加味四逆散对大鼠肝纤维化的改善作用

■实验研究■doi：10.3969/j.issn.1005-0264.2021.04.017
加味四逆散对大鼠肝纤维化的改善作用*
晁利芹王付A
河南中医药大学中医药科学院(河南郑州，450046)
摘要目的:探讨加味四逆散对猪血清诱导的大鼠免疫损伤性肝纤维化的改善作用，为加味四逆散的科学应用提供依据。

方法:采用腹腔注射未灭活猪血清联合保持激怒饥饿状态建立大鼠肝纤维化模型。

造模结束后，连续56d灌胃加味四逆散(7mg/kg)及秋水仙碱(0.2mg/kg)。

观察各组大鼠中医症候指标、肝脏系数变化；测定血清肝功能、纤维化标志物的含量;肝组织TGF-p/Smad信号通路相关基因表达水平；MASSON染色观察肝组织病理学变化。

结果：与模型组比较，阳性药物秋水仙碱组、加味四逆散组、预防组大鼠的肝脏系数，血清肝功能，纤维化标志物含量均显著下降(P<0.05)；总蛋白、白蛋白、白球比水平均显著上升(P<0.05),血清球蛋白含量显著下降(P<0.05)；体质量虽有增加，但与模型组无显著差异(P>0.05)；TGF-|31、Smad3mRNA表达均显著下降(P<0.05),Smad7mRNA表达显著升高(P<0.05)。

此外,加味四逆散组、秋水仙碱组、预除组之间结果无显著差异(P>0.05),但均未恢复到正常水平。

肝脏病理组织切片结果显示加味四逆散组、阳性药物组、预防组肝脏病变程度明显减轻。

结论:加味四逆散对猪血清联合激怒饥饿状态诱导大鼠肝纤维化具有改善疗效，且与秋水仙碱有相似的治疗效果。

关键词加味四逆散;猪血清;肝纤维化
中图分类号R289.3；R259文献标志码A
Improved effect of Supplemental Sini San on hepatic fibrosis
CHAO Li-qin,WANG Fu^.Henan university of traditional Chinese medicine(Zhengzhou Henan,450046)China Abstract Objective:To investigate the effect of Supplemental Sini San on the immune induced liver fibrosis induced by porcine serum in rats,and to provide evidence for the scientific application of Supplemental Sini San.Methods:Rat liver fibrosis model was established by in­traperitoneal injection of non inactivated pig serum in combination with maintaining irritability.After the end of modeling,the stagnation of sedum and colchicine(0.2mg/kg)were administered intragastrically(7mg/kg)for56days.The changes of TCM symptom index and liver coefficient of rats in each group were observed.The levels of serum liver function and fibrosis markers were determined.The expression levels of TGF-p/Smad signaling pathway-related genes in liver tissues were observed.The pathological changes of liver tissues were observed by MASSON staining.Results:Compared with the model group,the liver coefficient,serum liver function and fibrosis markers of the positive drug colchicine group,Supplemental Sini San group and prevention group were significantly decreased(P<0.05)；total protein,white Pro­tein and white spheres increased significantly(P<0.05),serum globulin content decreased significantly(P<0.05);although the body mass increased,there was no significant difference between the model and the model group(P>0.05);TGF-pl,Smad3mRNA The expres­sion was significantly decreased(P<0.05),and the expression of Smad7mRNA was significantly increased(P<0.05).In addition,there was no significant difference between the Supplemental Sini San group,the colchicine group and the prevention group(P>0.05),but none of them returned to normal levels.The results of liver pathological biopsy showed that the degree of liver lesions in the Supplemental Sini San group,the positive drug group and the prevention group were significantly reduced.Conclusion:Supplemental Sini San has improved curative effect on liver fibrosis induced by porcine serum combined with irritability and starvation,and has similar therapeutic effect with colchicine.
Key Words:Supplemental Sini San；pig serum；liver fibrosis
肝纤维化是肝损伤发展至肝硬化的中间环节，及时阻断或逆转肝纤维化的发生至关重要，但西药抗纤维化毒副作用基金项目：河南中医药大学博士基金(No.BSJJ2016-11),国家自然科学基金项目(N。

