甘草颗粒中甘草酸含量HPLC测定方法的建立

动物医学进展，２０２０，４１（１２）：７４ ７９ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭ
ｅｄｉｃｉｎｅ甘草颗粒中甘草酸含量ＨＰＬＣ测定方法的建立
　收稿日期：
２０１９ ０４ １３　基金项目：
２０１８年农业行业（国家）标准项目兽药国家标准制修订计划（２０１８Ｚ０１８）　作者简介：李　军（１
９８２－），男，山西浑源人，副教授，硕士，主要从事中药制剂的开发及质量研究。

李　军１，杨　奇２，刘立轩１，李　敏２，冷晓红１，马春芳２，吴春燕２
（１．宁夏职业技术学院宁夏中药材开发与利用工程技术研究中心，宁夏银川７５００２１；
２．宁夏兽药饲料监察所，宁夏银川７５００１１
） 摘　要：为完善甘草颗粒的质量标准，以Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）柱为色谱柱，甲醇 ０．２ｍｏｌ／Ｌ醋酸铵 冰醋酸（５６∶４４∶０．４）为流动相，流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长为２５０ｎｍ，进样量为１０μＬ的色谱条件建立了
ＨＰＬＣ法测定甘草酸含量，并进行方法学验证。

结果表明，甘草酸色谱峰峰形良好，且与相邻峰良好分离；进样浓度在０．１ｍｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬ（０．１μｇ～０．５μｇ）
范围内，与峰面积呈良好的线性关系（狉＝０．９９９８）；精密度和稳定性等考察结果的相对标准偏差均小于２．０％；样品平均回收率为９７．９２％（ｎ＝６），ＲＳＤ为１．８７％。

建立的方
法可靠，
准确度高，重现性好，为完善甘草颗粒的含量测定方法提供了依据。

关键词：
甘草颗粒；甘草酸；高效液相色谱；含量测定中图分类号：Ｓ８５３．７２；Ｓ８５９．２
文献标识码：Ａ
文章编号：１００７ ５０３８（２０２０）１２ ００７４ ０６
甘草颗粒是由具有清热解毒、
祛痰止咳作用的甘草制成的兽用制剂［１
］，有良好的免疫调节、抑制病毒、
保肝、抗炎及镇咳作用，甘草酸作为其最重要的活性成分之一，其药理作用包括抗炎、抗溃疡、抗肝毒素以及抗癌等
［２］。

《中国兽药典》２０１５年版（第二部）中收载甘草颗粒为甘草浸膏经加工制成的颗粒，并收录了甘草颗粒的质量标准
［１］。

而部分兽药生产厂家、兽药监
察所在测定甘草颗粒中甘草酸含量过程中发现，现行标准中的方法检测结果会出现峰型不好、非单一峰等现象，方法重现性有待提高。

栾祖香等
［３］
利用
现行标准的色谱条件测定甘草颗粒中甘草酸含量，由于仪器和实验室等因素的改变，其色谱图中甘草酸色谱峰和相邻峰分离效果欠佳，
进一步说明现行标准的重现性有待提高。

为了更好地控制甘草颗粒的质量，需对其现行标准方法进行优化，而有关甘草
颗粒甘草酸含量测定的研究鲜见报道［４
］，目前关于
甘草酸含量测定的研究主要集中在以甘草浸膏及甘草为原料的制剂。

因此，本研究对甘草颗粒中甘草酸含量测定方法进行优化，提高含量测定标准的准确性，重现性，进一步建立稳定、可靠、科学的含量测定方法，为《中国兽药典》２０２０年版中甘草颗粒质量标准的修订提供依据。

１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　药品及试剂　甘草颗粒１９批，江西中成药业、郑州百瑞动物药业、广东温氏大华农生物科技有限公司等９家企业产品；
阴性样品缺甘草浸膏的甘草颗粒（批号２０１９０４２６００１）、甘草颗粒３批，宁夏中药材开发与利用工程技术研究中心自制产品。

对照品甘草酸铵，批号１１０７３１ ２０１７２０，纯度９７．７％，中国食品药品检定研究院产品；乙腈、甲醇（色谱纯），赛默飞世尔科技（
中国）有限公司产品；醋酸铵、醋酸（分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司产品；超纯水，ＭＩＬＬＩ Ｑ超纯水仪制备。

