，2 mm)物镜较长，在上下样品及调焦时需小心，以防撞到物镜。

(2)水镜使用后，需用擦镜纸蘸取超纯水擦拭清洁，如物镜与液面接触的部分有盐结晶，出现彩色光晕，可使用超纯水浸泡物镜接触液体的部分。

(3)部分透明化试剂可能会腐蚀透明化试剂专用物镜。

使用前需留意透明化试剂的成分、折射率以及配置的物镜所支持的折射率范围。

以奥林巴斯FVMPE-RS型25×双光子显微镜水浸物镜(Olympus X L S L P L N 25X S V M P )为例，其支持折射率在1.33～1.52的多种透明化试剂。

透明化试剂物镜使用后，需用无水乙醇浸泡物镜接触试剂的部分，再用擦镜纸蘸取无水乙醇擦拭清洁。

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4.3 检测单元
(1)双光子显微镜荧光检测器包括光电倍增管(photomultiplier tube，PMT)和制冷型超高灵敏度磷砷化镓(GaAsP)二极管，二者均为其重要配件。

电压过高对检测器的损耗大，在扫描设置时需留意PMT的电压(high voltage，HV)值不宜超过800，GaAsP二极管的HV值不宜超过500。

(2)因检测器灵敏度较高，显微镜需安装遮光罩以避免外界光源对成像的干扰。

4.4 荧光光源
镜下观察时使用的长寿命荧光光源，开启后需预热5 min。

关闭后，需冷却30 min后才能再次开启。

4.5 数据拷贝
需使用光盘刻录拷贝数据，禁止使用U盘等移动装置。

5 展望
中山大学中山医学院公共技术平台于2016年配置一台奥林巴斯FVMPE-RS型双光子显微镜物镜，仪器使用率高，满足了学院内外多个课题组在相关研究方面的需求。

同时在实际工作中发现，因平台有多台成像类设备，新用户对于设备选型及各自的功能优势不甚了解，对于双光子激光共聚焦显微镜仪器其他类似设备适用的样品和实验类型的咨询较多。

经比较双光子显微镜与其他类似设备的功能特色和应用范围，以供用户根据具体实验需求选择及使用。

双光子显微镜成像技术以其高空间分辨率、高穿透深度等优点, 已广泛应用于生物医学领域。

目前传统的双光子显微成像技术发展已较为成熟, 但双光子显微镜具备一定局限性，如多色成像容易串色、小鼠脑活体成像深度仅限白质层、设备配置复杂、成本昂贵等。

随着技术的发展，出现了多种新的相关成像技术，如双光子激发荧光寿命显微成像、多光子显微成像及微型双光子显微镜成像技术，在成像性能和成像深度等方面有进一步的改进[26-29]。

随着多种双光子显微镜系统的出现，双光子显微镜成像技术将以其实时、无损地探测、诊断及检测能力，在生物医药及临床医学应用中发挥更大作用。

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