.81804196)；△通讯作者,E-mail：1034383171@
较大，寻找毒副作用小的中医药治疗方法成为了当今热点。

肝纤维化属于中医的“郁证”、“胁痛”、“痞满”、“腹痛”、“积聚”、“癥痕”、“鼓胀”等范畴，病机符合肝气郁滞、脾胃虚弱、络脉瘀阻⑷，治以加味四逆散，疏肝健脾、益气养血，可阻断或逆转肝纤维化，且毒副作用小。

本研究探讨了加味四逆散对猪血清诱导的大鼠免疫损伤性肝纤维化的影响,现报道如下。

1材料与方法
1.1实验药物加味四逆散由柴胡、枳实、白芍、人参、白术、茯苓、炙甘草、昆布各10g所组成，实验所用中药材购自河南中医药大学第三附属医院,水煎并浓缩为含生药3.75g/ml的药液,4%冰箱保存备用。

秋水仙碱片（西双版纳制药厂）研碎，用0.2%竣甲基纤维素钠配制0.75%。

混悬液。

1.2实验动物及饲料SPF级雌性Wistar大鼠100只，体重（120±10）g,由河南省实验动物中心提供，许可证号〔SCXK （豫）2017-0001］；动物颗粒饲料，购于河南省实验动物中心，许可证号〔SCXK（豫）20154005〕。

1.3实验方法
1.3.1实验动物分组本研究获得河南中医药大学实验动物伦理委员会许可，大鼠按照河南中医药大学实验动物保护与使用规则饲养。

实验室相对封闭，自然采光良好，实验室相对温度控制在20-25%：之间，相对湿度控制在60%左右,12h 明暗交替，自由摄食进水。

适应性饲养7d后,100只大鼠按体重随机分为空白组、模型组、秋水仙碱组、加味四逆散组、预防组，每组20只。

1.3.2肝纤维化模型制备参考文献报道方法用猪血清诱导免疫损伤性肝纤维化模型〔旳。

除正常组外,其余各组均腹腔注射未灭活的猪血清,0.5ml/次/只，每周两次;第5周之后，每2~3只大鼠关在一笼内,用尖端包纱布的止血钳钳夹其中一鼠鼠尾，使其保持激怒状态并与同笼鼠争斗撕咬，以不破皮流血为度，每次刺激5min,2次/d,同时每周皮下注射0.1%肾上腺素0.2ml；隔2日喂食，喂食日食量不限,8周后即可形成气郁脾虚瘀阻证肝纤维化。

动物模型成功判定:空白组和参与造模组之间，血清肝功能、肝纤维化指标差异显著，肝纤维化大鼠肝脏组织病变明显，胶原沉积。

1.3.3给药方法预防组大鼠于造模同时给药，每天按7mg/kg剂量给予疏肝健脾通络法方药灌胃，连续给药16周；造模后第9周，模型组和空白组大鼠分别给予与预防组等量的生理盐水灌胃，加味四逆散组大鼠每天按7mg/kg剂量给予加味四逆散药液灌胃，秋水仙碱组大鼠每天按0.2mg/kg剂量给予0.75%。

秋水仙碱混悬液，至第16周末结束。

1.3.4实验样品收集末次灌胃后，大鼠禁食不禁水2h,腹主动脉取血后3000r/min离心15min,收集血清,于-80t保存备用。

采血完毕后，剖腹迅速取出完整肝叶,用冷盐水漂洗除去表面血液，滤纸拭干称重，计算肝脏系数,肝脏系数可以大体判断脏器病变的程度和性质，肝脏系数（％）=肝质量（g）/体质量（g）X1000除净周围的结缔组织，取肝右叶置于-80T低温冰箱保存、备检。

取肝左叶立即置于10%甲醛溶液固定48h,脱水、包埋、切片,MASSON染色后在光学显微镜下观察肝脏组织病理学变化。

1.3.5观察指标①一般中医症候指标，包括体重、外观行为（毛发色泽、行为、饮食、精神状态等）；②肝功能指标，包括血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、*谷氨酰转肽酶（GGT）、碱性磷酸酶（ALP）、球蛋白（Gio）、白蛋白（Alb）、白球比（A/G）、总蛋白（TP）；③肝纤维化指标，包括IB型前胶原氨基末端肽（pcm）.iv型胶原（C IV）、层粘连蛋白（LN）、透明质酸（HA）；④大鼠肝组织丁6八pl、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7mRNA表达水平。