１．１．２　仪器设备　高效液相色谱仪（ＬＣ ２０ＡＴ）
、紫外检测器（ＳＰＤ ２０），日本岛津仪器有限公司产品；高效液相色谱仪（Ａｇｉｌｅｎｔ１２６０Ⅱ），美国安捷伦科技有限公司产品；电子天平（ＥＬ２０４、ＡＥ２４０），瑞士梅特勒 托利多仪器有限公司产品；超纯水仪（ＭＩＬＬＩ Ｑ），美国密理博有限公司产品；超声波清洗机（ＡＳ１０２００），天津奥特赛恩斯仪器有限公司产品；溶剂过滤系统（ＧＭ ０．３３Ａ），天津津腾实验设备有限公司产品。

１．２　方法１．２．１　高效液相色谱条件　色谱柱为Ｃ１８
（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ），以甲醇 ０．２ｍｏｌ／Ｌ醋酸铵 冰醋酸（５６∶４４∶０．４）为流动相；流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长为２５０ｎｍ；进样量为１０μＬ。

１．２．２　对照品溶液的制备　取甘草酸铵对照品１０ｍｇ，精密称定，置５０ｍＬ容量瓶中，加流动相４５ｍＬ超声处理使溶解，取出，放冷，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得（每１ｍＬ含甘草酸铵０．２ｍｇ，折合甘草酸为０．１９５９ｍｇ）。

１．２．３　供试品及阴性样品溶液的制备　取本品研细的粉末１．５ｇ，精密称定，置５０ｍＬ容量瓶中，用流动相约４５ｍＬ，超声处理（功率２００Ｗ，频率５０ｋＨｚ）３０ｍｉｎ，取出，放冷，加流动相稀释至刻度。

摇匀，滤过，精密量取续滤液１０ｍＬ，置２５ｍＬ量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

１．２．４　测定方法　分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各１０μＬ，注入液相色谱仪，测定，即得。

１．２．５　系统适应性考察　取供试品溶液进样前用０．２２μｍ的有机滤膜过滤，进样量为１０μＬ，记录色谱图。

分析甘草酸峰的分离度及其理论塔板数。

１．２．６　专属性试验　分别取对照品、阴性样品溶液和供试品溶液各１０μＬ，注入液相色谱仪，按１．２．１项下色谱条件分别进行测定。

１．２．７　线性关系试验　精密称定甘草酸铵对照品１０．０６ｍｇ于１０ｍＬ容量瓶中，加入流动相定容，制成１．００６ｍｇ／ｍＬ的对照品储备液。

分别精密量取该溶液０．５ｍＬ、１．０ｍＬ、１．５ｍＬ、２．０ｍＬ、２．５ｍＬ于５ｍＬ的容量瓶内，用流动相稀释至刻度，摇匀得０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ的甘草酸铵对照品溶液，分别按１．２．１项下色谱条件进样１０μＬ，测定峰面积。

以峰面积（ｍｖ）为纵坐标，对照品浓度（ｍｇ／ｍＬ）为横坐标作线性回归。

１．２．８　加样回收率试验　精密称定甘草酸铵对照品０．９８７４ｇ至１００ｍＬ容量瓶中，用流动相定容，作为储备液。

精密称定已知含量的甘草颗粒（２．２０％）样品０．７５ｇ，置于５０ｍＬ容量瓶中，加入上述甘草酸铵对照品储备液１５ｍＬ，加流动相适量溶解，超声３０ｍｉｎ，放冷，定容至刻度，摇匀，即得。

照１．２．３项下方法制备６份供试品溶液，按上述色谱条件进样１０μＬ，记录色谱图。

按外标法以峰面积计算回收率。

回收率＝（加对照品后测得的含量－加对照品前含量）／实际所加对照品量×１００％。

１．２．９　精密度　
（１）重复性试验：取同一批供试品甘草颗粒，按１．２．３项下方法制备供试品溶液６份，各取１０μＬ注
入色谱仪，在１．２．１项的色谱条件下测定。

（２）重现性试验：分别在宁夏兽药饲料监察所及宁夏中药材开发与利用工程技术研究中心两个实验室，由不同实验人员用不同的高效液相色谱仪对同一批供试品按照１．２．３项下方法制备供试品溶液各２份，分别取１０μＬ注入不同的色谱仪进行测定。

１．２．１０　稳定性试验　取同一批供试品溶液，分别放置０、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４ｈ后进样１０μＬ采集色谱图，考察峰面积变化情况。

