实验5 性染色质

实验5 性染色质：人类X染色质的观察
一. 实验目的
1. 掌握鉴定人类X染色质的方法，在显微镜下识别Barr小体的特征及其所在的位置。

2. 了解X染色体失活的有关理论假说以及失活染色体上的基因所控制的遗传性状特点。

二. 实验原理
1. Barr小体：雌性哺乳类动物细胞内的X染色体在间期仅有一条呈松散状态，参加细胞生理活动，另一条则保持异固缩状态，从而形成了X染色质，又称Barr小体。

Barr小体出现在哺乳动物雌性个体细胞的细胞核边缘，这主要是因为这条染色体处在失活状态所致。

它在DNA复制时总落后于其它常染色质，且大多出现在核膜边缘。

性染色质在人类中，正常男性个体不可能出现Barr小体，正常女性的细胞只可能出现一个Barr小体。

对于具有性染色体畸变的个体来说，Barr小体出现的数目等于细胞内X染色体的数目减1。

2. 剂量补偿效应（dosage conpensation）：是指XY型性别决定的生物，由X性染色体上的基因决定的性状在两性的表现几乎相同。

可通过两种途径实现：一是X染色体的转录速率的差异；二是雌性细胞中有一条X染色体在功能上是失活的。

3. X染色体失活的假说（Lyon hypothesis）：在正常的雌性哺乳动物的体细胞中，一条X 染色体在遗传上有活性，而另一条处于失活状态。

这种失活发生在胚胎发育的早期，失活是随机的。

但是一旦发生了失活，这个细胞的后代将处于失活状态。

X 染色体上的杂合基因将出现嵌合（mosaic）现象。

它可以解决一些问题但不是全部，如人类中的44AXO型个体表现为Turner综合症、44AXXY表现为Klinefelter综合症。

4. 利用X染色质的鉴别技术，可以对性染色体畸形、胎儿早期诊断等提供有益的参考。

三. 实验用具及材料
显微镜、载玻片、盖玻片、牙签、吸水纸、离心机、吸管、固定液（甲醇与冰醋酸二者体积比为3:1）、2.0g/L甲苯胺蓝染色液、生理盐水等。

四. 实验方法及步骤
1．取材：先漱口，将口腔内杂物漱出。

然后用牙签的钝面刮取口腔颊部粘膜细胞，将其放人盛有3ml生理盐水的离心管中，轻轻摇动使细胞分散于生理盐水中。

2．离心收集细胞：以1600 r/min进行离心10min。

3．固定：离心结束后，轻轻将上清液除去。

留下的沉淀物用固定液固定10min。

4．离心：1500 r/min离心10min。

5．制备细胞悬液：去掉上清液，根据细胞沉淀的多少适量加人几滴新配制的固定液，用吸管吹打成细胞悬液。

6．滴片：用吸管将细胞悬液滴在载玻片上，在空气中干燥。

7.酸解：当固定液全部挥发后，滴加5M HCl ，处理10min，清水漂洗。

8．染色：在20.0g/L甲苯胺蓝染色液中染色30min。

染色结束后，用清水漂洗以去掉浮色，在空气中自然干燥。

9．镜检：在油镜下观察，按组判断男女。

10. 取女性装片，对100个细胞进行巴氏小体计数。

五. 观察结果
7人一组分辨男女，我拿到那张装片是男生的，比较干净，基本没有什么细菌，核内物质均匀，基本没看到巴氏小体。

后来拿了女生的进行观察，可以看到明显的巴氏小体，看到的巴氏小体一般在核膜旁，因为核膜旁的比较好确认，也有的巴氏小体是在核中的位置的，应该也是在核膜旁，由于制作装片时的空间关系看起来像在核内。

巴氏小体的形状基本是卵形和短棒形。

对100个细胞进行计数（横向、纵向移动载物台移动转轮），判断41个细胞含巴氏小体，概率为41%。

六．讨论
1. 怎样判断一个黑色小点是巴氏小体而不是干扰细菌？
在数巴氏小体时常常无法确认那是不是细菌，此时可以调动细准焦螺旋，一般巴氏小体形状不会变化，而细菌或其他杂质一般会有变化；另外，巴氏小体和核应该处于同一焦平面，这一点也有助于确认一个黑点是不是巴氏小体。

2. 医院的检验标准：正常女性（46，XX）的口腔粘膜细胞中，X染色质约15%左右，平均16.4%，不超过30～35%，仅含1个X染色质。

男性只有0～3%，平均0.7%。

怎么理解？和自己的结果为什么不同？
就算是女性，巴氏小体也不是每个细胞都能看到，因为观察角度不同，可能会被遮掩或者受细菌的干扰，也就是说，阴性细胞也是可能有巴氏小体的，“阴性”只表示在检测限制下无法看到。

男性也会有巴氏小体，因为男性细胞中的X染色体具有很低概率可进入异染色质状态，从而成为被观测到的“巴氏小体”，这类细胞通常是暂时活动减弱或进入休眠的细胞。

而此次观察的巴氏小体概率为41%，一是可能装片展开比较好，所以很多巴氏小体都看到了；也可能有的黑点被误当做巴氏小体参加了计数，因为这次计数本来就是一个很主观的过程，就算同一个细胞不同的人也会有不同的结论。

七. 思考题
1. 什么是剂量补偿效应？
答：XY型性别决定的生物，由X性染色体上的基因决定的性状在两性的表现几乎相同。

可以通过两种途径实现：一是X染色体的转录速率的差异，即雌性动物细胞中的两条X染色体的转录速率低于雄性细胞中单条X染色体的转录速率，因而造成雌性和雄性细胞的总体表达水平接近；二是雌性细胞中有一条X染色体在功能上是失活的。

2. Barr 小体分析技术在人类遗传学工作中有什么用途？
答：（1）Barr小体的临床意义在于鉴别性别。

例如，从胎儿羊水中取得脱落的细胞检查，如有巴氏小体，胎儿为女性，如果细胞中无巴氏小体，胎儿为男性。

（2）在优生学中，对于鉴别性别和预防性连锁疾病的发生有重要价值。

如：有助于Turner综合征之诊断，通常其X染色质为0%；若是45，X/46，XX嵌合体则仍可查到X 染色质，但数少，<15%。

反之，如是47，XXX、48，XXXX或49，XXXXX则可在同一核内见到2、3或4个X染色质，并且阳性率也大大超出15～30%，故有助于推断X染色体之数目，进而有助于相关遗传病之诊断。

3.在制片过程中使用HCl酸解的目的是什么？
答：杀死细菌，尽量减少细菌污染；使细胞结构软化，容易压平并观察。

4. 描绘所观察到的Barr 小体的形态特征和在细胞中的分布状况。

答：观察到的Barr小体为一小黑点，大多为圆形。

在细胞中分布于细胞核膜边缘。

5. 为什么Barr 小体一般出现在核膜边缘？
答：在细胞周期的S期中，异染色质比真染色质更晚进行复制，因为它螺旋化与其他染色体不同步，而至使被推挤到核膜边缘。

八．参考文献
1. 张贵友等《普通遗传学实验指导》清华大学出版社2003。