1.4统计学方法用Fisher，PLSD进行统计学处理,计量资料数据用i±s表示,两组间均数比较采用t检验;多组间均数比较进行正态性、方差齐性检验后，采用One-Way ANOVA分析，组间两两比较采用UD法，以a=0.05作为检验水准,P< 0.05判断差异有统计学意义。

2结果
2.1加味四逆散对实验大鼠一般情况的澎响实验结束，空白组大鼠精神状态良好，行动灵巧，皮毛有光泽，食欲佳，大便正常。

模型组大鼠精神萎靡不振，行动迟缓，懒动，皮毛无光泽，纳差，腹胀，腹泻。

加味四逆散组大鼠皮毛光滑，活动力强，饮食尚可,大便可，体重有所增加。

2.2加味四逆散对实验大鼠肝脏系数的影响见表1。

表1各组实验大嚴肝脏系数的比较G±s）
组别例体质量（音）肝脏系数（％）
空白组20504±58 2.48±0.14
模型组20346±32
* 3.23±0.36
*
秋水仙碱组20431±21*# 2.61±0.23理
加味四逆散组20429±23理 2.64±0.19理
预防组20468±27*# 2.59±0.18
*#与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较,#P<0.05
2.3加味四逆散对实验大鼠肝功能的影响加味四逆散能有效改善实验大鼠肝功能,降低肝损伤程度，但在实验阶段大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT含量还不能恢复至正常范围，见表2。

加味四逆散可提高实验大鼠肝脏合成蛋白质的能力，改善肝脏损伤程度，见表3。

2.4加味四逆散对实验大鼠肝纤维化指标的影响加味四逆散可以降低大鼠肝纤维化水平，对大鼠肝纤维化具有改善作用，见表4。

2.5加味四逆散对大鼠肝组织TGF-pl、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7mRNA表达的影响加味四逆散组可以降低大鼠肝组织中TGF-pi,Smad3mRNA表达水平，保持Smad7mR­NA表达水平，见表5。

表2各组实验大鼠肝功能的比较（U/L 忆土s ）
与空白组比较，*P<0. 05；与模型组比较,#P<0. 05
表4各组大鼠血清肝纤维化指标的比较（Mg/L,%±s ）
组别
例数
ALT AST ALP GGT 空白组2043.78 ±182.34 土19.67 土
42.63 ±7.8910.72 2.37
3.23
模型组20139.78 ±376.05 ±163.98 ±101.09 ±
20.62
*10.45*7.45*7.02*秋水仙碱组
2070.89 ±
244.97 土40.80 土
56.60 土5.58"13.51*# 6.34" 4.45*#加味㈣逆散组
2074.79±226.90 ±3& 90 土56.49 ±3.71*#19.35"
5.24
*# 3.19*#
预防组
20
58.29±202.12 土
34.10 土
50.38 ±
6.34*#
5.54*# 3.02*# 2.54
*#与空白组比较，*P<0. 05；与模型组比较,#P<0. 05
表3
各组大鼠血清蛋白含量及A/G 的比较（%±5)
组别
例Alb(g/L)Glo(gZL)TP(g/L)A/G
空白组
2035.01 ±
40.23 ±
76.68 ±
0.87 ±1.03 1.87 1.970.045模型组2026.73 ±45.75 ±73.27 ±0.58±1.69
* 1.43
* 2.11 *0.057*秋水仙碱组
2033.01 ±43.35±75.45 土0.76 土1.99# 1.66* 2.17#0.058#
加味㈣逆散组
2032.89 ±43.46 ±76.02 ±0.76±1.62# 2.30#
2.68#
0.011#预防组
20
34.98 ±42.49±75.69 ±
0.82±1.01#
1.05*
2.21#
0.023#
与空白组比较，*P<0. 05；与模型组比较,#P<0. 05表5 各组大鼠肝组织中TGF-pl s Smad25Smad35Smad4%
组别
例HA pcm C1V LN
空白组20100.85 ±62.94 土78.40 土
122.91 ±10.32
10.2317.3014.09模型组
20257.11 ±
105.38 ±109.09 ±228.85 ±32.39*14.29
*18.25*23.45
*秋水仙碱组
20126.22 ±75.40 ±81.41 土145.29 土23.31#
15.41#14.06#
31.32#加味㈣逆散组
20134.26 ±85.31 ±86.50±145.31 ±33.09#9.47#
19.24#30.31#预防组
20
115.05 ±80.30 ±82.52±134.01 ±18.21#
10.45
*10.27#
30.12#
Smad7 mRNA 水平的比较 （％ 土s ）
组别例TGF-01/Smad2Smad3Smad4
Smad7
空白组
200.83 ±
0.05 ±
0.16 ±
0.85 ±0.63 ±0.920.200.120.290.40模型组
209.95 ±0.59±0.83± 1.23 ±0.11 土2.48*0.35
*0.15
*0.33*0.44*秋水仙碱组
20 4. 11 ±0.58 ±
0.67 ±
1.21 ±0.60±0.99
*#0.39*#0.07*#0.26*#
0.43#
加味四逆散组20 4.88 ±0.58 ±0.68 ± 1.21 ±0.60 土1.09*#0.24*#0.08"0.28**0.42#预防组
20
4.06±0.58 ±0.62± 1.21 ±0.62±0.67 川
0.41
*#0.03*#
0.21 *#
0.32#
与空白组比较，*P<0. 05；与模型组比较,#P<0. 05
2.6加味四逆散对实验大鼠肝组织病理学变化的影响肝
脏外观观察结果:空白组大鼠肝脏表面光滑，质地柔软，边缘
锋利;模型组大鼠肝脏表面粗糙,质地偏硬,体积偏大,边缘变
钝;秋水仙碱组、加味四逆散组、预防组大鼠均肝脏表面尚光
滑，质地尚柔软，边缘锋存在。