１．２．１１　耐用性试验　取同一批供试品，改变柱温（２５℃，３０℃，３５℃）进行测定；改变流速（０．８ｍＬ／ｍｉｎ，１．０ｍＬ／ｍｉｎ，１．２ｍＬ／ｍｉｎ）进行测定；改变流动相比例（甲醇 ０．２ｍｏＬ／Ｌ醋酸铵 冰醋酸分别为５２∶４８∶０．４，５６∶４４∶０．４，５８∶４２∶０．４）进行测定；分别用ＡｇｉｌｅｎｔＺＯＲＢＡＸＸＤＢ Ｃ１８，Ｓｈｉ ｍａｄｚｕＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＣ１８，ＡｇｉｌｅｎｔＺＯＲＢＡＸＳＢ Ｃ１８共３种不同厂家型号的色谱柱进行测定。

１．２．１２　样品含量测定　按照上述方法，测定２２个不同厂家不同批次的样品，记录色谱峰面积，计算每批甘草颗粒中甘草酸含量。

２　结果
２．１　系统适应性与专属性试验
如图１Ｃ所示，甘草酸与相邻峰达到基线分离，
分离度达１．９９１，甘草酸保留时间为３１．５０６ｍｉｎ，理论板数为６４８５，峰面积为２１２３８９２。

试验证实，该方法系统适用性良好。

另外，供试品色谱图和对照品色谱图相应位置上出现相同的峰，阴性样品与对照品色谱峰相应位置无吸收峰。

空白颗粒对甘草酸和甘草颗粒的出峰均无干扰（图１），方法专属性良好。

２．２　线性关系试验
如图２所示，甘草酸峰面积与浓度线性方程为
狔＝９００００００狓－１０３１８８，犚２＝０．９９９８。

结果表明甘草酸铵在０．１ｍｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬ范围内，甘草酸峰面积与浓度线性关系良好。

２．３　加样回收率试验
回收率试验结果见表１，６份样品中甘草酸的平均回收率为９７．９２％，ＲＳＤ为１．８７％。

表明本方法用于甘草颗粒中甘草酸含量测定的准确度良好。

２．４　精密度
２．４．１　重复性试验　如表２所示，６次重复操作的供试品中甘草酸峰面积平均值为２１６１８２８，ＲＳＤ为１．１３％。

表明重复性良好。

５
７
李　军等：甘草颗粒中甘草酸含量ＨＰＬＣ测定方法的建立
Ａ．阴性样品；Ｂ．甘草酸铵对照品；Ｃ．
甘草颗粒Ａ．Ｎｅｇａｔｉｖｅｓａｍｐｌｅ；Ｂ．Ｓｔａｎｄａｒｄｏｆａｍｍｏｎｉｕｍｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎａｔｅ；Ｃ．犌犾狔犮狔
狉狉犺犻狕犪ｇｒａｎｕｌｅ图１　ＨＰＬＣ色谱图
Ｆｉｇ．１　ＨＰＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａ
ｍ图２　甘草酸标准曲线
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆｇｌｙｃｙ
ｒｒｈｉｚｉｃａｃｉｄ２．４．２　重现性试验　不同实验室不同实验人员用不同仪器测定相同批次供试品的平均值为２．１０％，ＲＳＤ为１．８０％，表明方法的重现性良好（表３）。

２．５　稳定性试验
如表４所示，供试品溶液２４ｈ内测定的甘草酸
峰面积平均值分别为２０９６８０７，ＲＳＤ为０．１８％。

表明供试品在２４ｈ内稳定性良好。

２．６　耐用性试验
方法耐用性试验结果见表５，同一供试品在改变柱温的条件下，ＲＳＤ为０．５０％；同一供试品在改变流速的条件下，ＲＳＤ为０．４８％；同一供试品改变流动相比例后，ＲＳＤ为０．２８％；同一供试品在更换不同色谱柱进行测定，ＲＳＤ为０．４８％。

