当归4—香豆酸辅酶A连接酶基因克隆与组织表达分析

当归4—香豆酸辅酶A连接酶基因克隆与组织表达分析

4-香豆酸辅酶A连接酶（4-coumarate coenzyme A ligase，4CL）为高等植物苯丙烷代谢途径关键酶之一，在当归阿魏酸的生物合成中起调控作用。研究利用同源克隆结合cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆当归4CL编码基因全长cDNA序列，并用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析4CL基因在当归幼苗生长过程中根、茎、叶组织中的表达特征。结果表明，获得的4CL cDNA序列（在GenBank已注册，登录号为KT880508）全长1 815 bp，含有1个1 632 bp 的完整开放阅读框（opening reading frame，ORF），编码544个氨基酸的多肽链。4CL基因在当归幼苗不同生长阶段的根、茎、叶组织中均有表达，随着苗龄增大，茎、叶中的相对表达量显著增加（P＜0.05），而根中表达量变化不大，表明4CL 基因在当归幼苗中的表达具有明显的时空性。该研究为进一步研究4CL基因的结构与功能，解析当归阿魏酸的合成代谢机制和时空调控的分子基础奠定了工作基础。

标签：当归；4-香豆酸辅酶A连接酶；基因克隆；基因表达

[Abstract] 4-coumarate coenzyme A ligase is a key enzyme of phenylpropanoid metabolic pathway in higher plant and may regulate the biosynthesis of ferulic acid in Angelica sinensis. In this study，the homology-based cloning and rapid amplification of cDNA ends （RACE）technique were used to clone a full length cDNA encoding 4-coumarate coenzyme A ligase gene （4CL），and then qRT-PCR was taken for analyzing 4CL gene expression levels in the root，stem and root tissue at different growth stages of seedlings of A. sinensis. The results showed that a full-length 4CL cDNA （1 815 bp）was obtained（GenBank accession number：KT880508）which shares an open reading frame （ORF）of 1 632 bp，encodes 544 amino acid polypeptides. We found 4CL gene was expressed in all tissues including leaf，stem and root of seedlings of A. sinensis. The expressions in the leave and stem were increased significantly with the growth of seedlings of A. sinensis（P＜0.05），while it in the root showed little change. It indicates a time-space pattern of 4CL gene expression in seedlings of A. sinensis. These findings will be useful for establishing an experiment basis for studying the structure and function of 4CL gene and elucidating mechanism of ferulic acid biosynthesis and space-time regulation in A. sinensis.

[Key words] Angelica sinensis；4-coumarate coenzyme A ligase；gene cloning；gene expression

doi：10.4268/cjcmm20152418

阿魏酸（ferulic acid，FA）是当归Angelica sinensis等中药材的有效成分之一，也是《中国药典》规定的质量控制指标之一[1-2]。药理学研究表明，FA具有抗炎、抗氧化、清除自由基、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、改善神经炎症、神经

保护和辐射防护等药理作用，在医药、保健品、食品添加剂及化妆品领域作为原料而被广泛应用[3-6]。FA为苯丙酸类有机酸，是苯丙烷类代谢途径的重要衍生物之一[7]。4-香豆酸辅酶A连接酶（4-coumarate coenzyme A ligase，4CL，EC6.2.1.12）为参与苯丙烷代谢途径许多酶系中的关键酶之一，也是一种重要的限速酶。在苯丙烷代谢途径中，4CL位于特异合成各种苯丙烷类衍生物代谢的关键转折点上，可催化FA形成相应的硫酯[8-10]。目前，4CL基因在枇杷Eriobotrya japonica[11]、覆盆子Rubus idaeus[12]、葛根Pueraria lobata[13]和丹参Salvia miltiorrhiza[14]等药用植物中被克隆，但未见有关当归4CL基因的研究报道。在活性调控功能研究方面，更多研究集中在对木质素生物合成量和组分的影响方面，但对非木质素类的中间衍生产物的影响研究并不多见。近年来，本课题组着手从分子水平解析当归品质形成机制的研究[15-16]，鉴于4CL基因在阿魏酸合成代谢途径中的重要性，本研究克隆当归4CL编码基因cDNA全长序列，并分析其在生长发育过程中特异性表达，为4CL基因结构与功能的研究及解析当归阿魏酸的合成代谢与调控机制的分子生物学基础提供参考依据。1 材料

1.1 植物

试验用当归品种为岷归1号，种子由甘肃省岷县药材技术指导站提供。采用营养钵（5.0 cm×5.0 cm×9 cm）育苗，培养基质由等比例的河沙、蛭石和珍珠岩混合而成。精选后的种子于2014年5月1日播种，5月20日左右出苗。幼苗在人工气候箱（型号LRH-300-GSI）中培养，条件为：光周期12 h·d-1，光照强度3 000～10 000 lx，昼夜温度25 ℃/15 ℃，相对湿度60%～80%。幼苗培育前期（5月20日—6月15日），每5 d浇灌1次50 mL 1/2的Hoagland营养液，6月15日—9月2日，每5 d浇灌1次50 mL的Hoagland全营养液[17]。分别在当归幼苗生长前期（7月17日）和后期（9月2日）上午10时选取长势一致的植株12株，立即清洗，用滤纸吸干，将根、茎、叶组织分离后装入自封袋中，置-80 ℃冰箱保藏，用作RNA提取材料。

1.2 试剂

所用的试剂（盒）主要包括：RNA提取试剂盒（Magen，广州），cDNA合成试剂盒（Promega，美国），SMARTer RACE cDNA 扩增试剂盒（Clontech，北京），Advantage2 PCR试剂盒（Clontech，北京），Taq DNA Polymerase（TaKaRa，大连），PCR产物克隆试剂盒（Promega，美国），Easy PureTM快速凝胶纯化试剂盒（TransGen，北京），qRT-PCR试剂盒（Promega，美国），DNA Marker （TransGen，北京），其他生化试剂均为进口或国产分析纯产品。

2 方法

2.1 总RNA提取与cDNA合成

总RNA采用植物柱式抽提试剂盒提取，操作步骤按试剂盒说明书进行，所得总RNA 溶于35 μL 去除RNase 的超纯水中。提取的总RNA经1%非变性琼脂糖凝胶电泳后，用化学发光分析系统（ChemiDoc XRS+，美国）成像，检测总