镜下观察MASSON 染色，空白
组大鼠仅见汇管区有少量的纤维组织。

模型组大鼠肝脏见大
量纤维组织增生,假小叶形成。

秋水仙碱组、加味四逆散组、 预防组大鼠均可见有较少纤维组织增生，提示其具有良好的
改善疗效，见图1。

图1各组实验大鼠肝脏组织病理改变图（MASSON 染色,400 x ）（A,空白组;B,模型组;C,秋水仙碱组;D,加味四逆散组;E,预防组） 3讨论
肝硬化或肝癌是严重危害人民健康的重大疾病,具有较
高的致病率、致死率，严重危害人类健康，给患者身心带来极
大痛苦，增加家庭及社会的经济负担。

肝纤维化是慢性肝病
与肝硬化、肝癌的中间环节，及时阻断或逆转肝纤维化的发
生、发展成了防治肝硬化、肝癌的关键一步。

大量研究证实，
中药复方在防治肝纤维化的方面具有一定优势。

本研究主要
探讨基于疏肝健脾通络法下的加味四逆散抗肝纤维化的作用 机制。

采用腹腔注射猪血清制备免疫损伤性肝纤维化模型，能
反映肝纤维化的发病机制与病理变化。

猪血清中白蛋白是外 来异体抗原,多次注射可引起变态反应,加剧血管内皮细胞的
损伤，促进血小板聚集和红细胞聚集，肝纤维化成模后，联合 止血钳钳夹鼠尾激怒法及暴饮暴食的隔日喂食的脾虚方法,
从而使造模动物产生肝郁脾虚络瘀证的病理状态，并与肝郁
脾虚络瘀证的中医病机相符合。

本研究采用腹腔注射未灭活 猪血清联合保持激怒饥饿状态的方法，使实验大鼠肝脏系数、
血清肝功能、血清肝纤维化指标显著升高,Alb 、TP 、A/G 显著
下降,肝组织TGF-Bl 、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA 表达水平均
显著升高,Smad7 mRNA 表达水平显著下降，在灌胃加味四逆
散56 d 后，上述指标均有不同程度地改善，且在实验时间范围 及实验剂量与药物秋水仙碱具有相近的疗效。