供试品在柱
温、流速、流动相比例、色谱柱条件微小变动后，甘草酸色谱主峰分离较好，对测定结果无明显影响，表明方法的耐用性良好。

２．７　样品含量测定２２批甘草颗粒样品的测量结果见表６，２２批样品中甘草酸的含量均大于１．３０％，
符合规定。

６７动物医学进展　２０２０年　第４１卷　第１２期（总第３３０期）
表１　回收率试验结果
Ｔａｂｌｅ１　Ｔｈｅｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｒｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅ
样品Ｓａｍｐｌｅ取样量／ｍｇ
Ｓａｍｐｌｉｎｇ
ａｍｏｕｎｔ
加入量／ｍｇ
Ａｍｏｕｎｔ
ａｄｄｅｄ
实测量／ｍｇ
Ｍｅａｓｕｒｅｄ
ｖａｌｕｅ
回收率／％
Ｒｅｃｏｖｅｒｙ
ｒａｔｅ
平均回收率／％
Ａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｙ
ｒａｔｅ
ＲＳＤ／％
１１６．５０１４．４７３０．６８９７．９８
２１６．５０１４．４７３０．４８９６．６１
３１６．５０１４．４７３０．８３９９．０２
４１６．５０１４．４７３０．５９９７．３９
５１６．５０１４．４７３０．３５９５．６９
６１６．５０１４．４７３１．０９１００．８４
９７．９２１．８７
表２　重复性试验结果
Ｔａｂｌｅ２　Ｔｈｅｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ
序号ＳｅｒｉａｌＮｕｍｂｅｒ１２３４５６
峰面积Ｐｅａｋａｒｅａ２１６２１３１２１２３８９２２１９８０６８２１６１６７１２１５２４２０２１７２７８８平均值Ａｖｅｒａｇｅｐｅａｋａｒｅａ２１６１８２８
ＲＳＤ／％１．１３
表３　方法重现性结果
Ｔａｂｌｅ３　Ｔｈｅｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｍｅｔｈｏｄｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ
实验室Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
仪器
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
ｔｙｐｅ
色谱柱
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ
ｃｏｌｕｍｎ
实验人员
Ａｎａｌｙｓｔ
样品编号
Ｓａｍｐｌｅ
ｎｕｍｂｅｒ
甘草酸含量
Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃａｃｉｄ
ｃｏｎｔｅｎｔ（％）
宁夏中药材开发与利用工程技
术研究中心ＮｉｎｇｘｉａＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｆｏｒＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＵ ｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎｅｓｅＨｅｒｂｓＳｈｉｍａｄｚｕＬＣ ２０ＡＴＳｈｉｍａｄｚｕＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＣ１８甲Ａ
１
２
２．０９
２．１４
宁夏兽药饲料监察所Ｎｉｎｇｘｉａ
ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＤｒｕｇｓａｎｄＦｅｅｄＡｄ ｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎＡｇｉｌｅｎｔ１２６０ⅡＡｇｉｌｅｎｔＺＯＲＢＡＸＳＢ Ｃ１８乙Ｂ
１
２
２．１１
２．０５
含量平均值Ａｖｅｒａｇｅｃｏｎｔｅｎｔ２．１０ＲＳＤ％１．８０
表４　稳定性试验结果
Ｔａｂｌｅ４　Ｔｈｅｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｔａｂｉｌｉｔｙ
放置时间Ｔｉｍｅ（ｈ）
样品峰面积
Ｐｅａｋａｒｅａｏｆｓａｍｐｌｅ
０２１０４１６３
２２０９９７８２
４２０９８８４３
６２０９６６８５
８２０９７８２１
１０２０９９５１４
１２２０９９５９１
１４２０９４００１
１６２０９２４９１
１８２０９３３３７
２０２０９８１９６
２２２０９１７０３
２４２０９２３６３平均值Ａｖｅｒａｇｅｐｅａｋａｒｅａ２０９６８０７ＲＳＤ％０．１８３　讨论
按《中国兽药典》２０１５年版第二部中甘草颗粒含量测定方法色谱柱为Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ），以甲醇 ０．２ｍｏｌ／Ｌ醋酸铵 冰醋酸（６７∶３３∶１）为流动相，流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长为２５０ｎｍ，进样量为１０μＬ的色谱条件对甘草颗粒中甘草酸含量进行测定，其色谱图中甘草酸色谱峰和相邻峰分离效果欠佳，会出现峰型不好、非单一峰等现象，上述现象的原因主要与流动相有关，为了更准确地测定甘草酸的含量，提高方法的重现性，故需优化现行标准方法中色谱条件的流动相。

而甘草颗粒含量测定方法的研究报道较少，且甘草颗粒制剂的原料为甘草浸膏，故参阅以甘草浸膏或甘草为原料的制剂中甘草酸含量测定方法的色谱条件，其采用的流动相主要有乙腈 ２５ｍＬ／Ｌ醋酸（３５∶６５）［５］、乙腈 ０．５ｇ／Ｌ磷酸溶液（３５∶６５）［６］、甲醇 １ｍＬ／Ｌ磷酸溶液（７０∶３０）［７］、甲醇 ０．２ｍｏｌ／Ｌ醋酸铵溶液
７
７
李　军等：甘草颗粒中甘草酸含量ＨＰＬＣ测定方法的建立
（６５∶３５，醋酸调节ｐＨ至４．０）［８］、甲醇 ２０ｍＬ／Ｌ醋酸溶液（３０∶７０）［９］。

本研究预试验分别采用上述流动相测定甘草颗粒中甘草酸含量，发现其无法与供试品溶液中其他组分实现有效分离。

另外，考虑与甘草酸色谱峰相邻干扰峰物质的极性相对较强，故减少现行标准流动相中甲醇比例，使流动相的极性增强，使干扰峰物质出峰越早，越利于甘草酸色谱峰与相邻峰的分离，最终将流动相甲醇 ０．２ｍｏｌ／Ｌ醋酸铵 冰醋酸的比例由原来的６７∶３３∶１优化为５６∶４４∶０．４进行测定，甘草酸的峰形和对称性均较好，分离度较高。

表５　耐用性试验结果
Ｔａｂｌｅ５　Ｔｈｅｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｅｒｖｉｃｅａｂｉｌｉｔｙ
色谱条件
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
不同参数
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ
甘草酸含量／％
Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃａｃｉｄ
ｃｏｎｔｅｎｔ
平均值／％
Ａｖｅｒａｇｅ
ｃｏｎｔｅｎｔ
ＲＳＤ
不同柱温Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ２５℃１．９９１．９９１．９９
３０℃２．０１２．００２．０００．５０３５℃１．９８１．９９１．９８
不同流速Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｖｅｌｏｃｉｔｉｅｓ０．８ｍＬ／ｍｉｎ２．０６２．０７２．０６
１．０ｍＬ／ｍｉｎ２．０７２．０７２．０７０．４８１．２ｍＬ／ｍｉｎ２．０８２．０７２．０８
不同流动相比例Ｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｓ５８：４２：０．４２．０８２．０９２．０９
５６：４４：０．４２．０８２．０９２．０９０．２８５４：４６：０．４２．０８２．０８２．０８
不同色谱柱Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｌｕｍｎｓ
ＡｇｉｌｅｎｔＺＯＲＢＡＸＸＤＢ Ｃ１８２．１０２．１０２．１０
ＳｈｉｍａｄｚｕＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＣ１８２．０９２．０９２．０９０．４８ＡｇｉｌｅｎｔＺＯＲＢＡＸＳＢ Ｃ１８２．０９２．０８２．０８
表６　２２批样品含量测定结果
Ｔａｂｌｅ６　Ｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃａｃｉｄｃｏｎｔｅｎｔｓｉｎ２２ｂａｔｃｈｅｓｏｆｓａｍｐｌｅｓ
序号
Ｓｅｒｉａｌｎｕｍｂｅｒ
样品批号
Ｓａｍｐｌｅｌｏｔｎｕｍｂｅｒ
甘草酸含量／％Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃａｃｉｄｃｏｎｔｅｎｔ
１２
平均含量／％
Ａｖｅｒａｇｅｃｏｎｔｅｎｔ
１１８０５１００１１．３０３１．３３５１．３２２１８０２２７０２１．４３１１．４４２１．４３３１８０２０２０１１．４０１１．４１５１．４０４１８０３２６２７１．３３９１．３１６１．３３５１８０３２３０１１．３７６１．３０２１．３４６２０１８１００６０１１．７５７１．７９０１．７７７２０１８０９１５０１１．８２２１．８２７１．８２８２０１８０８０１０１１．７５３１．８４７１．８０９１８０９０１１．５４３１．３７９１．４６１０２０１８０８０４１．５４３１．３９７１．４７１１２０１８０６０４１．５０８１．４３２１．４７１２２０１８０６０５１．４４０１．５００１．４７１３２０１８１００４１．５７５１．３４５１．４６１４２０１８１００５１．４８５１．４３５１．４６１５２０１８１００６１．４３９１．４４２１．４４１６２０１８０９００１１．３７１１．３６８１．３７１７２０１８０９０１１．５７９１．５８２１．５８１８２０１８１００１１．５０１１．４８７１．４９１９２０１８１１０１１．５１７１．５４３１．５３２０２０１９０９５２００１２．０３９２．２０１２．１２２１２０１９０９５２００１１．９６９２．０１１１．９９２２２０１９０９５２００１１．９７５１．９８７１．９８
本研究通过优化现行标准中色谱条件，建立了新的甘草颗粒中甘草酸含量测定方法，并按《中国兽药典》２０１５年版及其附录《中兽药质量分析方法验证指导原则》有关规定，进行了一系列方法学考
８
７动物医学进展　２０２０年　第４１卷　第１２期（总第３３０期）
察［１０ １１］。