ALT 、AST 、ALP 、GGT 是反映肝脏功能的重要指标，当肝细
胞损伤或坏死时,血液中ALT 、AST 、ALP 、GGT 的含量就会升 高。

肝脏是蛋白质合成的重要场所。

当肝细胞受到损害，蛋
白质的合成、运输、释放将会受到影响，含量会下降。

加味四 逆散能够降低实验大鼠血清ALT 、AST 、ALP 、GGT ,减轻肝损
伤、促进肝脏蛋白质合成,改善肝功能。

HA 、PCHI 、CIV 、LN 是
反映肝纤维化的重要指标。

HA 水平含量能灵敏的反映肝纤 维量;PC HI 反映肝纤维合成和炎症活动性状况;C1V 是最初形
成的纤维,可敏感地反映肝炎向肝纤维化转变发展的程度和
过程,是肝纤维化早期诊断的重大指标;LN 反映肝脏的受损 程度,可判别是否存在活动性肝纤维化的指标。

加味四逆散
能够降低实验大鼠血清HA 、PCHI 、CIV 、LN 含量，改善实验大 鼠肝纤维化。

研究表明TGF-p/Smad 信号转导通路是肝纤维 化最关键的细胞信号通道。

TGF-pl 与肝星状细胞膜受体结
合，活化该受体，继而磷酸化Smad 蛋白，其中，p-Smad2、p-
Smad3诱导形成TGF-p/Smad 复合物，活化肝星状细胞及细胞
外基质。

然而,Smad7属于抑制Smad 蛋白,p-Smad7的表达上
调，可以抑制Smad2、Smad3的磷酸化而阻断肝星状细胞转型，
减弱肝星状细胞内TGF-p/Smad 信号转导，阻断胶原蛋白
合成。

研究结果说明加味四逆散具有抗肝脏纤维化的治疗作
用,方中柴胡疏肝解郁;枳实降气导滞，与柴胡配伍，柴胡偏于
升，枳实偏于降，一升一降，调理肝脾，疏达气机;芍药益血敛
肝，与柴胡配伍，柴胡偏于散，芍药偏于敛，一散一敛,调理气
机;人参补益中气；白术健脾益气，与人参配伍，人参偏于生 津，白术偏于燥湿;茯苓益气利湿;昆布咸、寒，入肝、肾经，软
坚散结，价廉且可长期服用;甘草益气缓急，既能防柴胡疏散
太过,又能防枳实降泄太过,更能助芍药收敛缓急，还能助人
参、白术、茯苓健脾益气。

方药相互为用，以奏疏肝健脾，益气
养血，软坚散结，以此治疗可以改善肝功能及肝纤维指标，毒
副作用小，值得进一步研究。

参考文献
[1 ] Bassiouny AR , Zaky AZ , Abdulmalek SA , et al. Modulation of P-
endonucleasel levels associated with hepatic cirrhosis in rat model
treated with human umbilical cord blood mononuclear stem cells]J], kit J Clin Exp Pathol, 2011 ；4(7) ：692 - 707.
[2]
黄志刚，翟为溶,张月娥，等•异种动物血清诱导的大鼠肝纤维
化模型及其机制[J].上海医科大学学报，1997,24 (5)：
351 -354.
[3]
Osuna-Martinez U , Reyes-Esparza JA , Petricevich VL , et al. Pro ­
tective effect of thymic humoral factor on porcine serum-induced he ­patic fibrosis and Ever damage in Wistar rats [J ]. Ann Hepatol,?
2011, 10(4);540 -551.[4]
Queisser N , Happ K , Link S , et al. Aldosterone induces fibrosis , oxidative stress and DNA damage in livers of male rats independent
of blood pressure changes [ J]. Toxicol Appl Pharmacol , 2014,
280(3):399 -407.
引证本文 晁利芹，王付.加味四逆散对大鼠肝纤维化的改善作
用[J].中西医结合肝病杂志,2021,31(4) ：352 -355.
(修回日期:2020-11 -20 编辑：高 翔)
欢迎关注《中西医结合肝病杂志》微信公众号
为了加强期刊数字化建设,更好地为读者服务,《中西医结合肝病杂志》已开通官方微信公众号。

可以通过微信“扫一扫”本刊 微信公众号二维码,或在微信“添加朋友”中查找“zxyjhgbzz ”或“中西医结合肝病杂志”，即可关注。

关注微信公众号后，可及时了解
中西医结合肝病领域的新动态以及本刊的最新资讯，查阅并下载已发表的论文，查询稿件处理状态等等。

《中西医结合肝病杂志》
编辑部。