结果表明，方法的精密性、重复性、稳定性
良好，
色谱图中阴性对照均无干扰，专属性良好；重现性试验中，将同一批供试品分别在两个不同实验室由不同实验人员用不同仪器进行试验，ＲＳＤ为１．８％，
结果符合规定；方法的耐用性试验中主要考察了柱温、
流速、流动相比例和色谱柱等，结果显示上述条件微小变动，ＲＳＤ均在２％范围内，
不影响甘草酸含量的测定，方法的耐用性良好［１２］。

最后，由
于中药成分的复杂性，为了考察不同厂家产品对含量测定方法的影响，增加了样品检测数量，选择了９个不同厂家２２个批次的甘草颗粒进行方法验证，结果表明，所有样品均能达到很好的分离，峰形较好，方法重现性好。

本法对《中国兽药典》２０１５年版中甘草颗粒的含量测定标准进行了改进，优化了流动相的比例，其色谱图峰形和分离度均较好，结果准确。

对２２批次不同厂家产品的含量测定，进一步验证了方法的重现性，
从而解决了现有标准中出现的非单一峰及重现性不理想的问题。

因此，
本试验建立的甘草颗粒中甘草酸含量测定方法可靠、准确度高、重现性好，为甘草颗粒质量控制提供了技术支撑，也为《中国兽药典》２０２０年版的修订提供了依据。

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犺犻狀犲狊犲犎犲狉犫狊，犢犻狀犮犺狌犪狀，犖犻狀犵狓犻犪，７５００２１，犆犺犻狀犪；２．犖犻狀犵狓犻犪犞犲狋犲狉犻狀犪狉狔犇狉狌犵狊犪狀犱犉犲犲犱犃犱犿犻狀犻狊狋狉犪狋犻狅狀，犢犻狀犮犺狌犪狀，犖犻狀犵
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狉狉犺犻狕犪ｇｒａｎｕｌｅｓ，ｔｈｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗ：Ｃ１８ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）ｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｌｕｍｎ，ｍｅｔｈａｎｏｌ ０．２ｍｏｌ／Ｌａｍｍｏｎｉｕｍａｃｅｔａｔｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｇ
ｌａｃｉａｌａｃｅｔｉｃａｃｉｄ（５６∶４４∶０．４）ｗａｓａｓｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅ，ｔｈｅｆｌｏｗｒａｔｅｗａｓ１．０ｍＬ／ｍｉｎ，ｔｈｅｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｗａｓ２５０ｎｍ，ａｎｄｉｎｊｅｃｔｉｏｎｖｏｌｕｍｅｗａｓ１０μＬ．ＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃａｃｉｄｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｎｄｖｅｒｉｆｉｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｈｒｏｍａ ｔｏｇｒａｐｈｉｃｐｅａｋｓｈａｐｅｏｆｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃａｃｉｄｃｏｕｌｄｂｅｓｅｐａｒａｔｅｄｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ
．Ｔｈｅｒｅｗａｓａｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｐｅａｋａｒｅａｓａｎｄｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃａｃｉｄａｔｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ０．１ ０．５ｍｇ／ｍＬ（犚２＝０．９９９８）ｂｙＨＰＬＣ．Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎ（ＲＳＤ）ｏｆｐｒｅｃｉｓｉｏｎａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｗ
ｅｒｅｌｅｓｓｔｈａｎ２．０％．Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｙｗａｓ９７．９２％ｗｉｔｈＲＳＤ１．８７％（ｎ＝６）．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｒｅｌｉａｂｌｅ，ａｃｃｕｒａｔｅａｎｄｒｅｐｅａｔａｂｌｅ，ａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｄｂａｓｉｓｆｏｒｉｍｐｒｏｖｉｎｇ
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７李　军等：甘草颗粒中甘草酸含量ＨＰＬＣ测定方法的建立。